论文部分内容阅读
摘要：以活性追踪手段寻找滇重楼中抗肿瘤活性成分，发现螺甾烷型甾体皂苷是其主要活性部位，进一步采用色谱方法纯化得到10个化合物，经波谱分析分别鉴定为：偏诺皂苷元-3-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（1），薯蓣皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-β-D-葡萄吡喃糖苷（2），偏诺皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-β-D-葡萄吡喃糖苷（3），薯蓣皂苷元-3-O-α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）-β-D-葡萄吡喃糖苷（4），偏诺皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（5），薯蓣皂苷元-3-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（6），偏诺皂苷元-3-O-{α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]}-β-D-葡萄吡喃糖苷（7），偏诺皂苷元-3-O-α-L-木吡喃糖基（1→3）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（8），薯蓣皂苷元-3-O-{α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-α-L-鼠李吡喃糖基（1→4）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]}-β-D-葡萄吡喃糖苷（9），薯蓣皂苷元-3-O-α-L-葡萄吡喃糖基（1→3）-[α-L-鼠李吡喃糖基（1→2）]-β-D-葡萄吡喃糖苷（10）.化合物8为首次从该属植物中分离得到。
关键词：滇重楼；抗肿瘤活性；皂苷
中图分类号：R273文献标志码：A文章编号：1007-2349（2015）06-0091-05
【Abstract】 The track method was used to look for antitumor active ingredients of polyphylla growing in Yunnan. Spirostan steroidal saponins was found as the main active part. Chromatography was used to purify it to have obtained 10 compounds. After identified by spectral analysis， 10 compounds as follows， （1） partial promise saponins Yuan-3-O-β-D- glucopyranoside， （2） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （3） partial promise sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （4） diosgenin-3-O-α-L- mouse Lee pyranose group （1→2）-β-D- glucopyranoside， （5） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （6） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （7） partial Connaught sapogenin-3-O- {α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside， （8） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- wood pyranose group （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucose pyran glucoside， （9） diosgenin-3-O-{α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside，（10）diosgenin-3-O-α-L- grapes pyranosyl （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside. Compound 8 was first isolated from this genus.
【Key words】Yunnan polyphylla， antitumor activity， saponins
滇重楼[Paris polyphylla var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mezz]为百合科重楼属植物的干燥根茎，在我国有着悠久的药用历史，以蚤休之名首载于《神农本草经》，性微寒，味苦；有小毒。具有清热解毒、消肿散瘀、止血止痛之功效，在西南各省区种类和资源极为丰富[1]。民间用于治疗癌症的历史非常悠久，现代药理研究发现，重楼具有抗肿瘤、抑菌消炎、镇静、镇痛、止血等作用，其中甾体皂苷类是其主活性成分[2]。近年来，通过对滇重楼植物的化学成分分析，，已从中分离鉴定了 50 余种化合物，主要有C27甾体皂苷、C21 孕甾烷苷、甾醇及其苷、黄酮苷、β-蜕皮激素等，其中甾体皂苷44种，占总化合物的 80%以上，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元[2～6]。以往文献较多侧重于化学成分方面的研究，而与药理作用相结合以活性追踪手段寻找活性成分的抗癌活性研究极少，本实验采用此方法，明确了滇重楼中抗肿瘤活性成分为螺甾烷型甾体皂苷，并对其进行分离纯化，得到10个活性化合物。 1实验仪器与材料
1.1实验仪器与材料1D-NMR和2D-NMR由Bruker DRX-600及 AM-400核磁共振仪（Bruker BioSpin group，Germany）测定。以氘代吡啶（pyridine-d5）为溶剂，TMS为内标，化学位移δ用ppm表示，耦合常数J用Hz表示；ESI-MS由Agilent 6530B质谱仪（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA））测定。
HPLC分析在Agilent 1200型高效液相色谱仪（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA）上完成，分析柱为 Zorbax SB-C18（Agilent，4.6 × 250 mm）柱；中压液相色谱（MPLC）为 BUCHI Labortechnik AG CH-9230（Flawil Switzerland）。
柱色谱使用的材料包括 100-200、200-300目硅胶（青岛海洋化工厂）；ODS（YMC*Gel ODS-A，50 μm，YMC Co.，Ltd.，Japan）。TLC 采用G型和 GF254型预制硅胶板（青岛海洋化工厂）。TLC 显色剂为 10% H2SO4-EtOH溶液、茴香醛试剂（茴香醛/浓硫酸/乙醇=1：1：18，v/v）和Ehrlich 试剂，喷洒后适当加热显色。
1.2实验材料来源滇重楼根茎于2011年8月采自云南普洱糯扎渡，共 2.5 kg，由昆明理工大学生命科学与技术学院李海舟教授鉴定。样品标本现存放于昆明理工大学生命科学与技术学院中药化学与中药现代化实验室，编号为201108009。
2实验方法
2.1提取与分离滇重楼干燥根茎 2.5 kg，经粉碎后用70%甲醇/水提取3次，每次24 h。合并提取液，减压蒸馏至无甲醇味后，分别用氯仿和正丁醇进行萃取。氯仿部分量较少，放置。正丁醇部分（165 g）用Diaion HP-20 大孔树脂进行粗划段，用纯水及30%，60%，90%，100%甲醇/水，依次洗脱得到单糖、多酚、呋甾和螺甾四个部分（Fr.1-Fr.4）。Fr.4（45 g）经硅胶柱层析（氯仿/甲醇，20：1-1：1）及ODS-A反相柱层析（中压制备色谱，10%-100%甲醇/水，梯度洗脱）反复交替分离纯化得到化合物1（4.2 mg）、化合物2（2.1 mg）、化合物3（3.3 mg）、化合物4（7.6 mg）、化合物5（17.7 mg）、化合物6（4.1 mg）、化合物7（2.2 mg）、化合物8（1.5mg）、化合物9（17.1 mg）和化合物10（17.0 mg）。
2.2滇重楼各提取相及粗划段各部分抗肿瘤作用（1）取对数生长期的人宫颈癌HeLa 细胞，用含 10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基配制成 5×104/ mL 的细胞悬液，按每孔 100 μL 接种于 96 孔板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养 24 h。（2）经过24h培养后，用显微镜观察细胞生长状态，在细胞生长良好的情况下，分别将7个待测样品和对照品溶液加入96孔板中，每个浓度随机设置4个复孔，每孔加入量为1μL，阳性对照组为紫杉醇（10 μM/mL），每孔加入 100 μL培养基，再将96 孔板在37 ℃、5% CO2条件下培养72 h。（3）培养72 h后，小心吸去上清液，每孔加入以无血清培养液新鲜配制的 1 mg/ mL MTT 20 μL，37 ℃ 温育 4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，在 490nm 处测定吸光度（A）值。取4孔平均值，按公式：细胞增殖抑制率=[（1-加药细胞 A 值/对照细胞 A 值）×100%]，计算每个质量浓度下的细胞增殖抑制率。
3实验结果
3.1滇重楼各提取相及粗划段各部分抗肿瘤作用，见表1。
4结论
MTT法活性筛选（表1）提示滇重楼的甲醇提取物和其正丁醇萃取相对HeLa肿瘤细胞有较强的抑制作用，氯仿萃取相只在较高的浓度下有一定生物活性，且氯仿相量非常少，说明不是滇重楼的抗肿瘤活性部位。对表现出较强活性的正丁醇部分在经Diaion HP-20 粗划段得到的四部分，其中Fr.1 H2SO4-EtOH溶液显灰黑色，茴香醛试剂和Ehrlich 试剂均不显色，Molish呈阳性反应，综上推断Fr.1为糖类，可能提供细胞生长的物质，促进HeLa肿瘤细胞生长。Fr.2 FeCl3试剂显色，呈阳性，推测为多酚，对肿瘤细胞有较弱的抑制增殖活性。Fr.3茴香醛试剂和Ehrlich 试剂均显色，表明为呋喃甾烷类甾体皂苷，有一定抑制增殖活性。Fr.4茴香醛试剂显色，而Ehrlich 试剂不显色，故为螺甾烷型甾体皂苷，抑制HeLa肿瘤细胞增殖活性最高，是滇重楼抗肿瘤的主要活性部位，从中得到10个化合物，均为螺甾烷型甾体皂苷，其皂苷元只有薯蓣皂苷元和谝诺皂苷元两种，而3位糖链的构成不一样，包括单糖到4糖组成，其中化合物8 为首次从该植物中分离得到。本研究结果果较明确地阐述了滇重楼抗肿瘤的物质基础。
参考文献：
[1]汤海峰，赵越平，蒋永培.重楼属植物的研究概况[J].中草药，1998，29（12）：839-842.
[2]武珊珊，高文远，段宏泉，等.重楼化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2004，35（3）：344-347.
[3]陈昌祥，周俊.滇产植物皂素成分的研究 Ⅴ.滇重楼的甾体皂苷和β-蜕皮激素[J].云南植物研究，1981，3（1）：89-93.
[4]陈昌祥，周俊.滇重楼的两个新甾体皂苷元[J].云南植物研究，1992，14（1）：111-113.
[5]陈昌祥，周 俊.滇重楼地上部分的甾体皂苷[J].云南植物研究，1990，12（3）：323-329. [6]陈昌祥，张玉童，周俊.滇重楼地上部分的配糖体[J].云南植物研究，1995，17（4）：473-478.
[7]Nohara T，Miyahara K，Kawasaki T.Steroid saponins and sapogenins of underground parts of Trillium kamtschaticum II.Pennogenin-and kryptogenin 3-O-glycosides，and related compounds.Chem Pharm Bull，1975，23（4）：872-885.
[8]Bing F，Bai PM，Li PK，et al.The microbiological trasformation of steroidal saponins by Curvularia lunata[J].Tetrahedron，2005，61（49）：11758-11763.
[9]Miyamura M，Nakano K，Nohara T，et al.Steroid saponins from Paris polyphylla Sm.supplement[J].Chem Pharm Bull，1982，30（2）：712-718.
[10]Tsuneo N，Huang XL，Shu YZ，et al.Chronotropic effect of the methanolic extracts of the plants of the Paris species and steroidal glycosides isolated from P.Vietnamensis on spontaneous beating of myocardial cells[J].Planta Medica，1989，55（6）：501-505.
[11]陈昌祥，张玉童，周俊.滇产重楼皂素成分的研究Ⅵ，滇重楼皂苷（2）[J].云南植物研究，1983，5（1）：91-97.
[12]Kang L P，Ma B P.Polyhydroxylated Steroidal Glycosides from Paris polyphylla[J].Journal of Natural Products，2012，75（6），1201-1205.
[13]康利平，马百平.重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定[J].中国药物化学杂志，2005，15（1）：25-30.
（收稿日期：2015-04-10）
关键词：滇重楼；抗肿瘤活性；皂苷
中图分类号：R273文献标志码：A文章编号：1007-2349（2015）06-0091-05
【Abstract】 The track method was used to look for antitumor active ingredients of polyphylla growing in Yunnan. Spirostan steroidal saponins was found as the main active part. Chromatography was used to purify it to have obtained 10 compounds. After identified by spectral analysis， 10 compounds as follows， （1） partial promise saponins Yuan-3-O-β-D- glucopyranoside， （2） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （3） partial promise sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）-β-D- glucopyranoside， （4） diosgenin-3-O-α-L- mouse Lee pyranose group （1→2）-β-D- glucopyranoside， （5） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （6） diosgenin-3-O-α-L- arabinofuranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside， （7） partial Connaught sapogenin-3-O- {α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside， （8） partial Connaught sapogenin-3-O-α-L- wood pyranose group （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucose pyran glucoside， （9） diosgenin-3-O-{α-L- rhamnopyranosyl （1→4）-α-L- rhamnopyranosyl （1→4）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]}- β-D- glucopyranoside，（10）diosgenin-3-O-α-L- grapes pyranosyl （1→3）- [α-L- rhamnopyranosyl （1→2）]-β-D- glucopyranoside. Compound 8 was first isolated from this genus.
【Key words】Yunnan polyphylla， antitumor activity， saponins
滇重楼[Paris polyphylla var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mezz]为百合科重楼属植物的干燥根茎，在我国有着悠久的药用历史，以蚤休之名首载于《神农本草经》，性微寒，味苦；有小毒。具有清热解毒、消肿散瘀、止血止痛之功效，在西南各省区种类和资源极为丰富[1]。民间用于治疗癌症的历史非常悠久，现代药理研究发现，重楼具有抗肿瘤、抑菌消炎、镇静、镇痛、止血等作用，其中甾体皂苷类是其主活性成分[2]。近年来，通过对滇重楼植物的化学成分分析，，已从中分离鉴定了 50 余种化合物，主要有C27甾体皂苷、C21 孕甾烷苷、甾醇及其苷、黄酮苷、β-蜕皮激素等，其中甾体皂苷44种，占总化合物的 80%以上，其苷元主要为异螺甾烷醇类的薯蓣皂苷元和偏诺皂苷元[2～6]。以往文献较多侧重于化学成分方面的研究，而与药理作用相结合以活性追踪手段寻找活性成分的抗癌活性研究极少，本实验采用此方法，明确了滇重楼中抗肿瘤活性成分为螺甾烷型甾体皂苷，并对其进行分离纯化，得到10个活性化合物。 1实验仪器与材料
1.1实验仪器与材料1D-NMR和2D-NMR由Bruker DRX-600及 AM-400核磁共振仪（Bruker BioSpin group，Germany）测定。以氘代吡啶（pyridine-d5）为溶剂，TMS为内标，化学位移δ用ppm表示，耦合常数J用Hz表示；ESI-MS由Agilent 6530B质谱仪（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA））测定。
HPLC分析在Agilent 1200型高效液相色谱仪（Agilent Technologies Co.，Ltd.，USA）上完成，分析柱为 Zorbax SB-C18（Agilent，4.6 × 250 mm）柱；中压液相色谱（MPLC）为 BUCHI Labortechnik AG CH-9230（Flawil Switzerland）。
柱色谱使用的材料包括 100-200、200-300目硅胶（青岛海洋化工厂）；ODS（YMC*Gel ODS-A，50 μm，YMC Co.，Ltd.，Japan）。TLC 采用G型和 GF254型预制硅胶板（青岛海洋化工厂）。TLC 显色剂为 10% H2SO4-EtOH溶液、茴香醛试剂（茴香醛/浓硫酸/乙醇=1：1：18，v/v）和Ehrlich 试剂，喷洒后适当加热显色。
1.2实验材料来源滇重楼根茎于2011年8月采自云南普洱糯扎渡，共 2.5 kg，由昆明理工大学生命科学与技术学院李海舟教授鉴定。样品标本现存放于昆明理工大学生命科学与技术学院中药化学与中药现代化实验室，编号为201108009。
2实验方法
2.1提取与分离滇重楼干燥根茎 2.5 kg，经粉碎后用70%甲醇/水提取3次，每次24 h。合并提取液，减压蒸馏至无甲醇味后，分别用氯仿和正丁醇进行萃取。氯仿部分量较少，放置。正丁醇部分（165 g）用Diaion HP-20 大孔树脂进行粗划段，用纯水及30%，60%，90%，100%甲醇/水，依次洗脱得到单糖、多酚、呋甾和螺甾四个部分（Fr.1-Fr.4）。Fr.4（45 g）经硅胶柱层析（氯仿/甲醇，20：1-1：1）及ODS-A反相柱层析（中压制备色谱，10%-100%甲醇/水，梯度洗脱）反复交替分离纯化得到化合物1（4.2 mg）、化合物2（2.1 mg）、化合物3（3.3 mg）、化合物4（7.6 mg）、化合物5（17.7 mg）、化合物6（4.1 mg）、化合物7（2.2 mg）、化合物8（1.5mg）、化合物9（17.1 mg）和化合物10（17.0 mg）。
2.2滇重楼各提取相及粗划段各部分抗肿瘤作用（1）取对数生长期的人宫颈癌HeLa 细胞，用含 10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养基配制成 5×104/ mL 的细胞悬液，按每孔 100 μL 接种于 96 孔板中，在37 ℃、5% CO2条件下培养 24 h。（2）经过24h培养后，用显微镜观察细胞生长状态，在细胞生长良好的情况下，分别将7个待测样品和对照品溶液加入96孔板中，每个浓度随机设置4个复孔，每孔加入量为1μL，阳性对照组为紫杉醇（10 μM/mL），每孔加入 100 μL培养基，再将96 孔板在37 ℃、5% CO2条件下培养72 h。（3）培养72 h后，小心吸去上清液，每孔加入以无血清培养液新鲜配制的 1 mg/ mL MTT 20 μL，37 ℃ 温育 4 h，弃去上清液，每孔加入100 μL DMSO，在 490nm 处测定吸光度（A）值。取4孔平均值，按公式：细胞增殖抑制率=[（1-加药细胞 A 值/对照细胞 A 值）×100%]，计算每个质量浓度下的细胞增殖抑制率。
3实验结果
3.1滇重楼各提取相及粗划段各部分抗肿瘤作用，见表1。
4结论
MTT法活性筛选（表1）提示滇重楼的甲醇提取物和其正丁醇萃取相对HeLa肿瘤细胞有较强的抑制作用，氯仿萃取相只在较高的浓度下有一定生物活性，且氯仿相量非常少，说明不是滇重楼的抗肿瘤活性部位。对表现出较强活性的正丁醇部分在经Diaion HP-20 粗划段得到的四部分，其中Fr.1 H2SO4-EtOH溶液显灰黑色，茴香醛试剂和Ehrlich 试剂均不显色，Molish呈阳性反应，综上推断Fr.1为糖类，可能提供细胞生长的物质，促进HeLa肿瘤细胞生长。Fr.2 FeCl3试剂显色，呈阳性，推测为多酚，对肿瘤细胞有较弱的抑制增殖活性。Fr.3茴香醛试剂和Ehrlich 试剂均显色，表明为呋喃甾烷类甾体皂苷，有一定抑制增殖活性。Fr.4茴香醛试剂显色，而Ehrlich 试剂不显色，故为螺甾烷型甾体皂苷，抑制HeLa肿瘤细胞增殖活性最高，是滇重楼抗肿瘤的主要活性部位，从中得到10个化合物，均为螺甾烷型甾体皂苷，其皂苷元只有薯蓣皂苷元和谝诺皂苷元两种，而3位糖链的构成不一样，包括单糖到4糖组成，其中化合物8 为首次从该植物中分离得到。本研究结果果较明确地阐述了滇重楼抗肿瘤的物质基础。
参考文献：
[1]汤海峰，赵越平，蒋永培.重楼属植物的研究概况[J].中草药，1998，29（12）：839-842.
[2]武珊珊，高文远，段宏泉，等.重楼化学成分和药理作用研究进展[J].中草药，2004，35（3）：344-347.
[3]陈昌祥，周俊.滇产植物皂素成分的研究 Ⅴ.滇重楼的甾体皂苷和β-蜕皮激素[J].云南植物研究，1981，3（1）：89-93.
[4]陈昌祥，周俊.滇重楼的两个新甾体皂苷元[J].云南植物研究，1992，14（1）：111-113.
[5]陈昌祥，周 俊.滇重楼地上部分的甾体皂苷[J].云南植物研究，1990，12（3）：323-329. [6]陈昌祥，张玉童，周俊.滇重楼地上部分的配糖体[J].云南植物研究，1995，17（4）：473-478.
[7]Nohara T，Miyahara K，Kawasaki T.Steroid saponins and sapogenins of underground parts of Trillium kamtschaticum II.Pennogenin-and kryptogenin 3-O-glycosides，and related compounds.Chem Pharm Bull，1975，23（4）：872-885.
[8]Bing F，Bai PM，Li PK，et al.The microbiological trasformation of steroidal saponins by Curvularia lunata[J].Tetrahedron，2005，61（49）：11758-11763.
[9]Miyamura M，Nakano K，Nohara T，et al.Steroid saponins from Paris polyphylla Sm.supplement[J].Chem Pharm Bull，1982，30（2）：712-718.
[10]Tsuneo N，Huang XL，Shu YZ，et al.Chronotropic effect of the methanolic extracts of the plants of the Paris species and steroidal glycosides isolated from P.Vietnamensis on spontaneous beating of myocardial cells[J].Planta Medica，1989，55（6）：501-505.
[11]陈昌祥，张玉童，周俊.滇产重楼皂素成分的研究Ⅵ，滇重楼皂苷（2）[J].云南植物研究，1983，5（1）：91-97.
[12]Kang L P，Ma B P.Polyhydroxylated Steroidal Glycosides from Paris polyphylla[J].Journal of Natural Products，2012，75（6），1201-1205.
[13]康利平，马百平.重楼中甾体皂苷的分离与结构鉴定[J].中国药物化学杂志，2005，15（1）：25-30.
（收稿日期：2015-04-10）