【摘 要】
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目的构建人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控癌基因c-Myc表达的慢病毒载体(pEMIR),并探讨其体外功能。方法以pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,经PCR扩增、酶切
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目的构建人B淋巴细胞特异性启动子Eμ-VH调控癌基因c-Myc表达的慢病毒载体(pEMIR),并探讨其体外功能。方法以pLV-c-Myc-IRES-增强绿色荧光蛋白(EGFP)为模板,经PCR扩增、酶切后得到pEVCHR;以pEVCHR为模板,PCR扩增、酶切后得到慢病毒载体pEMIR,并行测序和酶切鉴定。将pEMIR分别瞬时转染入人源胚胎肾细胞293T、人弥漫大B细胞淋巴瘤细胞株(OCL-Ly3、OCL-Ly10),倒置荧光显微镜检测各细胞EGFP和单体红色荧光蛋白(mRFP)的表达,用qRT-PCR法检测细胞内c-Myc mRNA表达,用Western blotting法检测293T细胞c-Myc蛋白表达。结果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段电泳结果与预测值4 129 bp相符,Vector DNA电泳可见一条带与预测值8 561 bp相符;pEMIR酶切并电泳的结果与理论预测值相符;对pEMIR质粒进行测序,结果与预期相符,证明pEMIR构建成功。三种细胞经pEMIR转染后,倒置荧光显微镜下可见绿色和红色荧光,同时转基因c-Myc表达正常。结论成功构建Eμ-VH启动子调控c-Myc表达的慢病毒载体,体外实验证明该载体能够在人正常细胞和肿瘤细胞中均可发挥功能。
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