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【摘要】目的：建立升红颗粒的质量控制标准。方法：采用薄层色谱法（TLC）对制剂中鸡血藤、花生红衣进行定性鉴别；采用高效液相色谱法（HPLC）对制剂中儿茶素进行含量测定。色谱柱：SEPAX Amethyst C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；流速：0.8ml/min；检测波长：280nm；柱温：35℃。结果：TLC谱斑点清晰，分离度良好，阴性对照无干扰。儿茶素进样量在0.0982～3.9269μg范围内与其峰面积积分值呈良好的线性关系（r=0.9999）；平均加样回收率为92.32%，RSD=2.72%（n=6）。结论：该方法简便、快捷、重现性好，可用于升红颗粒的质量控制。
【关键词】升红颗粒；质量标准；薄层色谱法；儿茶素；高效液相色谱法
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）03-0014-03
升红颗粒是根据我院肿瘤科临床验方开发的纯中药复方制剂，由鸡血藤、花生红衣、大枣、枸杞子4味药材制成，具有活血补血、健脾养血、滋补肝肾的功效，临床用于治疗肿瘤患者化疗所致的血小板、白细胞减少等症。研究证实，方中的鸡血藤[1]、花生红衣[2]均含有刺激造血祖细胞增殖的儿茶素类成分，且鸡血藤的黄酮类成分还具有促进血虚动物模型造血功能[3]。研究采用薄层色谱法对制剂中的鸡血藤、花生红衣进行鉴别，采用HPLC法对制剂中儿茶素进行含量测定，取得了满意的效果。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent HP1100系列高效液相色谱仪（包括Agilent G1310A单元泵、Agilent G1316A柱温箱、Agilent G1314A可变波长检测器，美国Agilent公司） ；威玛色谱工作站；B2500S-MT型超声波清洗器 （必能信超声上海有限公司）；FA2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；
1.2 材料 升红颗粒（批号： 141010、141018、141027，自制）；儿茶素对照品（批号：110877-201203）、芒柄花素对照品（批号：111703-200603）、鸡血藤对照药材（批号：121173-201103）、花生红衣对照药材（批号：121491-200401）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；高效硅胶G薄层板（10cm×10cm，青岛海洋化工厂）。
2 方法与结果
2.1 TLC鉴别
2.1.1 鸡血藤的TLC鉴别[4-5] 取本品3.0g，加二氯甲烷25ml，浸泡30min后，超声 （功率：100W；频率：40kHz）处理 20min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg芒柄花素的溶液，作为芒柄花素对照品溶液。另取鸡血藤对照药材2.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成鸡血藤对照药材溶液。按处方量称取不含鸡血藤的其他饮片各适量，照升红颗粒的制备方法，制成缺鸡血藤阴性样品，取缺鸡血藤阴性样品3.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成缺鸡血藤的阴性样品溶液。按照2010年版 《中国药典》（一部） 附录VIB的薄层色谱（TLC）法试验，吸取上述4 种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇（5∶15∶1） 为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm 紫外光灯下检视。结果供试品色谱中在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无相应的斑点。见图1。[JP]
2.1.2 花生红衣的TLC鉴别[6] 取本品3.0g，加乙酸乙酯25ml，浸泡30min后，超声 （功率：100W，频率：40kHz） 处理20min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取花生红衣对照药材2.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成花生红衣对照药材溶液。按处方量称取不含花生红衣的其他饮片各适量，照升红颗粒的制备方法，制成缺花生红衣阴性样品，取缺花生红衣阴性样品3.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成缺花生红衣阴性样品溶液。按照2010年版 《中国药典》（一部） 附录VIB的薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，放冷，置日光下检视。结果供试品色谱中， 在与花生红衣对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点，阴性对照液色谱无相应的斑点。见图2。
2.2 含量测定[7]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：SEPAX Amethyst C18 （250mm×4.6mm，5μm）；流动相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；流速：0.8ml/min；检测波长：280nm；柱温：35℃；进样量：20μl。
2.2.2 对照品溶液的制备 取儿茶素对照品适量，精密称定，置于量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.9817mg的溶液，即得。[JP]
2.2.3 供试品溶液的制备 取样品研细，精密称定约1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定质量，浸泡30min后，超声（功率：100W，频率：40kHz）处理20min，放冷，再次精密称定，加50% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备 取缺鸡血藤和花生红衣的阴性样品适量，按“2.2.3”项下方法制成阴性样品溶液，即得。[JP]
2.2.5 系统适用性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20μl，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，色谱峰基线平稳，供试品溶液中儿茶素与其它组分分离度良好，阴性无干扰；理论塔板数按儿茶素峰计算应不低于4000，分离度>1.5，拖尾因子：0.96。色谱见图3。 2.2.6 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下的儿茶素对照品溶液适量，加甲醇依次稀释成质量浓度分别为0.0049、0.0098、0.0196、0.0491、0.0982、0.1963mg/ml的溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量 （x，μg） 为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=666049x-23116（r=0.9999）。结果表明，儿茶素的进样量在0.0982～3.9269μg范围内与其峰面积的积分值呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度实验 精密吸取“2.2.6”项下质量浓度为0.0491mg/ml的儿茶素对照品溶液20μl，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，儿茶素峰面积的RSD为0.98%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液适量，分别于制备0、1、2、4、6、8h时，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，儿茶素峰面积的RSD为2.46%，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。
2.2.9 重复性实验 取同一批次（批号：141010）升红颗粒1g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算峰面积，并计算样品含量。结果，儿茶素的平均含量为0.9255mg/g，RSD为1.13%，表明本方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率实验 精密称取已知儿茶素含量（0.9255mg/g）的升红颗粒（批号： 141010） 1.0g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入儿茶素对照品溶液（1.0012mg/ml）0.9ml，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定， 记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。
2.2.11 样品含量测定 取3批样品各适量，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 花生红衣的薄层色谱鉴别 考察花生红衣的薄层色谱鉴别方法时，参照文献[6]的方法，但该方法制备供试品须经水煎煮提取、酸化及乙酸乙酯萃取等操作过程，比较繁琐费时，因此直接用乙酸乙酯进行超声提取，实践证明改进后的方法不仅操作简便，而且斑点清晰，分离效果同样比较理想。另外，原方法采用的展开剂为甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1），考虑到甲苯毒性较大，对环境和实验人员健康的影响较大，因此尝试用极性相似的溶剂系统进行替代。实验考查了二氯甲烷-甲醇-乙酸（8∶1∶1.5、5∶1∶1、3∶1∶1）及二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2、8∶6∶1∶2.5）等系统，结果以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2）的展开效果比较理想，斑点清晰，Rf值适中。
3.2 HPLC法测定儿茶素含量 HPLC法测定升红颗粒中儿茶素含量的色谱条件借鉴了本课题的前期研究中摸索出的HPLC法测定花生红衣中儿茶素含量的色谱条件[8]，经验证，该条件同样适合升红颗粒中儿茶素含量的测定，分离度、脱尾因子均符合要求。
在研究供试品的制备条件时，提取溶剂分别考察了水、乙醇、50%甲醇、50%乙醇等溶剂的提取效果，提取方法考察了回流提取（1、1.5、2h）及超声提取（20、30min）。结果以先用50%甲醇浸泡30min后，再超声提取20min的方法比较好，操作简便且儿茶素提取比较完全。
3.3 由于本制剂制备的批次较少，随着投料量的变化和制备工艺的改进，儿茶素的含量仍不稳定，需稳定工艺后进一步积累数据，以确定儿茶素的含量限度，才能用于本制剂的质量控制。
参考文献
[1]刘屏，王东晓，陈桂芸，等. 鸡血藤单体化合物对造血祖细胞增殖的调控作用研究[J]. 中国药理学通报，2007（236）： 741-745.
[2]张秀尧，凌罗庆，戴荣兴.花生衣的化学成分研究[J].中国中药杂志，1990，15（6）：36-39.
[3]梁宁，韦松基，林启云.鸡血藤总黄酮对血虚小鼠抗贫血作用及机理研究[J]. 时珍国医国药，2009，20（2）：362-363.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：180.
[5]韦娟. 鸡血藤薄层鉴别方法改进[J].中国现代药物应用，2009，3（7）：170.
[6]吴静，孙莉，汪剑飞，等. 花生红衣的质量研究及控制[J]. 现代中药研究与实践，2014，28（3）：70-73.
[7]贾智若，李兵，李耀华，等.反相高效液相色谱法测定杜仲中儿茶素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：117-119.
[8]蒋文玉，李江，邓俊刚，等. 高效液相色谱法测定花生红衣中儿茶素的含量[J].华夏医学，2014，27（6）：11-13.
（收稿日期：2015.12.20）
【关键词】升红颗粒；质量标准；薄层色谱法；儿茶素；高效液相色谱法
【中图分类号】R286 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）03-0014-03
升红颗粒是根据我院肿瘤科临床验方开发的纯中药复方制剂，由鸡血藤、花生红衣、大枣、枸杞子4味药材制成，具有活血补血、健脾养血、滋补肝肾的功效，临床用于治疗肿瘤患者化疗所致的血小板、白细胞减少等症。研究证实，方中的鸡血藤[1]、花生红衣[2]均含有刺激造血祖细胞增殖的儿茶素类成分，且鸡血藤的黄酮类成分还具有促进血虚动物模型造血功能[3]。研究采用薄层色谱法对制剂中的鸡血藤、花生红衣进行鉴别，采用HPLC法对制剂中儿茶素进行含量测定，取得了满意的效果。
1 仪器与试药
1.1 仪器 Agilent HP1100系列高效液相色谱仪（包括Agilent G1310A单元泵、Agilent G1316A柱温箱、Agilent G1314A可变波长检测器，美国Agilent公司） ；威玛色谱工作站；B2500S-MT型超声波清洗器 （必能信超声上海有限公司）；FA2004电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；
1.2 材料 升红颗粒（批号： 141010、141018、141027，自制）；儿茶素对照品（批号：110877-201203）、芒柄花素对照品（批号：111703-200603）、鸡血藤对照药材（批号：121173-201103）、花生红衣对照药材（批号：121491-200401）均由中国食品药品检定研究院提供；甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯；高效硅胶G薄层板（10cm×10cm，青岛海洋化工厂）。
2 方法与结果
2.1 TLC鉴别
2.1.1 鸡血藤的TLC鉴别[4-5] 取本品3.0g，加二氯甲烷25ml，浸泡30min后，超声 （功率：100W；频率：40kHz）处理 20min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取芒柄花素对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.5mg芒柄花素的溶液，作为芒柄花素对照品溶液。另取鸡血藤对照药材2.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成鸡血藤对照药材溶液。按处方量称取不含鸡血藤的其他饮片各适量，照升红颗粒的制备方法，制成缺鸡血藤阴性样品，取缺鸡血藤阴性样品3.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成缺鸡血藤的阴性样品溶液。按照2010年版 《中国药典》（一部） 附录VIB的薄层色谱（TLC）法试验，吸取上述4 种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇（5∶15∶1） 为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm 紫外光灯下检视。结果供试品色谱中在与对照品色谱及对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照色谱无相应的斑点。见图1。[JP]
2.1.2 花生红衣的TLC鉴别[6] 取本品3.0g，加乙酸乙酯25ml，浸泡30min后，超声 （功率：100W，频率：40kHz） 处理20min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加甲醇5ml使溶解，摇匀，作为供试品溶液。另取花生红衣对照药材2.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成花生红衣对照药材溶液。按处方量称取不含花生红衣的其他饮片各适量，照升红颗粒的制备方法，制成缺花生红衣阴性样品，取缺花生红衣阴性样品3.0g，照上述供试品溶液的制备方法制成缺花生红衣阴性样品溶液。按照2010年版 《中国药典》（一部） 附录VIB的薄层色谱法试验，吸取上述3 种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2） 为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%香草醛硫酸乙醇溶液，于105℃加热至斑点显色清晰，放冷，置日光下检视。结果供试品色谱中， 在与花生红衣对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的紫红色斑点，阴性对照液色谱无相应的斑点。见图2。
2.2 含量测定[7]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：SEPAX Amethyst C18 （250mm×4.6mm，5μm）；流动相：水-甲醇-乙腈-冰醋酸（90∶5∶5∶0.4）；流速：0.8ml/min；检测波长：280nm；柱温：35℃；进样量：20μl。
2.2.2 对照品溶液的制备 取儿茶素对照品适量，精密称定，置于量瓶中，加甲醇制成每1ml含0.9817mg的溶液，即得。[JP]
2.2.3 供试品溶液的制备 取样品研细，精密称定约1g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25ml，称定质量，浸泡30min后，超声（功率：100W，频率：40kHz）处理20min，放冷，再次精密称定，加50% 甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 阴性样品溶液的制备 取缺鸡血藤和花生红衣的阴性样品适量，按“2.2.3”项下方法制成阴性样品溶液，即得。[JP]
2.2.5 系统适用性试验 取上述对照品溶液、供试品溶液及阴性样品溶液各20μl，分别按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。结果，色谱峰基线平稳，供试品溶液中儿茶素与其它组分分离度良好，阴性无干扰；理论塔板数按儿茶素峰计算应不低于4000，分离度>1.5，拖尾因子：0.96。色谱见图3。 2.2.6 线性关系考察 精密量取“2.2.2”项下的儿茶素对照品溶液适量，加甲醇依次稀释成质量浓度分别为0.0049、0.0098、0.0196、0.0491、0.0982、0.1963mg/ml的溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以进样量 （x，μg） 为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=666049x-23116（r=0.9999）。结果表明，儿茶素的进样量在0.0982～3.9269μg范围内与其峰面积的积分值呈良好的线性关系。
2.2.7 精密度实验 精密吸取“2.2.6”项下质量浓度为0.0491mg/ml的儿茶素对照品溶液20μl，按“2.2.1”项下色谱条件重复进样6次，记录峰面积。结果，儿茶素峰面积的RSD为0.98%，表明仪器精密度良好。
2.2.8 稳定性实验 取同一供试品溶液适量，分别于制备0、1、2、4、6、8h时，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，儿茶素峰面积的RSD为2.46%，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。
2.2.9 重复性实验 取同一批次（批号：141010）升红颗粒1g，共6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算峰面积，并计算样品含量。结果，儿茶素的平均含量为0.9255mg/g，RSD为1.13%，表明本方法重复性良好。
2.2.10 加样回收率实验 精密称取已知儿茶素含量（0.9255mg/g）的升红颗粒（批号： 141010） 1.0g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，精密加入儿茶素对照品溶液（1.0012mg/ml）0.9ml，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定， 记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表1。
2.2.11 样品含量测定 取3批样品各适量，分别按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，计算样品含量，结果见表2。
3 讨论
3.1 花生红衣的薄层色谱鉴别 考察花生红衣的薄层色谱鉴别方法时，参照文献[6]的方法，但该方法制备供试品须经水煎煮提取、酸化及乙酸乙酯萃取等操作过程，比较繁琐费时，因此直接用乙酸乙酯进行超声提取，实践证明改进后的方法不仅操作简便，而且斑点清晰，分离效果同样比较理想。另外，原方法采用的展开剂为甲苯-丙酮-乙酸（3∶3∶1），考虑到甲苯毒性较大，对环境和实验人员健康的影响较大，因此尝试用极性相似的溶剂系统进行替代。实验考查了二氯甲烷-甲醇-乙酸（8∶1∶1.5、5∶1∶1、3∶1∶1）及二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2、8∶6∶1∶2.5）等系统，结果以二氯甲烷-石油醚-甲醇-乙酸（8∶3∶1∶2）的展开效果比较理想，斑点清晰，Rf值适中。
3.2 HPLC法测定儿茶素含量 HPLC法测定升红颗粒中儿茶素含量的色谱条件借鉴了本课题的前期研究中摸索出的HPLC法测定花生红衣中儿茶素含量的色谱条件[8]，经验证，该条件同样适合升红颗粒中儿茶素含量的测定，分离度、脱尾因子均符合要求。
在研究供试品的制备条件时，提取溶剂分别考察了水、乙醇、50%甲醇、50%乙醇等溶剂的提取效果，提取方法考察了回流提取（1、1.5、2h）及超声提取（20、30min）。结果以先用50%甲醇浸泡30min后，再超声提取20min的方法比较好，操作简便且儿茶素提取比较完全。
3.3 由于本制剂制备的批次较少，随着投料量的变化和制备工艺的改进，儿茶素的含量仍不稳定，需稳定工艺后进一步积累数据，以确定儿茶素的含量限度，才能用于本制剂的质量控制。
参考文献
[1]刘屏，王东晓，陈桂芸，等. 鸡血藤单体化合物对造血祖细胞增殖的调控作用研究[J]. 中国药理学通报，2007（236）： 741-745.
[2]张秀尧，凌罗庆，戴荣兴.花生衣的化学成分研究[J].中国中药杂志，1990，15（6）：36-39.
[3]梁宁，韦松基，林启云.鸡血藤总黄酮对血虚小鼠抗贫血作用及机理研究[J]. 时珍国医国药，2009，20（2）：362-363.
[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：180.
[5]韦娟. 鸡血藤薄层鉴别方法改进[J].中国现代药物应用，2009，3（7）：170.
[6]吴静，孙莉，汪剑飞，等. 花生红衣的质量研究及控制[J]. 现代中药研究与实践，2014，28（3）：70-73.
[7]贾智若，李兵，李耀华，等.反相高效液相色谱法测定杜仲中儿茶素的含量[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：117-119.
[8]蒋文玉，李江，邓俊刚，等. 高效液相色谱法测定花生红衣中儿茶素的含量[J].华夏医学，2014，27（6）：11-13.
（收稿日期：2015.12.20）