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摘 要：对一株产纤维素酶的黄曲霉进行发酵条件优化和酶学性质初步探究，利用DNS法测定CMC酶活、滤纸酶活，结果显示此菌株纤维素酶最佳反应温度为50℃，最佳反应pH为7.0。在金属离子中，发现Zn2+具有抑制作用，最大抑制浓度为0.4 mg/mL，Mg2+、Mn2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+具有促进作用，最适浓度分别为0.4、1、1、0.8、1.4 mg/mL。蛋白胨和酵母粉具有促进作用，最适浓度分别为1.0%、0.6%，最适pH为6.0。综合优化后，测得滤纸酶活和CMC酶活分别为7.73 U/mL、11.28 U/mL，相比优化前提高了38.8%和43.7%。
关键词：纤维素；CMC酶活；滤纸酶活；发酵条件优化
每年，地球上植物通过光合作用净生成至少有 10 亿吨能源物质，其中大部分为纤维类物质。那些纤维素类物质经过工艺化处理，被分解为糖类，比如葡萄糖、麦芽糖，并可进一步转化为燃料乙醇。利用纤维素和半纤维素，其关键步骤是水解纤维成分，即将植物细胞壁中的碳水化合物降解成还原糖，而纤维素酶为该关键步骤中唯一催化酶[1]。
现在， 有很多能够降解纤维素的微生物， 其中我们最熟悉的是真菌， 如木霉属、曲霉属、青霉属，对细菌、放线菌研究较少。分离、筛选能够高产纤维素酶， 有效降解纤维素的微生物，是利用纤维素材料的重要前提， 对解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远的意义[2—4]。
因此，本实验对从土壤中筛选出一种纤维素酶活性较高的黄曲霉，对其酶学性质初步探究，为今后的研究做好基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
黄曲霉保存于贵州师范大学生命科学学院微生物实验室。
1.1.2 培养基
活化培养基：PDA
发酵培养基：KNO3 2g，NaCl 1g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 1g，乳酸 0.2%，羧甲基纤维素钠 1%，H2O 1000mL，pH自然，121℃灭菌30min。
1.1.3 试剂
DNS溶液[9]，pH 4.8柠檬酸钠缓冲液[10]，1%羧甲基纤维素钠溶液（用pH 4.8柠檬酸钠缓冲液配制），1 mol/L NaOH 溶液，1 mol/L HCl 溶液，1 mg/mL 葡萄糖标准溶液。
1.2 方法
1.2.1 制备粗酶液
先将目的菌株接种到PDA种子活化培养基内培养24h，然后按2.5%接种量，接到50mL发酵培养基内，摇床参数设置为28℃，120r/min，培养72h，取上清液，离心5min，转速5400r/min。
1.2.2 纤维素酶活测定
酶活定义：在50 ℃条件下，每分钟每毫升酶液水解含纤维素底物释放出1 μmol 葡萄糖的酶量为1 个酶活单位（U）。
CMC酶活： 将一定量种子液加入液体培养基发酵72h，28℃。取0.5 mL待测酶液（空白对照不加），加入到1.5mL按上述条件配好的1%羧甲基纤维素钠溶液中50℃，水浴锅中反应0.5h，然后，加入1 mL DNS显色，空白对照加入0.5 mL待测酶液后，沸水浴5min，待溶液冷却后定容至20mL，分光光度计测OD值，跟葡萄糖标准曲线对比，算出酶活。
滤纸酶活：先将滤纸剪成长为1.5cm，宽为0.5cm的滤纸条，折出v字型，放入灭菌的培养皿内，在60℃恒温培养箱里干燥30min，然后在每只试管内放入3张滤纸条，保证交叉放置，再加入0.5mL待测酶液（空白管不加），加入缓冲液1.5mL，在50℃水浴锅中反应0.5h后，向各管中加入1mL DNS溶液，空白管加入0.5mL待测酶液，沸水浴中5min，冷却后定容至20mL，分光光度计测OD值，跟葡萄糖标准曲线对比，算出酶活。
酶活计算公式：I=m×n×5 .56v×t
式中，I为酶活（U）；m为葡萄糖生成量（mg）；v为反应液中酶液加入量（mL）；n为样品的稀释倍数；t 为反应时间（min）。
1.2.3 反应温度和pH对纤维素酶的影响
反应温度设置3个梯度，分别为40℃、50℃、60℃；pH设置5个梯度，分别为4、5、6、7、8，温度用水浴锅控制，pH梯度用pH4.8的柠檬酸钠缓冲液和1 mol/L的NaOH溶液调制，分别测定各个条件下的CMC酶活和滤纸酶活。
1.2.4 金属离子的纤维素酶活的影响
选取6种金属离子：Zn2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ca2+，每种金属离子设置8个梯度，浓度分别为（mg/mL）：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6，以不添加金属离子的发酵培养基为对照；pH设置6个梯度：4、5、6、7、8、9；蛋白胨设置8个梯度，含量为：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；酵母粉设置4个梯度：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，按照这些条件配制发酵培养基，在摇床上，28℃，120r/min，发酵72h后，测定滤纸酶活。
2 结果与分析
2.1 发酵条件对纤维素酶活的影响
2.1.1 发酵pH对纤维素酶活的影响
用缓冲液对发酵液pH进行控制，pH分别是4、5、6、7、8、9。摇床培养72h，制备粗酶液，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图1可以得出，此菌株濾纸酶活在发酵pH为6.0时酶活最高，为6.56 U/mL。在最适pH6两侧，酶活都普遍下降，所以此菌株的最适发酵pH为6。
2.1.2 蛋白胨对纤维素酶活的影响 在发酵培养基中加入不同浓度的蛋白胨，摇床培养72h，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图2可以得出，蛋白胨对纤维素酶的促进作用不明显，只对纤维素酶活提高不多。在蛋白胨浓度为1.0%，酶活最大，为6.52 U/mL，在最适浓度两侧，下降趋势较平缓。
2.1.3 酵母粉对纤维素酶活的影响
在发酵培养基中加入不同浓度的酵母粉，摇床培养72h，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图3可以得出，酵母粉对滤纸酶活有一定的促进作用，最适浓度为0.6%，此时酶活为7.61 U/mL，与蛋白胨相比，促進效果更明显。
2.2 金属离子对纤维素酶活的影响
不同浓度Mg2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+分别加在发酵培养基内，摇床上发酵72h后，制备粗酶液，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图4可以得出，Mg2+对纤维素酶具有促进作用，最适浓度为0.4mg/mL，此时酶活为6337 U/mL，在越过最适浓度后，促进作用比较平缓；Fe3+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为0.8mg/mL，此时酶活为6519 U/mL，相对于Mg2+来说，Fe3+的促进作用比较明显；Zn2+对纤维素酶具有抑制作用，最大抑制浓度0.4mg/mL，此时酶活为5.70 U/mL，整体抑制趋势比较平缓，波动不大；Mn2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1mg/mL，此时酶活为7.11 U/mL，Mn2+在金属离子当中促进效果最高，整体走势较明显；Fe2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1.4mg/mL，此时酶活为6.29 U/mL，没有Fe3+的促进效果好，整体趋势较平稳；Ca2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1mg/mL，此时酶活为6.56 U/mL，激活效果仅次于Mn2+，整体趋势明显。总之因为金属离子各不相同，所以对纤维素酶活的影响也各不相同，由高到低排列为Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。
2.3 酶学性质的研究
2.3.1 反应温度对纤维素酶活的影响
经过发酵培养基发酵36h后，在不同反应温度下测定滤纸酶活和CMC酶活，结果如下：
通过表1可以看出50℃是CMC酶活和滤纸酶活都高于40℃和60℃，因此此菌株纤维素酶活性最适反应温度为50℃。
2.3.2 反应pH对纤维素酶活的影响
经过发酵培养基发酵36h后，测定滤纸酶活和CMC酶活，结果如下：
通过表2可以看出，此菌株纤维素酶活性最适反应pH为7.0，酸性和碱性条件对纤维素酶活都有一定的降低。在pH7.0时CMC酶活和滤纸酶活达到最大，分别是5.92和2.99U/mL。
3 结论
根据以上发酵条件所得出的最适条件，选择Mn2+ 1.0mg/mL，酵母粉0.6%，加入到发酵培养基内，pH调到6.0，发酵72h后，测得滤纸酶活和CMC酶活分别为7.73 U/mL、11.28 U/mL，相比优化前提高了38.8%和43.7%。金属离子对纤维素酶活的影响，由高到低排列为Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。
参考文献：
[1]赵燕.高效纤维素酶高产菌的筛选及相关研究[D].武汉科技大学，2013.
[2]穆春雷，武晓森，李术娜，马鸣超，李俊，沈德龙，朱宝成.低温产纤维素酶菌株的筛选、鉴定及纤维素酶学性质[J].微生物学通报，2013，07：11931201.
[3]陈丽燕，张光祥，黄春萍，熊艳，李敏，常丽梅，张晓喻.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性[J].微生物学通报，2011，04：531538.
[4]郑惠华，陈惠，张志才.高温纤维素分解菌筛选及JSU5产纤维素酶条件的优化[J].药物生物技术，2009，（03）：237240.
[5]吴杨林.里氏木霉产纤维素酶的条件优化[D].南京林业大学，2013.
[6]董志刚.高温放线菌纤维素酶的研究[D].广西大学，2006.
[7]郑虹，邓加聪，谢颖灵.一株高温纤维素酶放线菌的筛选及发酵条件优化[J].闽江学院学报，2015，（05）：100108.
[8]李德莹，龚大春，田毅红，余燕.金属离子对纤维素酶活力影响的研究[J].酿酒科技，2009，06：4042+46.
[9]王琳，刘国生，王林嵩，张志宏，侯进怀，郭惠敏. DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究[J].河南师范大学学报（自然科学版），1998，（03）：6972.
[10]陆晨.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件的优化[D].中南林业科技大学，2012.
[11]魏艳红.纤维素酶产生菌的分离鉴定及产酶条件优化[D].华中师范大学，2009.
基金项目：大学生创新创业训练计划（项目：201510663002）
关键词：纤维素；CMC酶活；滤纸酶活；发酵条件优化
每年，地球上植物通过光合作用净生成至少有 10 亿吨能源物质，其中大部分为纤维类物质。那些纤维素类物质经过工艺化处理，被分解为糖类，比如葡萄糖、麦芽糖，并可进一步转化为燃料乙醇。利用纤维素和半纤维素，其关键步骤是水解纤维成分，即将植物细胞壁中的碳水化合物降解成还原糖，而纤维素酶为该关键步骤中唯一催化酶[1]。
现在， 有很多能够降解纤维素的微生物， 其中我们最熟悉的是真菌， 如木霉属、曲霉属、青霉属，对细菌、放线菌研究较少。分离、筛选能够高产纤维素酶， 有效降解纤维素的微生物，是利用纤维素材料的重要前提， 对解决当今世界所面临的粮食短缺、饲料资源紧张、能源危机和环境污染等问题具有深远的意义[2—4]。
因此，本实验对从土壤中筛选出一种纤维素酶活性较高的黄曲霉，对其酶学性质初步探究，为今后的研究做好基础工作。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
黄曲霉保存于贵州师范大学生命科学学院微生物实验室。
1.1.2 培养基
活化培养基：PDA
发酵培养基：KNO3 2g，NaCl 1g，MgSO4 0.5g，KH2PO4 1g，Na2HPO4 1g，乳酸 0.2%，羧甲基纤维素钠 1%，H2O 1000mL，pH自然，121℃灭菌30min。
1.1.3 试剂
DNS溶液[9]，pH 4.8柠檬酸钠缓冲液[10]，1%羧甲基纤维素钠溶液（用pH 4.8柠檬酸钠缓冲液配制），1 mol/L NaOH 溶液，1 mol/L HCl 溶液，1 mg/mL 葡萄糖标准溶液。
1.2 方法
1.2.1 制备粗酶液
先将目的菌株接种到PDA种子活化培养基内培养24h，然后按2.5%接种量，接到50mL发酵培养基内，摇床参数设置为28℃，120r/min，培养72h，取上清液，离心5min，转速5400r/min。
1.2.2 纤维素酶活测定
酶活定义：在50 ℃条件下，每分钟每毫升酶液水解含纤维素底物释放出1 μmol 葡萄糖的酶量为1 个酶活单位（U）。
CMC酶活： 将一定量种子液加入液体培养基发酵72h，28℃。取0.5 mL待测酶液（空白对照不加），加入到1.5mL按上述条件配好的1%羧甲基纤维素钠溶液中50℃，水浴锅中反应0.5h，然后，加入1 mL DNS显色，空白对照加入0.5 mL待测酶液后，沸水浴5min，待溶液冷却后定容至20mL，分光光度计测OD值，跟葡萄糖标准曲线对比，算出酶活。
滤纸酶活：先将滤纸剪成长为1.5cm，宽为0.5cm的滤纸条，折出v字型，放入灭菌的培养皿内，在60℃恒温培养箱里干燥30min，然后在每只试管内放入3张滤纸条，保证交叉放置，再加入0.5mL待测酶液（空白管不加），加入缓冲液1.5mL，在50℃水浴锅中反应0.5h后，向各管中加入1mL DNS溶液，空白管加入0.5mL待测酶液，沸水浴中5min，冷却后定容至20mL，分光光度计测OD值，跟葡萄糖标准曲线对比，算出酶活。
酶活计算公式：I=m×n×5 .56v×t
式中，I为酶活（U）；m为葡萄糖生成量（mg）；v为反应液中酶液加入量（mL）；n为样品的稀释倍数；t 为反应时间（min）。
1.2.3 反应温度和pH对纤维素酶的影响
反应温度设置3个梯度，分别为40℃、50℃、60℃；pH设置5个梯度，分别为4、5、6、7、8，温度用水浴锅控制，pH梯度用pH4.8的柠檬酸钠缓冲液和1 mol/L的NaOH溶液调制，分别测定各个条件下的CMC酶活和滤纸酶活。
1.2.4 金属离子的纤维素酶活的影响
选取6种金属离子：Zn2+、Mg2+、Fe3+、Fe2+、Mn2+、Ca2+，每种金属离子设置8个梯度，浓度分别为（mg/mL）：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6，以不添加金属离子的发酵培养基为对照；pH设置6个梯度：4、5、6、7、8、9；蛋白胨设置8个梯度，含量为：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%；酵母粉设置4个梯度：0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，按照这些条件配制发酵培养基，在摇床上，28℃，120r/min，发酵72h后，测定滤纸酶活。
2 结果与分析
2.1 发酵条件对纤维素酶活的影响
2.1.1 发酵pH对纤维素酶活的影响
用缓冲液对发酵液pH进行控制，pH分别是4、5、6、7、8、9。摇床培养72h，制备粗酶液，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图1可以得出，此菌株濾纸酶活在发酵pH为6.0时酶活最高，为6.56 U/mL。在最适pH6两侧，酶活都普遍下降，所以此菌株的最适发酵pH为6。
2.1.2 蛋白胨对纤维素酶活的影响 在发酵培养基中加入不同浓度的蛋白胨，摇床培养72h，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图2可以得出，蛋白胨对纤维素酶的促进作用不明显，只对纤维素酶活提高不多。在蛋白胨浓度为1.0%，酶活最大，为6.52 U/mL，在最适浓度两侧，下降趋势较平缓。
2.1.3 酵母粉对纤维素酶活的影响
在发酵培养基中加入不同浓度的酵母粉，摇床培养72h，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图3可以得出，酵母粉对滤纸酶活有一定的促进作用，最适浓度为0.6%，此时酶活为7.61 U/mL，与蛋白胨相比，促進效果更明显。
2.2 金属离子对纤维素酶活的影响
不同浓度Mg2+、Fe3+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Ca2+分别加在发酵培养基内，摇床上发酵72h后，制备粗酶液，测定滤纸酶活，结果如下：
通过图4可以得出，Mg2+对纤维素酶具有促进作用，最适浓度为0.4mg/mL，此时酶活为6337 U/mL，在越过最适浓度后，促进作用比较平缓；Fe3+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为0.8mg/mL，此时酶活为6519 U/mL，相对于Mg2+来说，Fe3+的促进作用比较明显；Zn2+对纤维素酶具有抑制作用，最大抑制浓度0.4mg/mL，此时酶活为5.70 U/mL，整体抑制趋势比较平缓，波动不大；Mn2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1mg/mL，此时酶活为7.11 U/mL，Mn2+在金属离子当中促进效果最高，整体走势较明显；Fe2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1.4mg/mL，此时酶活为6.29 U/mL，没有Fe3+的促进效果好，整体趋势较平稳；Ca2+对纤维素酶具有激活作用，最适浓度为1mg/mL，此时酶活为6.56 U/mL，激活效果仅次于Mn2+，整体趋势明显。总之因为金属离子各不相同，所以对纤维素酶活的影响也各不相同，由高到低排列为Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。
2.3 酶学性质的研究
2.3.1 反应温度对纤维素酶活的影响
经过发酵培养基发酵36h后，在不同反应温度下测定滤纸酶活和CMC酶活，结果如下：
通过表1可以看出50℃是CMC酶活和滤纸酶活都高于40℃和60℃，因此此菌株纤维素酶活性最适反应温度为50℃。
2.3.2 反应pH对纤维素酶活的影响
经过发酵培养基发酵36h后，测定滤纸酶活和CMC酶活，结果如下：
通过表2可以看出，此菌株纤维素酶活性最适反应pH为7.0，酸性和碱性条件对纤维素酶活都有一定的降低。在pH7.0时CMC酶活和滤纸酶活达到最大，分别是5.92和2.99U/mL。
3 结论
根据以上发酵条件所得出的最适条件，选择Mn2+ 1.0mg/mL，酵母粉0.6%，加入到发酵培养基内，pH调到6.0，发酵72h后，测得滤纸酶活和CMC酶活分别为7.73 U/mL、11.28 U/mL，相比优化前提高了38.8%和43.7%。金属离子对纤维素酶活的影响，由高到低排列为Mn2+>Ca2+>Fe3+>Mg2+>Fe2+>Zn2+。
参考文献：
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[3]陈丽燕，张光祥，黄春萍，熊艳，李敏，常丽梅，张晓喻.两株高产纤维素酶细菌的筛选、鉴定及酶学特性[J].微生物学通报，2011，04：531538.
[4]郑惠华，陈惠，张志才.高温纤维素分解菌筛选及JSU5产纤维素酶条件的优化[J].药物生物技术，2009，（03）：237240.
[5]吴杨林.里氏木霉产纤维素酶的条件优化[D].南京林业大学，2013.
[6]董志刚.高温放线菌纤维素酶的研究[D].广西大学，2006.
[7]郑虹，邓加聪，谢颖灵.一株高温纤维素酶放线菌的筛选及发酵条件优化[J].闽江学院学报，2015，（05）：100108.
[8]李德莹，龚大春，田毅红，余燕.金属离子对纤维素酶活力影响的研究[J].酿酒科技，2009，06：4042+46.
[9]王琳，刘国生，王林嵩，张志宏，侯进怀，郭惠敏. DNS法测定纤维素酶活力最适条件研究[J].河南师范大学学报（自然科学版），1998，（03）：6972.
[10]陆晨.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件的优化[D].中南林业科技大学，2012.
[11]魏艳红.纤维素酶产生菌的分离鉴定及产酶条件优化[D].华中师范大学，2009.
基金项目：大学生创新创业训练计划（项目：201510663002）