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摘要：目的 优化川楝子总黄酮提取工艺。方法 以总黄酮提取率为响应值，考察料液比、提取时间、乙醇体积分数3个因素对川楝子总黄酮提取率的影响。在单因素试验的基础上，采用响应面法中的Box-Behnken模式对川楝子总黄酮的提取工艺参数进行优化分析。结果 川楝子总黄酮提取的最优工艺条件为料液比1∶35、提取时间3.0 h、乙醇体积分数70%。在此条件下总黄酮的提取率为0.587 3%。结论 实测值与响应面法回归模型高度拟合，使用该方法能合理优化川楝子总黄酮的提取工艺。
关键词：川楝子；总黄酮；响应面法；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.020
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0076-04
Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Toosendan Fructus by Response Surface Methodology TIAN Yong-zhi， WANG Ya-li， SUN Ru， ZHAO Jing， LIU Qun， WANG Chen-xiao， MA Yan， CAI Mei-chao （College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）
Abstract： Objective To optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus. Methods Three parameters that significantly affect the extraction rate of flavonoids， ratio of material to water， extraction time and ethanol concentration， were taken into consideration for extraction ratio of flavonoids from Toosendan Fructus. Based on the results of single-factor experiment， the extraction parameters of flavonoids from Toosendan Fructus were optimized by Box-Behnken of response surface methodology （RSM）. Results The optimum extraction conditions were as follow： material to water ratio was 1：35； extraction time should be 3 h； ethanol concentration was 70%. The extraction ratio was up to 0.587 3% in the optimum extraction conditions. Conclusion The actual value is highly matching the theoretically value of RSM model. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus.
Key words： Toosendan Fructus； flavonoids； response surface methodology； extraction process
川楝子为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的干燥果实，具有舒肝、行气止痛、驱虫作用，常用于治疗胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛等症[1]。主要产于四川、贵州、陕西、湖北、湖南等地。有报道表明，川楝子含有黄酮类化合物[2]，而天然植物中的黄酮类化合物具有极为广泛的生理活性。本试验采用响应面法优化川楝子总黄酮的提取工艺，为进一步开发川楝子药用资源提供参考。
1 仪器与试药
川楝子（购自四川，干燥，粉碎，过40目筛，备用），经马艳老师鉴定为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的果实。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200707），无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），蒸馏水。UV9100B型紫外可见光光度计（莱伯泰科），赛多利斯BT25S型分析天平等。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取干燥的芦丁对照品11 mg，精密称定，用适量70%乙醇，在超声波下使其溶解，冷却至室温，转至25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得0.44 g/L的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
将川楝子用石油醚回流脱脂2次，每次2 h，抽滤，将石油醚挥干，称取一定量脱脂后的川楝子，按一定料液比加一定浓度的乙醇，回流提取一定时间，滤渣重复提取1次，合并提取液，旋蒸乙醇至近干，用70%乙醇溶液转移至50 mL容量瓶，定容，抽滤，滤液旋干，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，备用。
2.3 标准曲线的绘制 精密量取“2.1”项下对照品溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL比色管中，各加70%乙醇溶液，使之成为5.0 mL，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，最后加70%乙醇溶液至10.0 mL，放置15 min显色。用分光光度计于510 nm波长分别测定吸光度[3]，经最小二乘法进行线性回归，分析得回归方程A=11.325C+0.000 3，r2=0.998，表明在0.017 6～0.061 8 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。
2.4 方法学考察
2.4.1 重复性试验 取同一批供试品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法显色，测定，并计算总黄酮提取率（Y）。Y=C×10÷V1×V÷1000 m×100%。式中：V1为吸取体积（mL），V为提取液体积（mL），m为川楝子样品质量（g），C为显色的总黄酮浓度（mg/mL）。结果RSD=1.89%。
2.4.2 稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“2.3”项下方法显色，分别在0、1、2、3、4 h，测定并计算总黄酮提取率，结果RSD=2.36%。
2.4.3 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液6份，分别加入已知量的对照品，按“2.3”项下方法显色，测定，并计算回收率，结果平均回收率为98.75%，RSD=2.85%。
2.5 单因素试验
2.5.1 料液比 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，用70%乙醇溶液回流提取2.0 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图1。可知，在乙醇体积分数、提取时间一定的条件下，料液比为1∶25～1∶35时提取率逐渐上升，在1∶35时达到最大值，随后出现下降趋势，故料液比以1∶35为宜。
2.5.2 乙醇体积分数 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25，分别用60%、65%、70%、75%、80%乙醇回流提取2.0 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图2。可知，在料液比和提取时间一定的条件下，随着乙醇体积分数的增加，川楝子总黄酮提取量先增后减，当乙醇体积分数70%时黄酮提取量最大，故最佳乙醇体积分数为70%。
2.5.3 提取时间的选择 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25、70%乙醇溶液回流提取时间分别为1.5、2、2.5、3、3.5 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图3。可知，在乙醇体积分数和料液比一定的条件下，提取率随提取时间的增加而增加，在提取时间为3.0 h时，川楝子总黄酮提取率最高，故提取时间以3.0 h为宜。2.6 响应面法优化试验
2.6.1 模型建立及显著性试验 在单因素试验的基础上，以液料比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）为自变量，以总黄酮提取率为响应值，通过Design Expert 8.0.3软件设计3因素3水平的二次回归分析，预测川楝子总黄酮提取的最佳工艺[4]。响应面分析因素与水平见表1，响应面分析设计及结果见表2，响应面回归模型的方差分析见表3。
采用响应面法分析试验结果，得到以总黄酮提取率为响应值的回归方程：总黄酮提取率=0.61+0.012A+7.712E-003B-6.312E-003C+0.014AB+0.013AC+2.075E-003BC-0.018A2-0.035B2-0.038C2。对二项式进行计算，得出川楝子总黄酮的最佳提取条件：料液比1∶37，乙醇体积分数70.95%，提取时间3.0 h。考虑到实际因素，提取条件为料液比1∶35、乙醇体积分数70%、提取时间3.0 h。
由方差分析可知，以总黄酮提取率为响应值时，模型P=0.029 99<0.05，表明该二次方程模型显著。而失拟项P=0.155 4表示失拟项不具显著性[5]。
2.6.2 响应曲面分析 利用Design Expert软件得到二次回归方程的等高线及响应面图（见图4～图6），根据二次模型得到的等高线及响应曲面可以评价试验因素之间的交互强度，以确定因素最佳提取范围。
由图4可知，当提取时间和乙醇体积分数保持不变时，提取率随料液比的增大而先缓慢增大后减小，这是因为当扩散达到平衡时，提取剂增量不会促进黄酮的提取，反而使之后的浓缩更为困难。等高线呈椭圆形说明料液比与乙醇体积分数交互作用明显。
由图5可知，当料液比和乙醇体积分数保持不变时，提取率随提取时间的增加先增后减。提取时间的延长则使大量水溶性物质溶出，提取液变黏稠而对黄酮产生吸附作用，导致黄酮不能快速扩散析出，在大约3 h时达到最大值，与单因素试验结果相同，等高线呈椭圆形说明料液比与提取时间交互作用明显。
由图6可知，当提取时间和料液比不变时，提取率随着乙醇体积分数的增大先增后减，由于乙醇体积分数较低时黄酮类物质溶解度较低，而蛋白质、糖类等易溶于水的物质会被提取出来，导致提取率降低，乙醇体积分数过高而产生较大渗透压，使黄酮溶解性降低。曲线平滑说明提取时间对得率影响较小，等高线呈圆形说明乙醇体积分数与提取时间交互作用不明显。
2.6.3 模型验证 通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺：乙醇体积分数70.95%，料液比1∶37，提取时间3.0 h，在此条件下的黄酮提取率为0.611 0%。
2.7 样品测定
精密量取待测液1.0 mL于10 mL比色管中按“2.3”项下方法显色，测定，根据线性回归方程计算得出总黄酮含量为0.587 3%，见表4。
3 讨论
本研究在单因素试验基础上，通过响应面法考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间对川楝子总黄酮提取率的影响，建立了川楝子总黄酮提取率的多元回归模型，模型拟合度良好。确定了黄酮最佳提取条件：料液比1∶35，乙醇体积分数70%，提取时间3.0 h。在此条件下，黄酮得率可达0.611%。单因素影响顺序为料液比>体积分数>提取时间。黄酮提取率的实际值与预测值相差仅0.023%，说明运用响应面法优化川楝子总黄酮提取工艺条件是有效的，具有实际应用价值，为川楝子总黄酮的提取提供了一定的参考。
响应面法虽然试验次数相对较多，但能把各影响因素与响应值之间的关系函数化，建立连续变量曲面模型，考察因素不局限于所限制的水平，比传统正交试验方法更直观、更精确。因此，该优化提取方法可在川楝子黄酮提取工艺研究及生产中推广应用。
参考文献：
[1] 江苏新医学院.中药大辞典（上）[M].上海：上海科学技术出版社，1993：232-233.
[2] 李繁.中药川楝子的研究进展[J].哈尔滨医药，2008，28（5）：54-55.
[3] 朱金霞.超声波法优选苦豆子中总黄酮的提取工艺研究[J].中国野生植物资源，2010，29（5）：35-38.
[4] 龚文琼，刘睿.响应面法优化微波辅助提取普洱茶中茶色素工艺研究[J].食品科学，2010，31（8）：137-142.
[5] 杨文鸽，谢果凰，颜伟华，等.响应面分析法优化海鳗的湿腌工艺[J].中国食品学报，2010，10（1）：133-139.
（收稿日期：2015-05-14）
（修回日期：2015-06-10；编辑：陈静）
关键词：川楝子；总黄酮；响应面法；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.04.020
中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）04-0076-04
Optimization of Extraction Process of Flavonoids from Toosendan Fructus by Response Surface Methodology TIAN Yong-zhi， WANG Ya-li， SUN Ru， ZHAO Jing， LIU Qun， WANG Chen-xiao， MA Yan， CAI Mei-chao （College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）
Abstract： Objective To optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus. Methods Three parameters that significantly affect the extraction rate of flavonoids， ratio of material to water， extraction time and ethanol concentration， were taken into consideration for extraction ratio of flavonoids from Toosendan Fructus. Based on the results of single-factor experiment， the extraction parameters of flavonoids from Toosendan Fructus were optimized by Box-Behnken of response surface methodology （RSM）. Results The optimum extraction conditions were as follow： material to water ratio was 1：35； extraction time should be 3 h； ethanol concentration was 70%. The extraction ratio was up to 0.587 3% in the optimum extraction conditions. Conclusion The actual value is highly matching the theoretically value of RSM model. The results indicated that this method can rationally optimize extraction process of flavonoids from Toosendan Fructus.
Key words： Toosendan Fructus； flavonoids； response surface methodology； extraction process
川楝子为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的干燥果实，具有舒肝、行气止痛、驱虫作用，常用于治疗胸胁、脘腹胀痛、疝痛、虫积腹痛等症[1]。主要产于四川、贵州、陕西、湖北、湖南等地。有报道表明，川楝子含有黄酮类化合物[2]，而天然植物中的黄酮类化合物具有极为广泛的生理活性。本试验采用响应面法优化川楝子总黄酮的提取工艺，为进一步开发川楝子药用资源提供参考。
1 仪器与试药
川楝子（购自四川，干燥，粉碎，过40目筛，备用），经马艳老师鉴定为楝科植物川楝Melia toosendan Sieb. et Zucc的果实。芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，批号10080-200707），无水乙醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均为分析纯（天津市科密欧化学试剂有限公司），蒸馏水。UV9100B型紫外可见光光度计（莱伯泰科），赛多利斯BT25S型分析天平等。
2 方法与结果
2.1 对照品溶液的制备
取干燥的芦丁对照品11 mg，精密称定，用适量70%乙醇，在超声波下使其溶解，冷却至室温，转至25 mL容量瓶中，用70%乙醇定容，即得0.44 g/L的对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
将川楝子用石油醚回流脱脂2次，每次2 h，抽滤，将石油醚挥干，称取一定量脱脂后的川楝子，按一定料液比加一定浓度的乙醇，回流提取一定时间，滤渣重复提取1次，合并提取液，旋蒸乙醇至近干，用70%乙醇溶液转移至50 mL容量瓶，定容，抽滤，滤液旋干，用70%乙醇定容至50 mL容量瓶中，备用。
2.3 标准曲线的绘制 精密量取“2.1”项下对照品溶液0.5、0.7、1.0、1.2、1.5 mL于10 mL比色管中，各加70%乙醇溶液，使之成为5.0 mL，先加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min，再加4%NaOH溶液4.0 mL，最后加70%乙醇溶液至10.0 mL，放置15 min显色。用分光光度计于510 nm波长分别测定吸光度[3]，经最小二乘法进行线性回归，分析得回归方程A=11.325C+0.000 3，r2=0.998，表明在0.017 6～0.061 8 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。
2.4 方法学考察
2.4.1 重复性试验 取同一批供试品6份，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下方法显色，测定，并计算总黄酮提取率（Y）。Y=C×10÷V1×V÷1000 m×100%。式中：V1为吸取体积（mL），V为提取液体积（mL），m为川楝子样品质量（g），C为显色的总黄酮浓度（mg/mL）。结果RSD=1.89%。
2.4.2 稳定性试验 取同一批供试品溶液，按“2.3”项下方法显色，分别在0、1、2、3、4 h，测定并计算总黄酮提取率，结果RSD=2.36%。
2.4.3 加样回收率试验 取已知含量的供试品溶液6份，分别加入已知量的对照品，按“2.3”项下方法显色，测定，并计算回收率，结果平均回收率为98.75%，RSD=2.85%。
2.5 单因素试验
2.5.1 料液比 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45，用70%乙醇溶液回流提取2.0 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图1。可知，在乙醇体积分数、提取时间一定的条件下，料液比为1∶25～1∶35时提取率逐渐上升，在1∶35时达到最大值，随后出现下降趋势，故料液比以1∶35为宜。
2.5.2 乙醇体积分数 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25，分别用60%、65%、70%、75%、80%乙醇回流提取2.0 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图2。可知，在料液比和提取时间一定的条件下，随着乙醇体积分数的增加，川楝子总黄酮提取量先增后减，当乙醇体积分数70%时黄酮提取量最大，故最佳乙醇体积分数为70%。
2.5.3 提取时间的选择 取5.0 g脱脂后的川楝子5份，精密称定，按料液比1∶25、70%乙醇溶液回流提取时间分别为1.5、2、2.5、3、3.5 h，按“2.2”项下方法提取定容后，按“2.3”项下方法显色测定吸光度并计算提取率，结果见图3。可知，在乙醇体积分数和料液比一定的条件下，提取率随提取时间的增加而增加，在提取时间为3.0 h时，川楝子总黄酮提取率最高，故提取时间以3.0 h为宜。2.6 响应面法优化试验
2.6.1 模型建立及显著性试验 在单因素试验的基础上，以液料比（A）、乙醇体积分数（B）、提取时间（C）为自变量，以总黄酮提取率为响应值，通过Design Expert 8.0.3软件设计3因素3水平的二次回归分析，预测川楝子总黄酮提取的最佳工艺[4]。响应面分析因素与水平见表1，响应面分析设计及结果见表2，响应面回归模型的方差分析见表3。
采用响应面法分析试验结果，得到以总黄酮提取率为响应值的回归方程：总黄酮提取率=0.61+0.012A+7.712E-003B-6.312E-003C+0.014AB+0.013AC+2.075E-003BC-0.018A2-0.035B2-0.038C2。对二项式进行计算，得出川楝子总黄酮的最佳提取条件：料液比1∶37，乙醇体积分数70.95%，提取时间3.0 h。考虑到实际因素，提取条件为料液比1∶35、乙醇体积分数70%、提取时间3.0 h。
由方差分析可知，以总黄酮提取率为响应值时，模型P=0.029 99<0.05，表明该二次方程模型显著。而失拟项P=0.155 4表示失拟项不具显著性[5]。
2.6.2 响应曲面分析 利用Design Expert软件得到二次回归方程的等高线及响应面图（见图4～图6），根据二次模型得到的等高线及响应曲面可以评价试验因素之间的交互强度，以确定因素最佳提取范围。
由图4可知，当提取时间和乙醇体积分数保持不变时，提取率随料液比的增大而先缓慢增大后减小，这是因为当扩散达到平衡时，提取剂增量不会促进黄酮的提取，反而使之后的浓缩更为困难。等高线呈椭圆形说明料液比与乙醇体积分数交互作用明显。
由图5可知，当料液比和乙醇体积分数保持不变时，提取率随提取时间的增加先增后减。提取时间的延长则使大量水溶性物质溶出，提取液变黏稠而对黄酮产生吸附作用，导致黄酮不能快速扩散析出，在大约3 h时达到最大值，与单因素试验结果相同，等高线呈椭圆形说明料液比与提取时间交互作用明显。
由图6可知，当提取时间和料液比不变时，提取率随着乙醇体积分数的增大先增后减，由于乙醇体积分数较低时黄酮类物质溶解度较低，而蛋白质、糖类等易溶于水的物质会被提取出来，导致提取率降低，乙醇体积分数过高而产生较大渗透压，使黄酮溶解性降低。曲线平滑说明提取时间对得率影响较小，等高线呈圆形说明乙醇体积分数与提取时间交互作用不明显。
2.6.3 模型验证 通过软件分析计算得出理论最佳提取工艺：乙醇体积分数70.95%，料液比1∶37，提取时间3.0 h，在此条件下的黄酮提取率为0.611 0%。
2.7 样品测定
精密量取待测液1.0 mL于10 mL比色管中按“2.3”项下方法显色，测定，根据线性回归方程计算得出总黄酮含量为0.587 3%，见表4。
3 讨论
本研究在单因素试验基础上，通过响应面法考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间对川楝子总黄酮提取率的影响，建立了川楝子总黄酮提取率的多元回归模型，模型拟合度良好。确定了黄酮最佳提取条件：料液比1∶35，乙醇体积分数70%，提取时间3.0 h。在此条件下，黄酮得率可达0.611%。单因素影响顺序为料液比>体积分数>提取时间。黄酮提取率的实际值与预测值相差仅0.023%，说明运用响应面法优化川楝子总黄酮提取工艺条件是有效的，具有实际应用价值，为川楝子总黄酮的提取提供了一定的参考。
响应面法虽然试验次数相对较多，但能把各影响因素与响应值之间的关系函数化，建立连续变量曲面模型，考察因素不局限于所限制的水平，比传统正交试验方法更直观、更精确。因此，该优化提取方法可在川楝子黄酮提取工艺研究及生产中推广应用。
参考文献：
[1] 江苏新医学院.中药大辞典（上）[M].上海：上海科学技术出版社，1993：232-233.
[2] 李繁.中药川楝子的研究进展[J].哈尔滨医药，2008，28（5）：54-55.
[3] 朱金霞.超声波法优选苦豆子中总黄酮的提取工艺研究[J].中国野生植物资源，2010，29（5）：35-38.
[4] 龚文琼，刘睿.响应面法优化微波辅助提取普洱茶中茶色素工艺研究[J].食品科学，2010，31（8）：137-142.
[5] 杨文鸽，谢果凰，颜伟华，等.响应面分析法优化海鳗的湿腌工艺[J].中国食品学报，2010，10（1）：133-139.
（收稿日期：2015-05-14）
（修回日期：2015-06-10；编辑：陈静）