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摘要 [目的]建立耐盐彩叶杜梨的茎尖组培快繁技术体系。[方法]以耐盐彩叶杜梨茎尖为试材，对影响茎尖离体培养的取材时期、外植体消毒、培养基和激素配比等因素进行研究。[结果]休眠期水培促萌发的嫩芽污染率较低，最利于茎尖诱导成活。采用正交试验设计筛选出最佳灭菌处理为75%乙醇 +0.1% HgCl2 8 min，污染率和发芽率分别为27.36%和57.47%;适于茎尖增殖培养的培养基和激素组合为MS+1.0 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，增殖系数为9.23。[结论]通过耐盐彩叶杜梨茎尖繁育技术的优化，为建立其优良无性系和进行遗传转化奠定基础。
关键词 耐盐彩叶杜梨;茎尖培育;组织培养;快繁技术
中图分类号 S604+.3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）13-0056-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.018
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Influencing Factors of Stem Tip Breeding of SaltTolerant Pyrus betulaefolia
Abstract [Objective]To establish a rapid propagation technique system of stem tip tissue culture for salttolerant Pyrus betulaefolia.[Method] The stem tip of Pyrus betulaefolia was used to study the influencing factors such as the period of sampling，the disinfection of explants，the medium and the ratio of hormones.[Result]The contamination rate of young shoots promoted by hydroponic culture in dormant stage was lower，which was most beneficial to stem tip induction and survival.The optimal sterilization treatment was 75% alcohol for 30s+0.1% HgCl2 for 8 min，and the contamination rate and germination rate were respectively 27.36% and 57.47%.The suitable multiplication culture medium and hormone combination for stem tip tissue was MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IBA，the multiplication coefficient was 9.23.[Conclusion]Through the optimization of stem tip breeding technology of salttolerant Pyrus betulaefolia，it layed a foundation for establishing its excellent clone and genetic transformation.
Key words Salttolerant Pyrus betulaefolia;Stem tip culture;Tissue culture;Rapid propagation technology
杜梨為蔷薇科梨属落叶乔木，别名棠梨、灰梨、海棠梨等，原产我国北部，长江流域以及辽宁南部、河北、山西、河南、陕西、甘肃、安徽、江西、湖北均有分布，常生于海拔50～1 800 m的平原或山坡上[1]。杜梨是梨树砧木中抗寒、抗旱、耐涝、耐盐碱综合抗性最强的砧木，对所有的白梨、砂梨、秋子梨系统品种具有亲和力，为我国梨树砧木最佳选择[2]。与其他木本果树一样，由于杜梨的高度杂合性以及童期较长等特点，使常规育种周期较长。在田间繁殖也相对费时费力、占用较多土地[3]。随着生物技术的不断进展，杜梨的离体培养取得了长足进展，并为种苗工厂化及种质资源离体保存提供了有效途径。笔者以杜梨为试材，采用正交设计法，获得杜梨快速生长及扩繁培养基，旨在为建立其优良无性系和进行遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验材料为露地栽培于江苏沿江地区农业科学研究所苗圃中的耐盐彩叶杜梨。
1.2 外植体的采集与处理
以耐盐彩叶杜梨的茎尖作为外植体，分别在3个不同时期进行取材：①休眠期枝条于温室内水培催芽（S1）;②新梢生长初期顶端新芽（S2）;③盛花期的枝条顶端茎尖（S3）。
1.3 消毒灭菌
用细毛软刷将枝条表面清洗干净，剪取1.5 cm长的带芽茎段，用洗洁精浸泡30 min，再用流水冲洗1 h以上，在超净工作台上用75%乙醇消毒30 s，再分别用01%的HgCl2灭菌6、8、10 min，无菌水冲洗5～6遍接种到启动培养基上，10 d后统计污染率，20 d后统计萌发率。培养基pH为57，培养温度（25±2）℃，光照强度为2 000 lx，光照时间12 h/d。
1.4 丛生芽诱导和增殖培养
选取在启动培养基上继代3次以上生长健壮的无菌芽，接种到丛生芽诱导和增殖培养基中。设计L9（34）正交设计：6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），IBA（0.25、0.50、1.00 mg/L），NAA（0、0.2、0.4 mg/L），30 d后统计增殖系数及生长状况。 1.5 壮苗生根
选择生长健壮、长势均一的丛生芽，转接至壮苗生根培养基中。壮苗生根培养基用MS+（0.1、0.5、1.0） mg/L IBA，30 d后统计生根率、根数和生长状况。
1.6 炼苗与移栽
将继代培养45 d、高度超过3 cm、生长健壮、根系发育良好的无菌苗，在组培室中进行炼苗。首先去掉瓶子的橡皮筋炼苗2 d，然后将封口膜打开一半炼苗2 d，最后完全去封口膜炼苗7 d。炼苗结束后，取出组培苗，用无菌水将根系上的琼脂清洗干净，并用800倍的多菌灵浸泡15 min。移栽到草炭：珍珠岩=3：1（体积比）的混合基质中。移栽前，基质用高锰酸钾消毒，放置一个晚上后使用，移栽后浇透水使基质和根部紧密结合，放置在25℃的人工气候箱中培养7～14 d，之后放置在温室内常规培养。
2 结果与分析
2.1 最佳取材时期的选择
由表1可知，取材时间对茎尖的诱导效果有显著差异。休眠期枝条于温室内水培外植体与其他取材时期相比，茎尖污染率最低，而发芽率与成活率最高，成活率与其他各组差异达极显著水平。盛花期的枝条顶端茎尖诱导效果较其他2组较差，污染率接近50%，发芽率仅为33.51%。对3次取材结果进行评价得出，污染率由低到高依次为休眠期枝条于温室内水培催芽、新梢生长初期顶端新芽、盛花期枝条顶端茎尖。前2个时期取材，茎尖污染率相对较低，诱导成活率和发芽率较高，是较适宜的取材时期。
2.2 启动培养
由表2可知，用HgCl2消毒不同时间，随着灭菌时间的延长，污染率逐渐降低，相应的萌发率先升高后降低。综合考虑污染情况和发芽结果，杜梨灭菌最适宜的方法为75%乙醇30 s，0.1% HgCl2灭菌8 min，此时的污染率为27.36%，发芽率为57.47%，其发芽率与其他灭菌方式差异达极显著水平。
2.3 丛生芽诱导和增殖培养
由表3可知，高浓度IBA和NAA均能促进丛生芽的增殖生长，而过高浓度的6-BA对植株生长及丛生芽增殖不利，6-BA浓度1 mg/L时，随着IBA浓度的增加，增殖系数升高。极差分析结果表明，丛生芽诱导和增殖培养效果影响因素由大到小依次为IBA、6-BA和NAA。6-BA与IBA的浓度比为1∶1时效果最好，明显优于其他组合。最适宜诱导丛生芽的组合为1 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，此时的增殖系数为9.23，丛生芽长势最好，叶色鲜艳（图1）。
2.4 无菌苗生根培养
从表4可以看出，IBA在一定浓度范围内均可诱导外植体生出不定根，但浓度过高会使平均生根数和平均根长降低，且3种浓度的IBA平均根长差异极显著。但IBA浓度为1.0 mg/L时，诱导的不定根数较少，根系变粗且短，植株生长不良。IBA浓度为0.5 mg/L时，生根的数量最多且根长最长，为最适宜的生根浓度。
2.5 试管苗移栽
移栽后前7 d每天喷水2～3次，之后每天喷水1次，保持空气湿度在80%左右，14 d后即可移出培养箱，直接放置在温室中进行常规管理，移栽成活率达90%以上，之后在气候合适时可移栽大田。
3 结论与讨论
适宜的取材时期是降低茎尖污染率、提高茎尖诱导成活率的重要因素[4]。李艳霞等[5]在建立越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系中发现，利用休眠期水培后萌发出的嫩芽为外植体时，材料的污染最低。范世杰等[6]对3种越橘（桔）茎尖初代培养与增殖进行研究，结果表明不同取材时期茎尖污染率和诱导成苗率有很大差异。该试验也获得了相似的研究结果，用休眠期水培后萌发出的嫩芽可显著降低接种的污染率，提高茎尖诱导成活率，为最适宜取材时期。新梢生长初期顶端新芽和盛花期的枝条顶端茎尖由于长时间暴露在室外，污染严重，接种后不易灭菌，导致污染率较高;另外茎尖顶端分生组织分化相对缓慢，以致于诱导成活率较低，应尽量避免这些时期取材。
在茎尖培养过程中，培養基是影响茎尖成活率以及苗木状态的主要因素之一，当然，同一属的不同种以及不同品种对培养基的反映有所不同，使用的培养基不能同一而论[7-9]。植物激素是影响茎尖诱导和增殖的关键因子之一，在组织培养中起重要作用。林静等[10]利用杜梨子叶诱导不定芽，结果显示，培养基和激素浓度对丛生芽诱导起关键性作用，而生长素NAA对愈伤组织的生长起主要作用。只有选用合适的激素及质量浓度，才能获得理想的结果。该研究中对丛生芽诱导和增殖培养效果影响最大的是IBA，其次为6-BA，尤其6-BA与IBA的浓度比接近1时效果最好，这可能因品种的基因型而有所差异。
耐盐彩叶杜梨作为一种新型的适合沿海滩涂利用的彩叶树种，具有极高的观赏价值和市场前景。该试验以彩叶杜梨茎尖为外植体，初步建立了茎尖组培快繁技术体系，在保证生根成活率的同时，大大缩短了育苗周期，为实现耐盐彩叶杜梨优质组培苗工厂化生产和规模化开发提供了参考。
参考文献
[1] 张祺超，桂炳中，赵丽丽.华北地区盐碱地杜梨栽培[J].中国花卉园艺，2018（10）：57.
[2] 刘振廷，牛鹏斐，潘文明，等.杜梨砧木苗二次移植培育嫁接苗技术探讨[J].河北果树，2018（2）：7-8.
[3] 张盼飞.中条山65份杜梨资源遗传多样性分析及矮化特性评价[D].太谷：山西农业大学，2016.
[4] 桂平.珍稀观赏树种红豆树组织培养技术研究[D].贵阳：贵州大学，2018.
[5] 李艳霞，刘忠玲，刘建明，等.越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系建立[J].东北林业大学学报，2018，46（3）：37-39，44.
[6] 范世杰，杨忠华，尹文龙，等.3种越橘（桔）茎尖初代培养与增殖研究[J].林业科技，2018，43（3）：5-9.
[7] 杨丽萍.卓尼县马铃薯培养基制作与组织培养[J].农业科技与信息，2017（23）：93-94.
[8] 赵会芳，陈姣.不同培养基对勿忘我组织培养的影响[J].农技服务，2017，34（23）：42，41.
[9] 秦梅，张燕，徐美恩，等.甘薯茎尖脱毒及组培快繁技术[J].安徽农业科学，2014，42（32）：11238-11239，11258.
[10] 林静，李疆，田嘉，等.杜梨子叶离体再生体系的建立[J].中国农学通报，2015，31（19）：41-47.
关键词 耐盐彩叶杜梨;茎尖培育;组织培养;快繁技术
中图分类号 S604+.3文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2019）13-0056-02
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.13.018
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Study on the Influencing Factors of Stem Tip Breeding of SaltTolerant Pyrus betulaefolia
Abstract [Objective]To establish a rapid propagation technique system of stem tip tissue culture for salttolerant Pyrus betulaefolia.[Method] The stem tip of Pyrus betulaefolia was used to study the influencing factors such as the period of sampling，the disinfection of explants，the medium and the ratio of hormones.[Result]The contamination rate of young shoots promoted by hydroponic culture in dormant stage was lower，which was most beneficial to stem tip induction and survival.The optimal sterilization treatment was 75% alcohol for 30s+0.1% HgCl2 for 8 min，and the contamination rate and germination rate were respectively 27.36% and 57.47%.The suitable multiplication culture medium and hormone combination for stem tip tissue was MS+1.0 mg/L 6BA+1.0 mg/L IBA，the multiplication coefficient was 9.23.[Conclusion]Through the optimization of stem tip breeding technology of salttolerant Pyrus betulaefolia，it layed a foundation for establishing its excellent clone and genetic transformation.
Key words Salttolerant Pyrus betulaefolia;Stem tip culture;Tissue culture;Rapid propagation technology
杜梨為蔷薇科梨属落叶乔木，别名棠梨、灰梨、海棠梨等，原产我国北部，长江流域以及辽宁南部、河北、山西、河南、陕西、甘肃、安徽、江西、湖北均有分布，常生于海拔50～1 800 m的平原或山坡上[1]。杜梨是梨树砧木中抗寒、抗旱、耐涝、耐盐碱综合抗性最强的砧木，对所有的白梨、砂梨、秋子梨系统品种具有亲和力，为我国梨树砧木最佳选择[2]。与其他木本果树一样，由于杜梨的高度杂合性以及童期较长等特点，使常规育种周期较长。在田间繁殖也相对费时费力、占用较多土地[3]。随着生物技术的不断进展，杜梨的离体培养取得了长足进展，并为种苗工厂化及种质资源离体保存提供了有效途径。笔者以杜梨为试材，采用正交设计法，获得杜梨快速生长及扩繁培养基，旨在为建立其优良无性系和进行遗传转化奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料 试验材料为露地栽培于江苏沿江地区农业科学研究所苗圃中的耐盐彩叶杜梨。
1.2 外植体的采集与处理
以耐盐彩叶杜梨的茎尖作为外植体，分别在3个不同时期进行取材：①休眠期枝条于温室内水培催芽（S1）;②新梢生长初期顶端新芽（S2）;③盛花期的枝条顶端茎尖（S3）。
1.3 消毒灭菌
用细毛软刷将枝条表面清洗干净，剪取1.5 cm长的带芽茎段，用洗洁精浸泡30 min，再用流水冲洗1 h以上，在超净工作台上用75%乙醇消毒30 s，再分别用01%的HgCl2灭菌6、8、10 min，无菌水冲洗5～6遍接种到启动培养基上，10 d后统计污染率，20 d后统计萌发率。培养基pH为57，培养温度（25±2）℃，光照强度为2 000 lx，光照时间12 h/d。
1.4 丛生芽诱导和增殖培养
选取在启动培养基上继代3次以上生长健壮的无菌芽，接种到丛生芽诱导和增殖培养基中。设计L9（34）正交设计：6-BA（0.5、1.0、1.5 mg/L），IBA（0.25、0.50、1.00 mg/L），NAA（0、0.2、0.4 mg/L），30 d后统计增殖系数及生长状况。 1.5 壮苗生根
选择生长健壮、长势均一的丛生芽，转接至壮苗生根培养基中。壮苗生根培养基用MS+（0.1、0.5、1.0） mg/L IBA，30 d后统计生根率、根数和生长状况。
1.6 炼苗与移栽
将继代培养45 d、高度超过3 cm、生长健壮、根系发育良好的无菌苗，在组培室中进行炼苗。首先去掉瓶子的橡皮筋炼苗2 d，然后将封口膜打开一半炼苗2 d，最后完全去封口膜炼苗7 d。炼苗结束后，取出组培苗，用无菌水将根系上的琼脂清洗干净，并用800倍的多菌灵浸泡15 min。移栽到草炭：珍珠岩=3：1（体积比）的混合基质中。移栽前，基质用高锰酸钾消毒，放置一个晚上后使用，移栽后浇透水使基质和根部紧密结合，放置在25℃的人工气候箱中培养7～14 d，之后放置在温室内常规培养。
2 结果与分析
2.1 最佳取材时期的选择
由表1可知，取材时间对茎尖的诱导效果有显著差异。休眠期枝条于温室内水培外植体与其他取材时期相比，茎尖污染率最低，而发芽率与成活率最高，成活率与其他各组差异达极显著水平。盛花期的枝条顶端茎尖诱导效果较其他2组较差，污染率接近50%，发芽率仅为33.51%。对3次取材结果进行评价得出，污染率由低到高依次为休眠期枝条于温室内水培催芽、新梢生长初期顶端新芽、盛花期枝条顶端茎尖。前2个时期取材，茎尖污染率相对较低，诱导成活率和发芽率较高，是较适宜的取材时期。
2.2 启动培养
由表2可知，用HgCl2消毒不同时间，随着灭菌时间的延长，污染率逐渐降低，相应的萌发率先升高后降低。综合考虑污染情况和发芽结果，杜梨灭菌最适宜的方法为75%乙醇30 s，0.1% HgCl2灭菌8 min，此时的污染率为27.36%，发芽率为57.47%，其发芽率与其他灭菌方式差异达极显著水平。
2.3 丛生芽诱导和增殖培养
由表3可知，高浓度IBA和NAA均能促进丛生芽的增殖生长，而过高浓度的6-BA对植株生长及丛生芽增殖不利，6-BA浓度1 mg/L时，随着IBA浓度的增加，增殖系数升高。极差分析结果表明，丛生芽诱导和增殖培养效果影响因素由大到小依次为IBA、6-BA和NAA。6-BA与IBA的浓度比为1∶1时效果最好，明显优于其他组合。最适宜诱导丛生芽的组合为1 mg/L 6-BA+1 mg/L IBA，此时的增殖系数为9.23，丛生芽长势最好，叶色鲜艳（图1）。
2.4 无菌苗生根培养
从表4可以看出，IBA在一定浓度范围内均可诱导外植体生出不定根，但浓度过高会使平均生根数和平均根长降低，且3种浓度的IBA平均根长差异极显著。但IBA浓度为1.0 mg/L时，诱导的不定根数较少，根系变粗且短，植株生长不良。IBA浓度为0.5 mg/L时，生根的数量最多且根长最长，为最适宜的生根浓度。
2.5 试管苗移栽
移栽后前7 d每天喷水2～3次，之后每天喷水1次，保持空气湿度在80%左右，14 d后即可移出培养箱，直接放置在温室中进行常规管理，移栽成活率达90%以上，之后在气候合适时可移栽大田。
3 结论与讨论
适宜的取材时期是降低茎尖污染率、提高茎尖诱导成活率的重要因素[4]。李艳霞等[5]在建立越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系中发现，利用休眠期水培后萌发出的嫩芽为外植体时，材料的污染最低。范世杰等[6]对3种越橘（桔）茎尖初代培养与增殖进行研究，结果表明不同取材时期茎尖污染率和诱导成苗率有很大差异。该试验也获得了相似的研究结果，用休眠期水培后萌发出的嫩芽可显著降低接种的污染率，提高茎尖诱导成活率，为最适宜取材时期。新梢生长初期顶端新芽和盛花期的枝条顶端茎尖由于长时间暴露在室外，污染严重，接种后不易灭菌，导致污染率较高;另外茎尖顶端分生组织分化相对缓慢，以致于诱导成活率较低，应尽量避免这些时期取材。
在茎尖培养过程中，培養基是影响茎尖成活率以及苗木状态的主要因素之一，当然，同一属的不同种以及不同品种对培养基的反映有所不同，使用的培养基不能同一而论[7-9]。植物激素是影响茎尖诱导和增殖的关键因子之一，在组织培养中起重要作用。林静等[10]利用杜梨子叶诱导不定芽，结果显示，培养基和激素浓度对丛生芽诱导起关键性作用，而生长素NAA对愈伤组织的生长起主要作用。只有选用合适的激素及质量浓度，才能获得理想的结果。该研究中对丛生芽诱导和增殖培养效果影响最大的是IBA，其次为6-BA，尤其6-BA与IBA的浓度比接近1时效果最好，这可能因品种的基因型而有所差异。
耐盐彩叶杜梨作为一种新型的适合沿海滩涂利用的彩叶树种，具有极高的观赏价值和市场前景。该试验以彩叶杜梨茎尖为外植体，初步建立了茎尖组培快繁技术体系，在保证生根成活率的同时，大大缩短了育苗周期，为实现耐盐彩叶杜梨优质组培苗工厂化生产和规模化开发提供了参考。
参考文献
[1] 张祺超，桂炳中，赵丽丽.华北地区盐碱地杜梨栽培[J].中国花卉园艺，2018（10）：57.
[2] 刘振廷，牛鹏斐，潘文明，等.杜梨砧木苗二次移植培育嫁接苗技术探讨[J].河北果树，2018（2）：7-8.
[3] 张盼飞.中条山65份杜梨资源遗传多样性分析及矮化特性评价[D].太谷：山西农业大学，2016.
[4] 桂平.珍稀观赏树种红豆树组织培养技术研究[D].贵阳：贵州大学，2018.
[5] 李艳霞，刘忠玲，刘建明，等.越橘品种‘Koralle’茎尖繁殖体系建立[J].东北林业大学学报，2018，46（3）：37-39，44.
[6] 范世杰，杨忠华，尹文龙，等.3种越橘（桔）茎尖初代培养与增殖研究[J].林业科技，2018，43（3）：5-9.
[7] 杨丽萍.卓尼县马铃薯培养基制作与组织培养[J].农业科技与信息，2017（23）：93-94.
[8] 赵会芳，陈姣.不同培养基对勿忘我组织培养的影响[J].农技服务，2017，34（23）：42，41.
[9] 秦梅，张燕，徐美恩，等.甘薯茎尖脱毒及组培快繁技术[J].安徽农业科学，2014，42（32）：11238-11239，11258.
[10] 林静，李疆，田嘉，等.杜梨子叶离体再生体系的建立[J].中国农学通报，2015，31（19）：41-47.