论文部分内容阅读
摘要：【目的】明確稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）胚后发育的毒性作用，为稀土尾矿区两栖类动物的保护提供科学依据。【方法】以内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地（简称尾矿库湿地）为研究样地、相对未受污染的黄河自然保护区小白河湿地（简称小白河湿地）为对照样地，通过观测分析花背蟾蜍的野外生态学指标、生理生化指标和遗传毒性指标，探究稀土尾矿库渗漏水对花背蟾蜍胚后发育的毒性效应。【结果】尾矿库湿地花背蟾蜍的总数、种群密度、性别比例和抱对率均明显少于小白河湿地花背蟾蜍，但产卵量极显著高于小白河湿地（P<0.01，下同）;尾矿库湿地的蝌蚪发育相对滞后于小白河湿地蝌蚪，但其体格整体上大于小白河湿地蝌蚪。尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的总抗氧化能力（T-AOC）呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值;而丙二醛（MDA）含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值。尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均极显著高于小白河湿地蝌蚪，且血红细胞核异常率明显高于小白河湿地蝌蚪。【结论】尾矿库渗漏水污染通过影响花背蟾蜍的抱对率来降低蝌蚪种群密度，而对其胚后发育的主要影响机理是导致蝌蚪的组织氧化损伤和血细胞DNA损伤。
关键词： 花背蟾蜍;尾矿库渗漏水污染;胚后发育;种群密度;DNA损伤;微核率
中图分类号： S865.9 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0412-06
Abstract：【Objective】The toxic effects of leakage water from rare earth tailings reservoir on the postembryonic development of Strauchbufo raddei were studied in order to provide scientific basis and data support for the amphibians protecting in the tailings wetland. 【Method】The polluted wetland formed by seepage water from the south of a tailings reservoir in Inner Mongolia was taken as the study site（tailings wetland for short）， the relatively non-polluted Xiaobaihe wetland in Yellow River natural reserve as the control site（Xiaobaihe wetland for short）， and S. raddei as the experimental animal. By measuring the ecological index， physiological and biochemical index and genetic toxicity index of S. raddei， the toxic effects of rare earth tailings leakage water on the postembryonic development of S. raddei were comparatively ana-lyzed. 【Result】The total number， population density， sex ratio and mating rate of S. raddei in tailings wetland were greatly lower than those in Xiaobaihe wetland， but the spawning amount was extremely higher than that in Xiaobaihe wetland（P<0.01， the same below）. The development of tadpoles in tailings wetland was relatively lagging behind compared with those in Xiaobaihe wetland， but their body sizes were larger than those in Xiaobaihe wetland. The total antioxidant capacity（T-AOC） in the liver and pancreas of tailings wetland tadpoles decreased first and then increased， reaching the minimum value in stage III. On the contrary， malondialdehyde（MDA） contents showed the opposite trend and reached the maximum value in stage III. The DNA damage of blood cells of tadpoles in each development stage of tailings wetland was extremely higher than those in Xiaobaihe wetland， and the rate of red blood cell nucleus abnormality was higher than those in Xiaobaihe wetland. 【Conclusion】Water leakage pollution from tailings pond can reduce the tadpole population density by affecting the mating rate， and the main influencing mechanism of pollution on the S. raddei postembryonic development is to cause oxidative damage of tissues and DNA damage of blood cells. Key words： Strauchbufo raddei; water leakage pollution of tailings pond; postembryonic development; population density; DNA damage; micronucleus rate
0 引言
【研究意义】尾矿库是选矿产生的矿渣等废弃物存放地，含有大量的有毒有害物质，而这些物质通过沉降或渗漏等作用，严重破坏尾矿库周边的生态环境（程峰等，2017;司万童等，2017）。两栖类动物是联系水体与陆地环境的重要生物类群，其高渗透性皮肤吸收化学物质的速度是哺乳类动物的100倍（Brühl et al.，2013），由于这种特定的生理特征和生活史，常作为环境污染尤其是水体和沉积物污染的敏感性指示生物（Si et al.，2014）。因此，开展稀土尾矿库复合污染对两栖类动物的毒性作用研究，可为稀土尾矿库周边区域的污染监测、防控和评价提供参考依据。【前人研究进展】尾矿库渗漏水中含有大量的重金属、盐离子及钍等放射性元素（Huang et al.，2014），可对周边地上及地下区域的土壤和水体造成污染，且这些污染对矿区周边生态环境同样存在潜在负面影响（Si et al.，2014）。司万童等（2013）研究表明，尾矿库渗漏水对植物、水生动物会产生一定的毒性效应，且这种毒性效应与渗漏水污染时间及其浓度存在一定的时间—浓度—效应关系。蝌蚪是蛙和蟾蜍的水生幼体，一般几天内就能发育成一个完整的免疫系统和复杂循环系统，常用于环境监测、抗氧化反应和氧化应激，也可作为污染物暴露的生物指示器（Isnas et al.，2012）。已有研究表明，环境污染对两栖类动物的跳跃能力、骨骼发育、生长发育、抗氧化能力等均会产生一定负面影响（冯磊等，2012;Proki? et al.，2016），生物群体下降、两栖类动物畸形率、死亡率增加也与环境污染密切相关（黄德军等，2004;Si et al.，2014），如重金属污染能改变花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）的繁殖对策（Guo et al.，2018;Zhang et al.，2018），影响蟾蜍性腺发育（司万童等，2017），最终导致其种群结构发生改变及种群数量下降。重金属污染还会引起蝌蚪肝脏、肾脏组织的病理变化，且伴有抗有丝分裂活性的作用（Monteiro et al.，2018）。因此，通过开展蝌蚪受污染环境的慢性毒性测试可对重要两栖类动物的重金属安全级别进行科学评估。【本研究切入点】花背蟾蜍在黄河流域内蒙古段的活动非常频繁（司万童等，2017），在水生生物食物链中处于非常重要的位置，但至今尚无有关稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育毒性作用的研究报道。【拟解决的关键问题】以内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地为研究样地，通过观测分析花背蟾蜍的野外生态学指标、生理生化指标和遗传毒性指标，明确稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育的毒性作用，为稀土尾矿区两栖类动物的保护提供科学依据。
1 材料與方法
1. 1 采样点
研究样地选择内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地（下简称尾矿库湿地）;对照样地选择相对未受污染的黄河自然保护区小白河湿地（下简称小白河湿地）。尾矿库地势北高南低，渗漏水在尾矿库南侧形成约10万m2的水域湿地;黄河在流经包头市小白河时形成了十几个小型湿地。本研究分别在尾矿库南侧和小白河两地选择地形较规则、采样较容易的样地（约1万m2）作为研究区域（图1）。
1. 2 水体和底泥中重金属含量分析
分别测定两个样地水体和底泥（0～10 cm）中的重金属含量。利用强酸湿法消解对采集的样品进行处理，再以电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，德国捷达）测定重金属含量;在重金属元素测定过程中，使用标准品（北京钢研纳克检测技术股份有限公司）绘制标曲和校准设备，保证回收率在（100±10）%。
1. 3 动物样品采集和形态学指标测定
于2017年4月底当地蟾蜍冬眠结束开始活动后，在野外通过背部色斑、婚垫及是否鸣叫等雄性的第二性征辨别雌雄并记录数量，通过实际观察与鸣叫声音相结合的方法对花背蟾蜍数量和种群密度进行统计。由于蟾蜍的两栖特性，难以获得准确的统计数据，因此蟾蜍数量准确度存在一定的局限性。5月初进入繁殖季节花背蟾蜍开始集中求偶、抱对和产卵，产卵时间一般集中在2～3 d内全部完成，之后成体潜回深水区，从此较少现身。卵带一般产在水边浅水区，卵带总数量即代表成功抱对的蟾蜍数量。于花背蟾蜍产完卵的当天在野外观察并统计其产卵量，包括卵带总数和卵带中的卵粒数。此后每天中午12：00定点进行观察统计，直到完全孵化蝌蚪离去后，统计未孵化卵粒数量，计算孵化率。两个样地分别统计10条卵带。产卵后一周左右进入胚后发育阶段，期间共统计4次蝌蚪密度及各发育期蝌蚪比例，每次统计总数约1000只。参照赵振芳（1991）的方法将花背蟾蜍胚后发育分成5个发育期，包括I期（26～27期：胚后发育开始）、II期（30～32期：后肢5个脚趾长出）、III期（35～36期：肛管消失，前脚未出）、IV期（37～38期：前肢出现，尾巴变短）和V期（39期：变态完成，尾巴消失）。各发育期约挑取100只蝌蚪带回实验室，置于干净的培养皿中，然后测量各阶段蝌蚪形态学指标，包括体重、全长、体长、体宽和尾长。全长即自吻端至尾末端的长度;体长即自吻端至尾基部的长度;体宽即体两侧的最大宽度;尾长即自肛管基部至尾末端的长度。试验结束后剩余蝌蚪放生。
1. 4 花背蟾蜍蝌蚪指标分析
蝌蚪血液样品制备及其指标测定：取尾矿库湿地和小白河湿地两个样地的蝌蚪（n>10），放入10 mL离心管中断尾采集血样，采用单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel eletrophoresis，SCGE）检测蝌蚪血细胞DNA损伤程度，并以血细胞微核率（Micronuc-leus，MN）方法测定蝌蚪血红细胞核异常率。 蝌蚪组织样品制备及其指标测定：采血后的蝌蚪迅速解剖，准确称取肝胰脏组织，按照1∶99比例加入PBS，采用匀浆器迅速匀浆（冰浴），置于50 mL EP管中，4 ℃下3000 r/min离心10 min。吸取上清液，以南京建成生物工程研究所研发的试剂盒测定总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量。
1. 5 统计分析
利用SPSS 17.0进行试验数据统计和单因素方差分析（One-way ANOVA）。
2 结果与分析
2. 1 花背蟾蜍成体的形体特征及繁殖性能
尾矿库湿地渗漏水常年聚集在南侧，水中污染物不断沉淀于底泥中，致使尾矿库湿地水体和底泥中的各种重金属污染物含量（表1）均显著高于小白河湿地（P<0.05，下同）。在研究样地范围内，尾矿库湿地的花背蟾蜍总数明显少于小白河湿地，对应的花背蟾蜍种群密度也低于小白河湿地（表2）。小白河湿地花背蟾蜍的抱对率显著高于尾矿库湿地，与两样地花背蟾蜍的性别比例有密切关系，小白河湿地花背蟾蜍的雌雄比例为1∶0.94，而尾矿库湿地仅为1∶0.68。在产卵量方面，尾矿库湿地花背蟾蜍的产卵量极显著高于小白河湿地（P<0.01，下同），小白河湿地花背蟾蜍的产卵量仅为尾矿库湿地的83.45%;尾矿库湿地花背蟾蜍孵化率略低于小白河湿地，但两样地差异不显著（P<0.05），可能与花背蟾蜍卵带膜对卵有极强的保护作用有关。
2. 2 蝌蚪密度及各发育期比例
随着蝌蚪的成长（2017年5月14日—6月17日），小白河湿地和尾矿库湿地的蝌蚪总密度均急剧下降（表3），主要是被当地鸟类取食。两样地均有大量鸟类生活，小白河湿地有鸟类10余种，以燕鸥为主;而尾矿库湿地有鸟类20余种，以鹬类和鸭类为主。各采样时间点，尾矿库湿地的蝌蚪密度均低于小白河湿地。说明鸟类捕食和尾矿库渗漏水污染对蝌蚪种群密度均有一定影响。
由图2可看出，尾矿库湿地的蝌蚪发育相对滞后于小白河湿地。2017年5月14日，尾矿库湿地的蝌蚪只有21～23期，而小白河湿地蝌蚪已达26～27期。随着蝌蚪的发育和变态，至6月上旬时小白河湿地发育至38～39期的蝌蚪已超过65%，而尾矿库湿地发育至38～39期的蝌蚪仅占10%左右。说明尾矿库周边湿地水体污染延长了蝌蚪的胚后发育时间，对其变态发育具有抑制作用。
2. 3 蝌蚪形态学指标分析结果
由表4可看出，同期相比，尾矿库湿地蝌蚪体重在28～37期显著高于小白河湿地蝌蚪，全长在32～33和36～39期显著高于小白河湿地蝌蚪，尾长在34～35期显著高于小白河湿地蝌蚪。整体上，尾矿库湿地蝌蚪的体格大于小白河湿地蝌蚪，可能是尾矿库湿地植被覆盖率高、蚊蝇较多、营养丰富的原因所致。
2. 4 蝌蚪肝胰脏理化指标测定结果
从I期至IV期，尾矿库湿地和小白河湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值;I、II和III期尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC极显著高于小白河湿地蝌蚪，但IV和V期極显著低于小白河湿地蝌蚪（图3-A）。蝌蚪肝胰脏中MDA含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值，且II、III和V期尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的MDA含量极显著高于小白河湿地蝌蚪（图3-B）。
2. 5 蝌蚪血细胞DNA损伤程度及微核率测定结果
由图4可看出，尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均极显著高于小白河湿地蝌蚪。从I期至V期，小白河湿地蝌蚪血细胞DNA损伤程度整体上呈下降趋势，而尾矿库湿地蝌蚪呈先下降后上升再下降的变化趋势，于IV期达最大值。
蝌蚪血红细胞微核率测定结果（表5）显示，两样地各发育期蝌蚪血红细胞核异常率均较低。但整体上，尾矿库湿地蝌蚪的血红细胞核异常率高于小白河湿地蝌蚪，且在IV期达最大值（4‰），与蝌蚪血细胞DNA损伤程度相吻合，进一步证实尾矿库渗漏水污染对蝌蚪血细胞DNA的损伤作用较严重，导致染色体发生断裂，断裂染色体不能随有丝分裂进入正常的子细胞而形成微核游离在主核周围，进而影响子一代的正常繁殖。可见，尾矿库渗漏水污染已对花背蟾蜍产生遗传损伤作用。
3 讨论
尾矿库污染物经过常年地表雨水冲刷、尾矿库废水渗漏和风力引起的扬尘等途径，致使其周边地区水体严重污染，底泥中重金属元素不断积累，进而对赖以生存的动植物产生毒性效应（邓琴等，2017;司万童等，2017）。本研究中，小白河湿地花背蟾蜍总数及其种群密度均高于尾矿库湿地，其原因除了小白河湿地常年水位较稳定，周边居民较少，人类活动对其干扰较小外，还由于小白河湿地的水环境未受污染，而尾矿库周边湿地的水环境污染较严重，对花背蟾蜍的正常生存产生持续负面影响。虽然小白河湿地花背蟾蜍的种群密度、性别比例和抱对率均高于尾矿库湿地，但尾矿库湿地花背蟾蜍的产卵量明显高于小白河湿地，可能是尾矿库湿地花背蟾蜍为减小污染对其种群的影响而增加繁殖投入，但具体原因有待进一步探究。另外，两样地的孵化率差异不显著，可能与花背蟾蜍卵带膜对卵有极强的保护作用有直接关系。整体而言，尾矿库湿地花背蟾蜍的抱对率远低于小白河湿地是其种群数量较少的主要原因。
与小白河湿地相比较，尾矿库周边湿地水体污染延长了蝌蚪的胚后发育时间，说明重金属污染对蟾蜍蝌蚪的发育和变态具有明显抑制作用（江彬强等，2008）。这种抑制作用与环境污染胁迫存在密切关系。本研究结果显示，尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值;而MDA含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值。随着蝌蚪的发育和变态，尾矿库渗漏水污染致使蝌蚪体内的氧化胁迫加重，最终导致其组织的脂质过氧化程度增加，抗氧化能力逐渐下降。蝌蚪在III期（接近变态临界期）对环境胁迫最敏感（Si et al.，2014），III期以后蝌蚪逐渐离开水体，受其影响的时间逐渐缩短，蟾蜍幼体体内各种组织重整，免疫、呼吸、消化和神经系统也逐渐完善，对外界污染胁迫有一定适应性和免疫力，发生的脂质过氧化程度逐渐降低，总体抗氧化能力逐渐增强（李万江，2015;司万童等，2017）。 为进一步探究尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育影响的作用机理，本研究分析了蝌蚪血细胞DNA的损伤程度，结果发现尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均显著高于小白河湿地蝌蚪。由于刚孵化出蝌蚪离开了卵细胞的保护作用，暴露在污染水环境中而对其血细胞DNA造成损伤;随着蝌蚪对污水环境的逐渐适应，其血细胞DNA损伤程度降低，但临近变态期后蟾蜍幼体对污染水环境敏感，抵抗力降低，血细胞DNA损伤程度加重;至变态临近完成时其各种系统逐渐完善，蟾蜍幼体上岸并逐渐脱离水污染，对环境污染的抵抗力日益增加，血细胞DNA损伤程度逐渐减轻。尾矿库湿地蝌蚪IV期的血细胞DNA损伤程度达最大值，但肝胰脏抗氧化指标分析发现尾矿库湿地蝌蚪在III期的影响最明显，可能是DNA损伤具有延后性，不如生理生化指标反映迅速所致。
4 结论
尾矿库渗漏水污染通过影响花背蟾蜍的抱对率来降低蝌蚪种群密度，而对其胚后发育的主要影响机理是导致蝌蚪的组织氧化损伤和血细胞DNA损伤。
参考文献：
程峰，苏夏征，周洁军，郭尚其. 2017. 岩溶区尾矿库渗漏机理与综合防治技术——以环江北山铅锌矿尾矿库为例[J]. 中国岩溶，36（2）：242-247. [Cheng F，Su X Z，Zhou J J，Guo S Q. 2017. Leakage mechanism and comprehensive prevention control technology of tailing pond in karst areas[J]. Carsologica Sinica，36（2）：242-247.]
邓琴，吴迪，秦樊鑫，杨珍，贾亚琪，程志飞，刘品祯. 2017. 岩溶铅锌矿区土壤重金属污染特征[J]. 中国岩溶，36（2）：248-254. [Deng Q，Wu D，Qin F X，Yang Z，Jia Y Q，Cheng Z F，Liu P Z. 2017. Pollution characteristics of heavy metals in soil of lead-zinc mining in karst areas[J]. Carsologica Sinica，36（2）：248-254.]
冯磊，戴昕鹏，张军，刘白林，张迎梅. 2012. 重金属污染条件下花背蟾蜍跳跃能力与骨骼肌ATP 酶和AChE活性变化研究[J]. 四川动物，31（4）：553-557. [Feng L，Dai X P，Zhang J，Liu B L，Zhang Y M. 2012. Changes of the locomotor performance and activities of ATPase and AChE of Bufo raddei under the stress of heavy metal pollution[J]. Sichuan Journal of Zoology，31（4）：553-557.]
黄德军，张迎梅，赵东芹，龙静，汪贵英，胡之德. 2004. 重金屬镉对花背蟾蜍蝌蚪生长发育的影响[J]. 兰州大学学报（自然科学版），40（2）：81-83. [Huang D J，Zhang Y M，Zhao D Q，Long J，Wang G Y，Hu Z D. 2004. Effect of cadmium on the development of tadpoles of the Bufo raddei[J]. Jounrnal of Lanzhou University（Nathral Scien-ces），40（2）：81-83.]
江彬强，陈伟庭，李东风. 2008. 重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响[J]. 华南师范大学学报（自然科学版），（2）：100-104. [Jiang B Q，Chen W T，Li D F. 2008. E-ffect of heavy metal ion on growth of tadpole of toad （Bufo melanostictus Schneider）[J]. Journal of South China Normal University（Natural Science Edition），（2）：100-104.]
李万江. 2015. 重金属铅、汞对花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究[D]. 兰州：西北师范大学. [Li W J. 2015. Preliminary study on toxicity of lead and mercury to Bufo raddei tadpoles[D]. Lanzhou：Northwest Normal University.]
司万童，蒋海明，栗利曼，刘莎，刘菊梅，沈渭寿，朱晓东. 2017. 花背蟾蜍性腺抗氧化酶对稀土尾矿库污染胁迫的响应[J]. 生态毒理学报，12（2）：209-215. [Si W T，Jiang H M，Li L M，Liu S，Liu J M，Shen W S，Zhu X D. 2017. The response of antioxidant enzyme in Bufo raddei gonad to rare earth tailings pollution stress[J]. Asian Journal of Ecotoxicology，12（2）：209-215.]
司万童，王建英，苗菲菲，刘菊梅，张雪峰. 2013. 尾矿库渗漏水污染对泥鳅的氧化损伤作用[J]. 南方农业学报，44（2）：318-322. [Si W T，Wang J Y，Miao F F，Liu J M，Zhang X F. 2013. Oxidative damage of polluted seepage water from tailing pond to Misgurnus anguillicaudatus[J]. Journal of Southern Agriculture，44（2）：318-322.] 赵振芳. 1991. 花背蟾蜍胚胎发育的初步观察[J]. 动物学杂志，26（2）：11-16. [Zhao Z F. 1991. Preliminary studies on embryo development of toad（Bufo raddei）[J]. Chinese Journal of Zoology，26（2）：11-16.]
Brühl C A，Schmidt T，Pieper S，Alscher A. 2013. Terrestrial pesticide exposure of amphibians：An underesti-mated cause of global decline？[J]. Scientific Reports，3：1135. doi：10.1038/srep01135.
Guo R，Zhang W Y，Yang Y，Ding J，Yang W Z，Zhang Y M. 2018. Variation of fitness and reproductive strategy in male Bufo raddei under environmental heavy metal pollution[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，164：253-260.
Huang X，Cao G L，Liu J，Prommer H，Zheng C M. 2014. Reactive transport modeling of thorium in a cloud compu-ting environment[J]. Journal of Geochemical Exploration，144：63-73.
Isnas M，Yegin E，Celik I. 2012. Effects of omethoate oncertain oxidative biomarkers in various tissues of frogs（Rana ridibunda） at acute exposure[J]. Toxicology and Industrial Health，28（1）：27-34.
Monteiro J A D N，Cunha L A D，Costa M H P D，Reis H S D，Aguiar A C D S，Oliveira-Bahia V R L，Burbano R M R，Rocha C A M D. 2018. Mutagenic and histopathological effects of hexavalent chromium in tadpoles of Lithobates catesbeianus（Shaw，1802）（Anura，Ranidae）[J]. Eco-toxicology and Environmental Safety，163：400-407.
Proki? M D，Borkovi?-Miti? S S，Krizmani? I I，Muti? J J，Vukojevi? V，Nasia M，Gavri? J P，Despotovi? S G，Gavrilovi? B R，Radovanovi? T B，Pavlovi? S Z，Sai?i? Z S. 2016. Antioxidative responses of the tissues of two wild populations of Pelophylax kl. esculentus frogs to heavy metal pollution[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，128：21-29.
Si W T，Zhang W Y，Lv Y，Yang F，Liu J M，Zhang Y M. 2014. Heavy metal removal in a constructed wetland and benefits for the development of the toad Bufo raddei[J]. Po-lish Journal of Environmental Studies，23（6）：2207-2215.
Zhang W Y，Guo R，Ai S W，Yang Y，Ding J，Zhang Y M. 2018. Long-term heavy metal pollution varied female reproduction investment in free-living anura，Bufo raddei[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，159：136-142.
（責任编辑 罗 丽）
关键词： 花背蟾蜍;尾矿库渗漏水污染;胚后发育;种群密度;DNA损伤;微核率
中图分类号： S865.9 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）02-0412-06
Abstract：【Objective】The toxic effects of leakage water from rare earth tailings reservoir on the postembryonic development of Strauchbufo raddei were studied in order to provide scientific basis and data support for the amphibians protecting in the tailings wetland. 【Method】The polluted wetland formed by seepage water from the south of a tailings reservoir in Inner Mongolia was taken as the study site（tailings wetland for short）， the relatively non-polluted Xiaobaihe wetland in Yellow River natural reserve as the control site（Xiaobaihe wetland for short）， and S. raddei as the experimental animal. By measuring the ecological index， physiological and biochemical index and genetic toxicity index of S. raddei， the toxic effects of rare earth tailings leakage water on the postembryonic development of S. raddei were comparatively ana-lyzed. 【Result】The total number， population density， sex ratio and mating rate of S. raddei in tailings wetland were greatly lower than those in Xiaobaihe wetland， but the spawning amount was extremely higher than that in Xiaobaihe wetland（P<0.01， the same below）. The development of tadpoles in tailings wetland was relatively lagging behind compared with those in Xiaobaihe wetland， but their body sizes were larger than those in Xiaobaihe wetland. The total antioxidant capacity（T-AOC） in the liver and pancreas of tailings wetland tadpoles decreased first and then increased， reaching the minimum value in stage III. On the contrary， malondialdehyde（MDA） contents showed the opposite trend and reached the maximum value in stage III. The DNA damage of blood cells of tadpoles in each development stage of tailings wetland was extremely higher than those in Xiaobaihe wetland， and the rate of red blood cell nucleus abnormality was higher than those in Xiaobaihe wetland. 【Conclusion】Water leakage pollution from tailings pond can reduce the tadpole population density by affecting the mating rate， and the main influencing mechanism of pollution on the S. raddei postembryonic development is to cause oxidative damage of tissues and DNA damage of blood cells. Key words： Strauchbufo raddei; water leakage pollution of tailings pond; postembryonic development; population density; DNA damage; micronucleus rate
0 引言
【研究意义】尾矿库是选矿产生的矿渣等废弃物存放地，含有大量的有毒有害物质，而这些物质通过沉降或渗漏等作用，严重破坏尾矿库周边的生态环境（程峰等，2017;司万童等，2017）。两栖类动物是联系水体与陆地环境的重要生物类群，其高渗透性皮肤吸收化学物质的速度是哺乳类动物的100倍（Brühl et al.，2013），由于这种特定的生理特征和生活史，常作为环境污染尤其是水体和沉积物污染的敏感性指示生物（Si et al.，2014）。因此，开展稀土尾矿库复合污染对两栖类动物的毒性作用研究，可为稀土尾矿库周边区域的污染监测、防控和评价提供参考依据。【前人研究进展】尾矿库渗漏水中含有大量的重金属、盐离子及钍等放射性元素（Huang et al.，2014），可对周边地上及地下区域的土壤和水体造成污染，且这些污染对矿区周边生态环境同样存在潜在负面影响（Si et al.，2014）。司万童等（2013）研究表明，尾矿库渗漏水对植物、水生动物会产生一定的毒性效应，且这种毒性效应与渗漏水污染时间及其浓度存在一定的时间—浓度—效应关系。蝌蚪是蛙和蟾蜍的水生幼体，一般几天内就能发育成一个完整的免疫系统和复杂循环系统，常用于环境监测、抗氧化反应和氧化应激，也可作为污染物暴露的生物指示器（Isnas et al.，2012）。已有研究表明，环境污染对两栖类动物的跳跃能力、骨骼发育、生长发育、抗氧化能力等均会产生一定负面影响（冯磊等，2012;Proki? et al.，2016），生物群体下降、两栖类动物畸形率、死亡率增加也与环境污染密切相关（黄德军等，2004;Si et al.，2014），如重金属污染能改变花背蟾蜍（Strauchbufo raddei）的繁殖对策（Guo et al.，2018;Zhang et al.，2018），影响蟾蜍性腺发育（司万童等，2017），最终导致其种群结构发生改变及种群数量下降。重金属污染还会引起蝌蚪肝脏、肾脏组织的病理变化，且伴有抗有丝分裂活性的作用（Monteiro et al.，2018）。因此，通过开展蝌蚪受污染环境的慢性毒性测试可对重要两栖类动物的重金属安全级别进行科学评估。【本研究切入点】花背蟾蜍在黄河流域内蒙古段的活动非常频繁（司万童等，2017），在水生生物食物链中处于非常重要的位置，但至今尚无有关稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育毒性作用的研究报道。【拟解决的关键问题】以内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地为研究样地，通过观测分析花背蟾蜍的野外生态学指标、生理生化指标和遗传毒性指标，明确稀土尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育的毒性作用，为稀土尾矿区两栖类动物的保护提供科学依据。
1 材料與方法
1. 1 采样点
研究样地选择内蒙古某尾矿库南侧由渗漏水形成的受污染水域湿地（下简称尾矿库湿地）;对照样地选择相对未受污染的黄河自然保护区小白河湿地（下简称小白河湿地）。尾矿库地势北高南低，渗漏水在尾矿库南侧形成约10万m2的水域湿地;黄河在流经包头市小白河时形成了十几个小型湿地。本研究分别在尾矿库南侧和小白河两地选择地形较规则、采样较容易的样地（约1万m2）作为研究区域（图1）。
1. 2 水体和底泥中重金属含量分析
分别测定两个样地水体和底泥（0～10 cm）中的重金属含量。利用强酸湿法消解对采集的样品进行处理，再以电感耦合等离子体质谱（ICP-MS，德国捷达）测定重金属含量;在重金属元素测定过程中，使用标准品（北京钢研纳克检测技术股份有限公司）绘制标曲和校准设备，保证回收率在（100±10）%。
1. 3 动物样品采集和形态学指标测定
于2017年4月底当地蟾蜍冬眠结束开始活动后，在野外通过背部色斑、婚垫及是否鸣叫等雄性的第二性征辨别雌雄并记录数量，通过实际观察与鸣叫声音相结合的方法对花背蟾蜍数量和种群密度进行统计。由于蟾蜍的两栖特性，难以获得准确的统计数据，因此蟾蜍数量准确度存在一定的局限性。5月初进入繁殖季节花背蟾蜍开始集中求偶、抱对和产卵，产卵时间一般集中在2～3 d内全部完成，之后成体潜回深水区，从此较少现身。卵带一般产在水边浅水区，卵带总数量即代表成功抱对的蟾蜍数量。于花背蟾蜍产完卵的当天在野外观察并统计其产卵量，包括卵带总数和卵带中的卵粒数。此后每天中午12：00定点进行观察统计，直到完全孵化蝌蚪离去后，统计未孵化卵粒数量，计算孵化率。两个样地分别统计10条卵带。产卵后一周左右进入胚后发育阶段，期间共统计4次蝌蚪密度及各发育期蝌蚪比例，每次统计总数约1000只。参照赵振芳（1991）的方法将花背蟾蜍胚后发育分成5个发育期，包括I期（26～27期：胚后发育开始）、II期（30～32期：后肢5个脚趾长出）、III期（35～36期：肛管消失，前脚未出）、IV期（37～38期：前肢出现，尾巴变短）和V期（39期：变态完成，尾巴消失）。各发育期约挑取100只蝌蚪带回实验室，置于干净的培养皿中，然后测量各阶段蝌蚪形态学指标，包括体重、全长、体长、体宽和尾长。全长即自吻端至尾末端的长度;体长即自吻端至尾基部的长度;体宽即体两侧的最大宽度;尾长即自肛管基部至尾末端的长度。试验结束后剩余蝌蚪放生。
1. 4 花背蟾蜍蝌蚪指标分析
蝌蚪血液样品制备及其指标测定：取尾矿库湿地和小白河湿地两个样地的蝌蚪（n>10），放入10 mL离心管中断尾采集血样，采用单细胞凝胶电泳技术（Single cell gel eletrophoresis，SCGE）检测蝌蚪血细胞DNA损伤程度，并以血细胞微核率（Micronuc-leus，MN）方法测定蝌蚪血红细胞核异常率。 蝌蚪组织样品制备及其指标测定：采血后的蝌蚪迅速解剖，准确称取肝胰脏组织，按照1∶99比例加入PBS，采用匀浆器迅速匀浆（冰浴），置于50 mL EP管中，4 ℃下3000 r/min离心10 min。吸取上清液，以南京建成生物工程研究所研发的试剂盒测定总抗氧化能力（T-AOC）和丙二醛（MDA）含量。
1. 5 统计分析
利用SPSS 17.0进行试验数据统计和单因素方差分析（One-way ANOVA）。
2 结果与分析
2. 1 花背蟾蜍成体的形体特征及繁殖性能
尾矿库湿地渗漏水常年聚集在南侧，水中污染物不断沉淀于底泥中，致使尾矿库湿地水体和底泥中的各种重金属污染物含量（表1）均显著高于小白河湿地（P<0.05，下同）。在研究样地范围内，尾矿库湿地的花背蟾蜍总数明显少于小白河湿地，对应的花背蟾蜍种群密度也低于小白河湿地（表2）。小白河湿地花背蟾蜍的抱对率显著高于尾矿库湿地，与两样地花背蟾蜍的性别比例有密切关系，小白河湿地花背蟾蜍的雌雄比例为1∶0.94，而尾矿库湿地仅为1∶0.68。在产卵量方面，尾矿库湿地花背蟾蜍的产卵量极显著高于小白河湿地（P<0.01，下同），小白河湿地花背蟾蜍的产卵量仅为尾矿库湿地的83.45%;尾矿库湿地花背蟾蜍孵化率略低于小白河湿地，但两样地差异不显著（P<0.05），可能与花背蟾蜍卵带膜对卵有极强的保护作用有关。
2. 2 蝌蚪密度及各发育期比例
随着蝌蚪的成长（2017年5月14日—6月17日），小白河湿地和尾矿库湿地的蝌蚪总密度均急剧下降（表3），主要是被当地鸟类取食。两样地均有大量鸟类生活，小白河湿地有鸟类10余种，以燕鸥为主;而尾矿库湿地有鸟类20余种，以鹬类和鸭类为主。各采样时间点，尾矿库湿地的蝌蚪密度均低于小白河湿地。说明鸟类捕食和尾矿库渗漏水污染对蝌蚪种群密度均有一定影响。
由图2可看出，尾矿库湿地的蝌蚪发育相对滞后于小白河湿地。2017年5月14日，尾矿库湿地的蝌蚪只有21～23期，而小白河湿地蝌蚪已达26～27期。随着蝌蚪的发育和变态，至6月上旬时小白河湿地发育至38～39期的蝌蚪已超过65%，而尾矿库湿地发育至38～39期的蝌蚪仅占10%左右。说明尾矿库周边湿地水体污染延长了蝌蚪的胚后发育时间，对其变态发育具有抑制作用。
2. 3 蝌蚪形态学指标分析结果
由表4可看出，同期相比，尾矿库湿地蝌蚪体重在28～37期显著高于小白河湿地蝌蚪，全长在32～33和36～39期显著高于小白河湿地蝌蚪，尾长在34～35期显著高于小白河湿地蝌蚪。整体上，尾矿库湿地蝌蚪的体格大于小白河湿地蝌蚪，可能是尾矿库湿地植被覆盖率高、蚊蝇较多、营养丰富的原因所致。
2. 4 蝌蚪肝胰脏理化指标测定结果
从I期至IV期，尾矿库湿地和小白河湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值;I、II和III期尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC极显著高于小白河湿地蝌蚪，但IV和V期極显著低于小白河湿地蝌蚪（图3-A）。蝌蚪肝胰脏中MDA含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值，且II、III和V期尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的MDA含量极显著高于小白河湿地蝌蚪（图3-B）。
2. 5 蝌蚪血细胞DNA损伤程度及微核率测定结果
由图4可看出，尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均极显著高于小白河湿地蝌蚪。从I期至V期，小白河湿地蝌蚪血细胞DNA损伤程度整体上呈下降趋势，而尾矿库湿地蝌蚪呈先下降后上升再下降的变化趋势，于IV期达最大值。
蝌蚪血红细胞微核率测定结果（表5）显示，两样地各发育期蝌蚪血红细胞核异常率均较低。但整体上，尾矿库湿地蝌蚪的血红细胞核异常率高于小白河湿地蝌蚪，且在IV期达最大值（4‰），与蝌蚪血细胞DNA损伤程度相吻合，进一步证实尾矿库渗漏水污染对蝌蚪血细胞DNA的损伤作用较严重，导致染色体发生断裂，断裂染色体不能随有丝分裂进入正常的子细胞而形成微核游离在主核周围，进而影响子一代的正常繁殖。可见，尾矿库渗漏水污染已对花背蟾蜍产生遗传损伤作用。
3 讨论
尾矿库污染物经过常年地表雨水冲刷、尾矿库废水渗漏和风力引起的扬尘等途径，致使其周边地区水体严重污染，底泥中重金属元素不断积累，进而对赖以生存的动植物产生毒性效应（邓琴等，2017;司万童等，2017）。本研究中，小白河湿地花背蟾蜍总数及其种群密度均高于尾矿库湿地，其原因除了小白河湿地常年水位较稳定，周边居民较少，人类活动对其干扰较小外，还由于小白河湿地的水环境未受污染，而尾矿库周边湿地的水环境污染较严重，对花背蟾蜍的正常生存产生持续负面影响。虽然小白河湿地花背蟾蜍的种群密度、性别比例和抱对率均高于尾矿库湿地，但尾矿库湿地花背蟾蜍的产卵量明显高于小白河湿地，可能是尾矿库湿地花背蟾蜍为减小污染对其种群的影响而增加繁殖投入，但具体原因有待进一步探究。另外，两样地的孵化率差异不显著，可能与花背蟾蜍卵带膜对卵有极强的保护作用有直接关系。整体而言，尾矿库湿地花背蟾蜍的抱对率远低于小白河湿地是其种群数量较少的主要原因。
与小白河湿地相比较，尾矿库周边湿地水体污染延长了蝌蚪的胚后发育时间，说明重金属污染对蟾蜍蝌蚪的发育和变态具有明显抑制作用（江彬强等，2008）。这种抑制作用与环境污染胁迫存在密切关系。本研究结果显示，尾矿库湿地蝌蚪肝胰脏中的T-AOC呈先下降再上升的变化趋势，于III期达最小值;而MDA含量的变化趋势恰好相反，于III期达最大值。随着蝌蚪的发育和变态，尾矿库渗漏水污染致使蝌蚪体内的氧化胁迫加重，最终导致其组织的脂质过氧化程度增加，抗氧化能力逐渐下降。蝌蚪在III期（接近变态临界期）对环境胁迫最敏感（Si et al.，2014），III期以后蝌蚪逐渐离开水体，受其影响的时间逐渐缩短，蟾蜍幼体体内各种组织重整，免疫、呼吸、消化和神经系统也逐渐完善，对外界污染胁迫有一定适应性和免疫力，发生的脂质过氧化程度逐渐降低，总体抗氧化能力逐渐增强（李万江，2015;司万童等，2017）。 为进一步探究尾矿库渗漏水污染对花背蟾蜍胚后发育影响的作用机理，本研究分析了蝌蚪血细胞DNA的损伤程度，结果发现尾矿库湿地各发育期蝌蚪血细胞DNA损伤程度均显著高于小白河湿地蝌蚪。由于刚孵化出蝌蚪离开了卵细胞的保护作用，暴露在污染水环境中而对其血细胞DNA造成损伤;随着蝌蚪对污水环境的逐渐适应，其血细胞DNA损伤程度降低，但临近变态期后蟾蜍幼体对污染水环境敏感，抵抗力降低，血细胞DNA损伤程度加重;至变态临近完成时其各种系统逐渐完善，蟾蜍幼体上岸并逐渐脱离水污染，对环境污染的抵抗力日益增加，血细胞DNA损伤程度逐渐减轻。尾矿库湿地蝌蚪IV期的血细胞DNA损伤程度达最大值，但肝胰脏抗氧化指标分析发现尾矿库湿地蝌蚪在III期的影响最明显，可能是DNA损伤具有延后性，不如生理生化指标反映迅速所致。
4 结论
尾矿库渗漏水污染通过影响花背蟾蜍的抱对率来降低蝌蚪种群密度，而对其胚后发育的主要影响机理是导致蝌蚪的组织氧化损伤和血细胞DNA损伤。
参考文献：
程峰，苏夏征，周洁军，郭尚其. 2017. 岩溶区尾矿库渗漏机理与综合防治技术——以环江北山铅锌矿尾矿库为例[J]. 中国岩溶，36（2）：242-247. [Cheng F，Su X Z，Zhou J J，Guo S Q. 2017. Leakage mechanism and comprehensive prevention control technology of tailing pond in karst areas[J]. Carsologica Sinica，36（2）：242-247.]
邓琴，吴迪，秦樊鑫，杨珍，贾亚琪，程志飞，刘品祯. 2017. 岩溶铅锌矿区土壤重金属污染特征[J]. 中国岩溶，36（2）：248-254. [Deng Q，Wu D，Qin F X，Yang Z，Jia Y Q，Cheng Z F，Liu P Z. 2017. Pollution characteristics of heavy metals in soil of lead-zinc mining in karst areas[J]. Carsologica Sinica，36（2）：248-254.]
冯磊，戴昕鹏，张军，刘白林，张迎梅. 2012. 重金属污染条件下花背蟾蜍跳跃能力与骨骼肌ATP 酶和AChE活性变化研究[J]. 四川动物，31（4）：553-557. [Feng L，Dai X P，Zhang J，Liu B L，Zhang Y M. 2012. Changes of the locomotor performance and activities of ATPase and AChE of Bufo raddei under the stress of heavy metal pollution[J]. Sichuan Journal of Zoology，31（4）：553-557.]
黄德军，张迎梅，赵东芹，龙静，汪贵英，胡之德. 2004. 重金屬镉对花背蟾蜍蝌蚪生长发育的影响[J]. 兰州大学学报（自然科学版），40（2）：81-83. [Huang D J，Zhang Y M，Zhao D Q，Long J，Wang G Y，Hu Z D. 2004. Effect of cadmium on the development of tadpoles of the Bufo raddei[J]. Jounrnal of Lanzhou University（Nathral Scien-ces），40（2）：81-83.]
江彬强，陈伟庭，李东风. 2008. 重金属离子对黑框蟾蜍蝌蚪生长发育的影响[J]. 华南师范大学学报（自然科学版），（2）：100-104. [Jiang B Q，Chen W T，Li D F. 2008. E-ffect of heavy metal ion on growth of tadpole of toad （Bufo melanostictus Schneider）[J]. Journal of South China Normal University（Natural Science Edition），（2）：100-104.]
李万江. 2015. 重金属铅、汞对花背蟾蜍蝌蚪毒性作用的初步研究[D]. 兰州：西北师范大学. [Li W J. 2015. Preliminary study on toxicity of lead and mercury to Bufo raddei tadpoles[D]. Lanzhou：Northwest Normal University.]
司万童，蒋海明，栗利曼，刘莎，刘菊梅，沈渭寿，朱晓东. 2017. 花背蟾蜍性腺抗氧化酶对稀土尾矿库污染胁迫的响应[J]. 生态毒理学报，12（2）：209-215. [Si W T，Jiang H M，Li L M，Liu S，Liu J M，Shen W S，Zhu X D. 2017. The response of antioxidant enzyme in Bufo raddei gonad to rare earth tailings pollution stress[J]. Asian Journal of Ecotoxicology，12（2）：209-215.]
司万童，王建英，苗菲菲，刘菊梅，张雪峰. 2013. 尾矿库渗漏水污染对泥鳅的氧化损伤作用[J]. 南方农业学报，44（2）：318-322. [Si W T，Wang J Y，Miao F F，Liu J M，Zhang X F. 2013. Oxidative damage of polluted seepage water from tailing pond to Misgurnus anguillicaudatus[J]. Journal of Southern Agriculture，44（2）：318-322.] 赵振芳. 1991. 花背蟾蜍胚胎发育的初步观察[J]. 动物学杂志，26（2）：11-16. [Zhao Z F. 1991. Preliminary studies on embryo development of toad（Bufo raddei）[J]. Chinese Journal of Zoology，26（2）：11-16.]
Brühl C A，Schmidt T，Pieper S，Alscher A. 2013. Terrestrial pesticide exposure of amphibians：An underesti-mated cause of global decline？[J]. Scientific Reports，3：1135. doi：10.1038/srep01135.
Guo R，Zhang W Y，Yang Y，Ding J，Yang W Z，Zhang Y M. 2018. Variation of fitness and reproductive strategy in male Bufo raddei under environmental heavy metal pollution[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，164：253-260.
Huang X，Cao G L，Liu J，Prommer H，Zheng C M. 2014. Reactive transport modeling of thorium in a cloud compu-ting environment[J]. Journal of Geochemical Exploration，144：63-73.
Isnas M，Yegin E，Celik I. 2012. Effects of omethoate oncertain oxidative biomarkers in various tissues of frogs（Rana ridibunda） at acute exposure[J]. Toxicology and Industrial Health，28（1）：27-34.
Monteiro J A D N，Cunha L A D，Costa M H P D，Reis H S D，Aguiar A C D S，Oliveira-Bahia V R L，Burbano R M R，Rocha C A M D. 2018. Mutagenic and histopathological effects of hexavalent chromium in tadpoles of Lithobates catesbeianus（Shaw，1802）（Anura，Ranidae）[J]. Eco-toxicology and Environmental Safety，163：400-407.
Proki? M D，Borkovi?-Miti? S S，Krizmani? I I，Muti? J J，Vukojevi? V，Nasia M，Gavri? J P，Despotovi? S G，Gavrilovi? B R，Radovanovi? T B，Pavlovi? S Z，Sai?i? Z S. 2016. Antioxidative responses of the tissues of two wild populations of Pelophylax kl. esculentus frogs to heavy metal pollution[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，128：21-29.
Si W T，Zhang W Y，Lv Y，Yang F，Liu J M，Zhang Y M. 2014. Heavy metal removal in a constructed wetland and benefits for the development of the toad Bufo raddei[J]. Po-lish Journal of Environmental Studies，23（6）：2207-2215.
Zhang W Y，Guo R，Ai S W，Yang Y，Ding J，Zhang Y M. 2018. Long-term heavy metal pollution varied female reproduction investment in free-living anura，Bufo raddei[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety，159：136-142.
（責任编辑 罗 丽）