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摘要：目的：探讨湖南地区汉族人群中MMP-9基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的相关性。方法：在湖南地区汉族人群中采集169例2型糖尿病患者以及166名正常糖耐量志愿者外周血，提取基因组DNA。应用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和DNA直接测序技术鉴定MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因和基因型，分析等位基因频率在不同人群中的分布及其与2型糖尿病的相关性。结果：MMP-9基因C-1562-T位点等位基因在2型糖尿病和正常糖耐量人群中的分布频率分别为0.687、0.313和0.589、0.411（P<0.01），糖尿病人群中CC基因型比例显著高于正常糖耐量人群（P<0.01）。结论 MMP-9基因启动子区C-1562-T位点T等位基因及TT基因型与湖南地区汉族人群2型糖尿病的易感性密切相关。
关键词：汉族；MMP-9；2型糖尿病；基因多态性
【中图分类号】R781.6+4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）06-0098-02
前言
糖尿病（diabetes mellitus）是一种长期的慢性疾病，患者在长期的高血糖状况下，机体代谢发生紊乱，防御机制减弱，抗感染能力降低，且多合并微循环病变[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常见的类型，其特征为胰岛素作用异常和分泌障碍，可以任其一个方面为主，确切病因还不清楚[2]。基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9， MMP-9）又称为明胶酶B，是人类MMPs中分子量最大的酶，MMP-9可通过降解、破坏靠近肿瘤细胞表面的细胞外基质（extracellular matrix， ECM）和与基底膜（basement membrane， BM），促进肿瘤细胞的侵袭和转移灶形成，在恶性肿瘤发生发展中起重要作用[3]。新近有研究提示MMP-9基因多态性也与糖尿病及糖尿病的并发症有密切关联[4]，为此，本研究拟初步探讨MMP-9基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病之间的相关性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1一般资料 收集我院收治的门诊或住院2型糖尿病患者169例作为患者组，均符合WHO 1999年糖尿病的诊断和分型标准，排除各种糖尿病急性并发症，感染，严重肝、肾功能损害，恶性肿瘤和自身免疫性疾病。其中男性78例，女性91例；平均年龄（55.5±7.7）岁；平均病程（5.44±4.02）年。另采集162例来自我院体检中心及市中心血站的随机无亲缘关系的正常个体作为对照组，其中男性72例，女性94例；平均年龄（46.3±9.3）岁。患者组和对照组所有个体均为连续三代以上的湖南籍汉族人。
1.2主要儀器和试剂 人全血基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝）；Taq DNA polymerase、dNTPMixture、10×PCR buffer、50bp DNA Ladder Marker（北京索莱宝）；琼脂糖、限制性核酸内切酶SPH I（Biotech公司）；PCR引物合成（大连宝生物）。PCR仪（Bio-Rad MyCycler PTC240美国）；微型水平电泳槽（北京市六一仪器厂，DYY-H128B型）
1.3检测方法 采集受试者外周静脉血5 mL，按试剂盒说明抽提基因组DNA，所得DNA样品用紫外分光光度计测定其260nm/280nm OD值，检测DNA的纯度和含量。PCR扩增条件：95℃ 5min预变性，95℃ 45s→69℃ 45s→72℃ 45s（30cycles），72℃ 10min。MMP-9 C-1562-T位点引物：上游：5'-GCCTGGCACArAGTAGGCCC-3'；下游：5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3'。扩增完成后，将PCR产物酶切，酶切体系包括：PCR产物 5 μL，SPH I 1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，置37℃过夜。取上述酶切产物5 μL，加入上样缓冲液1 μL，混匀后经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。随机抽取20份扩增样本基因测序（华大基因）。
1.5统计学方法 所有数据均使用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，组间比较采用Student’s t检验，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义的标准。
2 结果
2.1 两组临床资料的比较 糖尿病组组与正常对照组的年龄、性别、BMI无显著性差异，但患者组的FPG、TG、CHO、VLDL、LDL明显高于对照组，而HDL显著低于正常对照组（P<0.05） （表1）。
2.2 MMP-9基因位点多态性检测结果 采用PCR-RFLP及DNA直接测序技术能正确鉴定出MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因和基因型（图1，图2）。
2.3 两组MMP-9基因多态性的比较 应用上述方法鉴定出所有研究对象MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因和基因型，并进一步统计分析后，结果发现：两组MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因型CC/CT/TT的分布存在差异，患者组中的CT和TT基因型频率显著高于对照组（P<0.05）；两组MMP-9基因启动子区C-1562-T位点等位基因C/T的分布存在差异，患者组中T基因频率显著高于对照组（P<0.05）（表2）。
3 讨论
随着人们生活水平的提高，2型糖尿病（Type 2 Diabetes， T2D）的发病率明显增加，严重影响人们的生活质量。胰岛素抵抗（insulin resistance， IR）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌 （glucose stimulated insulin secretion， GSIS）受损是导致T2D发展的2个主要因素[5]。新近研究显示认为T2D是一种自然免疫和低度炎症性疾病，其发生发展与的炎症反应以及胰岛中的血管损伤密切相关[6]。基质金属蛋白酶（MMPs）一类活性依赖于Zn2+的和Ca2+的内肽酶超家族，可由体内多种细胞合成和分泌，它可以降解除多糖外的所有细胞外基质成分、促进细胞增殖、新生血管形成和组织重塑等，参与体内多种病理生理过程。 國内外大量研究证实MMP-9的表达水平和活性变化与糖尿病肾病的发生和发展有关[7]。研究发现2型糖尿病患者合并肾损害时血浆中MMP-9的水平升高，并发生于微量白蛋白尿之前，认为可作为DN的早期诊断指标。但随着尿蛋白排泄率的增加MMP-9逐渐减低，MMP-9/TIMP比值呈递减趋势，细胞外基质胶原降解逐渐减少，导致肾小球基底膜的增厚及细胞外基质的积聚，形成了糖尿病肾病的典型病理改变[8]。本研究采用PCR-RFLP和 DNA测序法检测了162例正常对照和169例T2D患者的MMP-9基因C-1562-T位点的等位基因和基因型分布。结果显示T2D患者组中C-1562-T位点T碱基出现频率显著高于正常对照组，这强烈提示1562-T突变与T2D的易感性相关。
糖尿病及其慢性并发症是一种遗传基因和内外环境综合作用而形成的多种病理过程参与的复杂的综合征。同一基因不同位点或序列的变异可能导致不同的影响，并且在不同的代谢因素、不同的组织器官中其转录和表达可能也有差异[9]。而MMP的活性变化对其不同的并发症的病理过程有不同的影响。例如在糖尿病肾病的治疗上，则需要根据其不同的发展阶段中MMP的活性不同变化选择MMP抑制或激活剂，而且在治疗动脉粥样硬化中过度抑制或激活MMPs活性均不利于动脉粥样硬化斑块的发展。从本研究对MMP-9基因C-1562-T位点的分析结果出发，我们认为TT基因型和T等位基因是2型糖尿病的易感基因，而CC基因型和C等位基因是其保护性基因，以此为基础，仍需一步更为深入的研究，以探索基因之间，基因与内外环境因素之间，基因与组织器官之间复杂的交互网络关系，揭开2型糖尿病发生和发展规律。
参考文献
[1] CN H， DJ B. Type 2 （non-insulin-dependent） diabetes mellitus： the thrifty phenotype hypothesis. 1992.[J]. International Journal of Epidemiology， 2013， 42（1）：5-20.
[2] A Puttanna MBChB M S， RNK Padinjakara MBBS M C D E. Diabetic ketoacidosis in type 2 diabetes mellitus[J]. Practical Diabetes， 2014， 31（4）：155–158.
[3] J V， PE V D S， G O. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）： the next decade.[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol， 2013， 48（3）：222-272.
[4] SW L， KE S， DS S， et al. Alterations in peripheral blood levels of TIMP-1， MMP-2， and MMP-9 in patients with type-2 diabetes[J]. Diabetes Research & Clinical Practice， 2005， 69（2）：175–179.
[5] Group I D F G D. Global guideline for type 2 diabetes.[J]. Diabetes Research & Clinical Practice， 2014， 104（1）.
[6] A Puttanna MBChB M S， RNK Padinjakara MBBS M C D E. Diabetic ketoacidosis in type 2 diabetes mellitus[J]. Practical Diabetes， 2014， 31（4）：155–158.
[7] PR M， PM T， S C， et al. Peripheral blood level alterations of TIMP-1， MMP-2 and MMP-9 in patients with Type 1 diabetes[J]. Diabetic Medicine， 2001， 18（10）：777-780（4）.
[8] Freije J M， Diez-Itza I， Balbín M， et al. Molecular cloning and expression of collagenase-3， a novel human matrix metalloproteinase produced by breast carcinomas[J]. Journal of Biological Chemistry， 1994， 269（24）： 16766-16773.
[9] Farran A， Tío L， Monfort J， et al. Verification of three different MMP-13 isoforms expression in human osteoarthritic cartilage[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2013， 21： S110-S110.
关键词：汉族；MMP-9；2型糖尿病；基因多态性
【中图分类号】R781.6+4 【文献标识码】A 【文章编号】1672-8602（2015）06-0098-02
前言
糖尿病（diabetes mellitus）是一种长期的慢性疾病，患者在长期的高血糖状况下，机体代谢发生紊乱，防御机制减弱，抗感染能力降低，且多合并微循环病变[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常见的类型，其特征为胰岛素作用异常和分泌障碍，可以任其一个方面为主，确切病因还不清楚[2]。基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9， MMP-9）又称为明胶酶B，是人类MMPs中分子量最大的酶，MMP-9可通过降解、破坏靠近肿瘤细胞表面的细胞外基质（extracellular matrix， ECM）和与基底膜（basement membrane， BM），促进肿瘤细胞的侵袭和转移灶形成，在恶性肿瘤发生发展中起重要作用[3]。新近有研究提示MMP-9基因多态性也与糖尿病及糖尿病的并发症有密切关联[4]，为此，本研究拟初步探讨MMP-9基因的单核苷酸多态性与2型糖尿病之间的相关性，现报道如下。
1 材料与方法
1.1一般资料 收集我院收治的门诊或住院2型糖尿病患者169例作为患者组，均符合WHO 1999年糖尿病的诊断和分型标准，排除各种糖尿病急性并发症，感染，严重肝、肾功能损害，恶性肿瘤和自身免疫性疾病。其中男性78例，女性91例；平均年龄（55.5±7.7）岁；平均病程（5.44±4.02）年。另采集162例来自我院体检中心及市中心血站的随机无亲缘关系的正常个体作为对照组，其中男性72例，女性94例；平均年龄（46.3±9.3）岁。患者组和对照组所有个体均为连续三代以上的湖南籍汉族人。
1.2主要儀器和试剂 人全血基因组DNA提取试剂盒（北京索莱宝）；Taq DNA polymerase、dNTPMixture、10×PCR buffer、50bp DNA Ladder Marker（北京索莱宝）；琼脂糖、限制性核酸内切酶SPH I（Biotech公司）；PCR引物合成（大连宝生物）。PCR仪（Bio-Rad MyCycler PTC240美国）；微型水平电泳槽（北京市六一仪器厂，DYY-H128B型）
1.3检测方法 采集受试者外周静脉血5 mL，按试剂盒说明抽提基因组DNA，所得DNA样品用紫外分光光度计测定其260nm/280nm OD值，检测DNA的纯度和含量。PCR扩增条件：95℃ 5min预变性，95℃ 45s→69℃ 45s→72℃ 45s（30cycles），72℃ 10min。MMP-9 C-1562-T位点引物：上游：5'-GCCTGGCACArAGTAGGCCC-3'；下游：5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3'。扩增完成后，将PCR产物酶切，酶切体系包括：PCR产物 5 μL，SPH I 1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，置37℃过夜。取上述酶切产物5 μL，加入上样缓冲液1 μL，混匀后经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。随机抽取20份扩增样本基因测序（华大基因）。
1.5统计学方法 所有数据均使用SPSS 13.0软件包进行统计学分析，组间比较采用Student’s t检验，率的比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义的标准。
2 结果
2.1 两组临床资料的比较 糖尿病组组与正常对照组的年龄、性别、BMI无显著性差异，但患者组的FPG、TG、CHO、VLDL、LDL明显高于对照组，而HDL显著低于正常对照组（P<0.05） （表1）。
2.2 MMP-9基因位点多态性检测结果 采用PCR-RFLP及DNA直接测序技术能正确鉴定出MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因和基因型（图1，图2）。
2.3 两组MMP-9基因多态性的比较 应用上述方法鉴定出所有研究对象MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因和基因型，并进一步统计分析后，结果发现：两组MMP-9基因启动子区C-1562-T位点的等位基因型CC/CT/TT的分布存在差异，患者组中的CT和TT基因型频率显著高于对照组（P<0.05）；两组MMP-9基因启动子区C-1562-T位点等位基因C/T的分布存在差异，患者组中T基因频率显著高于对照组（P<0.05）（表2）。
3 讨论
随着人们生活水平的提高，2型糖尿病（Type 2 Diabetes， T2D）的发病率明显增加，严重影响人们的生活质量。胰岛素抵抗（insulin resistance， IR）和葡萄糖刺激的胰岛素分泌 （glucose stimulated insulin secretion， GSIS）受损是导致T2D发展的2个主要因素[5]。新近研究显示认为T2D是一种自然免疫和低度炎症性疾病，其发生发展与的炎症反应以及胰岛中的血管损伤密切相关[6]。基质金属蛋白酶（MMPs）一类活性依赖于Zn2+的和Ca2+的内肽酶超家族，可由体内多种细胞合成和分泌，它可以降解除多糖外的所有细胞外基质成分、促进细胞增殖、新生血管形成和组织重塑等，参与体内多种病理生理过程。 國内外大量研究证实MMP-9的表达水平和活性变化与糖尿病肾病的发生和发展有关[7]。研究发现2型糖尿病患者合并肾损害时血浆中MMP-9的水平升高，并发生于微量白蛋白尿之前，认为可作为DN的早期诊断指标。但随着尿蛋白排泄率的增加MMP-9逐渐减低，MMP-9/TIMP比值呈递减趋势，细胞外基质胶原降解逐渐减少，导致肾小球基底膜的增厚及细胞外基质的积聚，形成了糖尿病肾病的典型病理改变[8]。本研究采用PCR-RFLP和 DNA测序法检测了162例正常对照和169例T2D患者的MMP-9基因C-1562-T位点的等位基因和基因型分布。结果显示T2D患者组中C-1562-T位点T碱基出现频率显著高于正常对照组，这强烈提示1562-T突变与T2D的易感性相关。
糖尿病及其慢性并发症是一种遗传基因和内外环境综合作用而形成的多种病理过程参与的复杂的综合征。同一基因不同位点或序列的变异可能导致不同的影响，并且在不同的代谢因素、不同的组织器官中其转录和表达可能也有差异[9]。而MMP的活性变化对其不同的并发症的病理过程有不同的影响。例如在糖尿病肾病的治疗上，则需要根据其不同的发展阶段中MMP的活性不同变化选择MMP抑制或激活剂，而且在治疗动脉粥样硬化中过度抑制或激活MMPs活性均不利于动脉粥样硬化斑块的发展。从本研究对MMP-9基因C-1562-T位点的分析结果出发，我们认为TT基因型和T等位基因是2型糖尿病的易感基因，而CC基因型和C等位基因是其保护性基因，以此为基础，仍需一步更为深入的研究，以探索基因之间，基因与内外环境因素之间，基因与组织器官之间复杂的交互网络关系，揭开2型糖尿病发生和发展规律。
参考文献
[1] CN H， DJ B. Type 2 （non-insulin-dependent） diabetes mellitus： the thrifty phenotype hypothesis. 1992.[J]. International Journal of Epidemiology， 2013， 42（1）：5-20.
[2] A Puttanna MBChB M S， RNK Padinjakara MBBS M C D E. Diabetic ketoacidosis in type 2 diabetes mellitus[J]. Practical Diabetes， 2014， 31（4）：155–158.
[3] J V， PE V D S， G O. Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）： the next decade.[J]. Crit Rev Biochem Mol Biol， 2013， 48（3）：222-272.
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[9] Farran A， Tío L， Monfort J， et al. Verification of three different MMP-13 isoforms expression in human osteoarthritic cartilage[J]. Osteoarthritis and Cartilage， 2013， 21： S110-S110.