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摘要：【目的】研究印楝诱抗烟草炭疽病的机理，为烟草炭疽病的生物防治提供理论依据。【方法】测定根施印楝种子粉末对烟草炭疽病的防效，采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测印楝种子粉末处理后烟草的NTF6、NtLox、NtSGT1、NtPAL、NtPDF、NPR1、NtRar1和PR1a等8个相关抗病基因的表达变化;对比叶面喷施不同印楝种子提取物（甲醇、乙酸乙酯和石油醚）溶液对烟草抗氧化酶活性的影响，并测定叶面喷施印楝种子甲醇提取物不同分离流分处理的烟叶总酚含量及抗炭疽病效果。【结果】根施印楝种子粉末可使烟草炭疽病的病情指数（26.67%）较对照（74.17%）显著降低（P<0.05，下同）。qRT-PCR检测结果表明，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等4个抗病基因的相对表达量与印楝诱导烟草抗炭疽病相关。印楝种子甲醇提取物对烟草抗氧化酶活性的影响最大，其丙酮流分段在处理后6和96 h诱导烟草的总酚含量较对照明显提高，分别为对照的2.52和3.34倍，且其诱导烟草抗炭疽病的能力最强，病情指数（25.00%）显著低于对照（69.17%）。【结论】印楝种子提取物通过诱导提高PPO和POD抗病相关酶活性及诱导NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相关基因的表达产生抗炭疽病作用，且诱导活性成分主要存在于甲醇提取物的丙酮流分，其可作为烟草炭疽病的诱抗剂推广应用于烟草生产。
关键词： 烟草;炭疽病;印楝种子粗提物;诱导抗性;抗性机理
中图分类号： S572.01 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0524-09
0 引言
【研究意义】烟草炭疽病（Colletotrichum nicotia-nae Av. Sacca）是烟草的主要病害之一（孔凡彬等，2006）。目前防治烟草炭疽病仍以化学防治为主，由于缺乏对炭疽病抗药性状况的了解，一味增加用药量及用药次数，极易对环境造成污染，并引起病菌抗药性，特别是烟叶农药残留偏高，给烟叶出口和卷烟安全性带来不利影响（董志坚等，2004）。植物诱抗剂能诱导植物产生抗病性，且具有系统性、广谱性、安全性和持续性等特点，近年来已逐渐成为绿色农药开发的重要方向（刘勇鹏等，2017）。印楝（Azadirachta indica A. Juss）是世界上公认的最优秀生物农药之一。印楝可杀虫、抗菌和治病，在农业、园艺、花卉栽培、化妆品和医药等方面具有重要应用价值（Amadioha，1998），且其活性成分在自然界中无累积，对环境安全，对作物不产生药害，特别适用于蔬菜、水果、烟草和茶叶等直接食用的作物（徐汉虹等，2017）。因此，探究印楝诱导烟草抗炭疽病的机理具有重要理论意义和应用价值，并为印楝在防治烟草炭疽病中的应用提供理论依据。【前人研究进展】吴钜文和陈建峰（2002）研究表明，印楝制剂Tril-ogy[?]和Triac[?] 90% EC可用于防治果树和作物的斑点落叶病、炭疽病及早疫病等真菌病害。赵淑英等（2004）比较了印楝素和苦楝素对4种常见植物病原菌的抑制效果，结果表明印楝素和苦楝素均具有较好的抑菌活性，且印楝素的抑菌活性明显高于苦楝素，其中以甲醇提取物的活性最高。林靖凌等（2008）发现印楝的甲醇提取物对番木瓜炭疽病病原菌的抑制率可达39.72%。叶敏等（2009）研究表明，在一定时间范围内，印楝素对植物病原菌菌丝生长的抑制率随时间延长逐渐增加，但各供试病原菌抑制率随时间延长而增加的速率存在差异。江厚龙等（2014）研究发现，诱抗剂处理后的烟草叶片，其抗性相关酶[过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）]活性均有所提高。赖多等（2017）研究发现，印楝渣生物药肥可有效控制香蕉枯萎病，且可促进香蕉的生长。杨鑫等（2018）研究发现，植物诱抗剂可通过增强抗氧化酶的活性及降低细胞膜脂质过氧化[丙二醛（MDA）含量]来激活植株的系统抗病性。【本研究切入点】印楝种子提取获得的印楝素一直是农药学的研究热点，国内外有关印楝素和印楝的文献报道已有2000多篇（徐汉虹等，2017），但针对印楝提取物在烟草炭疽病防治方面的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以烟草品种K326为试验材料，研究印楝对烟草炭疽病的诱抗作用，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术探究8个相关抗病基因的诱导表达，并测定印楝粗提物对烟草抗氧化酶活性和总酚含量变化的影响及烟草炭疽病诱导抗病效果，为利用印楝进行烟草炭疽病的生物防治提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试烟草品种K326由广东烟草南雄科学研究所提供。印楝种仁采集自四川，低温干燥，粉碎过20目筛。烟草炭疽病菌（C. nicotianae）由华南农业大学植物病理研究室提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 印楝诱导烟草炭疽病抗性测定
1. 2. 1. 1 烟苗培育 参照李海宾和于嘉（2012）的方法在华南农业大学温室进行烟苗培育，以大田土壤装钵，每钵1000 g，在14～24 ℃、光照12 h/d、湿度30%条件下育苗，每周施一次营养液，每钵约50 mL。
1. 2. 1. 2 接种菌液制备 参照李东升（2010）的方法，将炭疽病病原菌接种在PDA培养基上（200 g/L马铃薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L琼脂）28 ℃培养7 d，待充分产孢后，加入含0.02%（v/v）吐温-20的无菌水10 mL浸泡15 min，用无菌棉签洗下孢子和菌丝体，经无菌脱脂棉过滤，除去菌丝体，稀释成1×107个/mL的孢子悬浮液。
1. 2. 1. 3 接种方法 烟苗培养至5～6片叶时，以每株烟草根施60 g印楝种子粉末为处理，以不施用印楝种子粉末为对照。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%条件下保湿3 d后接种。接种方法参照宾金华等（2000）方法，烟草叶片表面用无菌水擦拭干净，将少量细金刚砂（600目）撒在待接种的烟草叶面上，手指在叶面上轻轻摩擦，然后用1×107个/mL的炭疽病孢子悬浮液涂抹于叶片表面直至形成一层水膜，接种后放置在温度25～26 ℃、湿度55%～60%的恒温箱中黑暗培育12 h，黑暗处理后放回温室中培育，温室中提供稳定光源，光照时间为12 h/d，温度控制在25～26 ℃，湿度为55%～60%。每處理接种30株烟苗，发病后逐株调查病情指数。 1. 2. 1. 4 植株病情调查 参照王金华（2005）的方法，以病斑扩展垂直两个方向的平均宽度计算单个病斑的直径（d），进而计算每个接种斑点的面积，病斑面积（mm2）=3.14×（d/2）2。
炭疽病病情分级标准（陈瑞泰等，1997）：0级，全叶无病;1级，病斑面积占整片叶的5%以下;2级，病斑面积占整片叶的5%～10%;3级，病斑面积占整片叶的10%～25%;4级，病斑面积占整片叶的25% 以上。
病性指数=[（病株数×发病级数）总株数×最高发病级别数]×100
1. 2. 2 印楝诱导烟草抗性相关基因表达测定
1. 2. 2. 1 样品处理 温室培养至5～6片叶的K326烟苗，以每株根施60 g印楝种子粉末为处理，以不施用印楝种子粉末为对照。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%条件下保湿3 d后接种，在接种后1、3、5、7和9 d各取样1次，炭疽病接种试验和烟草的培养参考1.2.1。
1. 2. 2. 2 总RNA提取及cRNA合成 采用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa）提取处理后的烟草RNA，以RNA为模板利用逆转录试剂盒反转录合成第一条cDNA链，再利用DNA聚合酶合成第二条cDNA链。
1. 2. 2. 3 qRT-PCR检测 利用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）在TP900 Thermal Cycler DiceTM Real Time System（TaKaRa）上进行qRT-PCR检测，利用Premier 5.0设计特异性扩增引物（表1），由上海博尚生物技术有限公司合成。反应体系25.0 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，10.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，进行40个循环;72 ℃延伸10 min。在每一个循环的退火阶段收集荧光进行实时检测，反应结束后，得到含有所有标本的记录点曲线。最终显示的数据通过2-ΔΔCt方法，以β-actin为内参基因。对于每个样品，将两个相对独立的反转录反应合并在一起，所有的qRT-PCR检测均依据相同的合成cDNA。每次试验进行3次技术重复和3次生物学重复。
1. 2. 3 印楝种子粗提物对烟草POD、PPO和PAL活性的影响
1. 2. 3. 1 印楝种子有效成分提取 将印楝种仁低温干燥，粉碎过20目筛，取20 g粉末置于三角瓶中，分别用甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取浓缩滤液。甲醇提取物处理后为浅黄色粉末，乙酸乙酯提取物为褐色膏状物，石油醚提取物为油状物。将3种不同的印楝提取物分别置于冰箱内冷藏备用。
1. 2. 3. 2 烟草处理 烟草培养至5～6片叶时，分别喷施3种印楝萃取物配制成的溶液，以喷施清水为对照。每处理重复3次。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%下保湿3 d后接种。在接种后1、3、5、7、9和11 d分别取样1次，测定PLA、PPO和POD活性。
1. 2. 3. 3 粗酶液制备 PPO和POD粗酶液：取烟叶0.5 g，放入预冷研钵中液氮速冻，加入0.1 mol/L、 pH 6.8的磷酸缓冲液1.5 mL和少量石英砂，冰浴中研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于4 ℃、12000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，转入 5 mL试管待用。PAL粗酶液制备参照Gonzalez-Aguilar等（2004）的方法：取烟叶0.5 g，放入预冷的研钵中液氮速冻，加入0.1 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液（含5 mmol/L巯基乙醇、1 mmol/L EDTA及1% PVP）1.5 mL，在冰浴中研磨成匀浆，然后于4 ℃下12000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，转入5 mL试管待用。
1. 2. 3. 4 酶活性测定 PPO活性测定参照Tan和Harris（1995）的方法，反应体系：0.1 mL粗酶液、0.02 mol/L邻苯二酚溶液1.4 mL（用pH 6.8缓冲液配制）、1.5 mL磷酸缓冲液。对照组中以磷酸缓冲液代替粗酶液，其他同反应体系。室温下测定410 nm处吸光值，每30 s记录1次，连续测定3 min，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
POD活性测定参照李易兴（2016）的方法，反应体系：2.9 mL pH 6.0磷酸缓冲液、0.1 mL粗酶液、0.05 mol/L愈创木酚30 ?L（用pH 6.0磷酸缓冲液配制后于30 ℃水浴中保温10 min）、30%过氧化氢50 ?L。对照组中以磷酸缓冲液代替粗酶液，其他同反应体系。室温下测定470 nm处吸光值，每30 s记录1次，连续测定3 min，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
PAL活性测定参照杨光道等（2007）的方法，反应体系：0.2 mL酶液、1.0 mL硼酸缓冲液和0.02 mol/L L-苯丙氨酸1.0 mL。对照组中不加粗酶液而用0.2 mL硼酸缓冲液代替，其余同反应体系。反应体系于40 ℃水浴60 min，加入0.2 mL 6 mol/L HCI终止反应，随后测定OD290值，以OD值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
1. 2. 4 印楝种子甲醇提取物粗分离 取少量100～200目硅胶，置于研钵内，用少量丙酮溶解甲醇提取的印楝素干粉，并用滴管滴加到硅胶上，玻棒搅散，待丙酮挥发后将样品碾匀备用。
将200～300目硅胶G加到氯仿中，充分搅匀后转入玻璃层析柱中，静置过夜，检查柱中气泡情况，若状态良好，将拌入硅胶中的样品上柱，再加入2～3 cm厚的石英砂。流动相为氯仿、氯仿∶丙酮（体积比分别为95∶5、90∶10、1∶1）和丙酮，每次收集100 mL。以TLC点板顯色比较，分别合并相近的流分，将合并溶液减压蒸干备用。 1. 2. 5 总酚含量测定 采用福林—酚比色法测定多酚含量（田桂芝等，2015）。
1. 2. 6 印楝种子甲醇提取物各流分产物对烟草炭疽病抗性测定 将氯仿∶丙酮（体积比分别为95∶5、1∶1）和丙酮流分物质配成适宜浓度喷施在烟草上，12 h后用1×107个/mL的孢子悬浮液接种供试烟草叶片。接种方法和炭疽病发病情况统计参照1.2.1。
1. 3 统计分析
采用Excel 2007和SPSS 17.0对数据进行整理和统计分析。
2 结果与分析
2. 1 印楝诱导烟草炭疽病抗性测定结果
印楝诱导烟草炭疽病抗性试验结果（表2）显示，印楝处理的烟草炭疽病病情指数为26.67%，而对照的病情指数达74.17%，二者差异显著（P<0.05，下同）。这可能是由于印楝处理后的烟草具有诱导抗性，使得其病情指数显著低于对照，说明根施印楝种子粉末可有效提高烟草对炭疽病的抗性。
2. 2 印楝诱导烟草抗性基因的表达结果
qRT-PCR检测结果显示，接种烟草炭疽病菌后，对照烟叶中抗病相关基因NPR1、NTF6、Ntlox1、NtRar1、NtSGT1、PAL、PDF1.2和PR1a的表达变化均不明显。印楝处理的烟草叶片中，接种后第1 d NPR1基因的相对表达水平很低，接种后第3～5 d急剧升高，第3 d升至对照的2562倍，第5 d升至对照的10789倍，第7 d急剧降至接种后第1 d的水平，随后略有升高;NtRar1基因的表达水平在接种后第1 d略高于对照，第3 d时低于对照，至第5 d达峰值，为对照的10.15倍，接种后第7～9 d降至对照水平;NtSGT1基因的相对表达量在接种后第1～5 d变化不明显，且均低于对照，至第7 d时达峰值，为对照的12.76倍，接种后第9 d降低至对照水平;PR1a基因的表达水平在接种后第1 d达峰值，为对照的6872倍，第3 d时急剧降低，第5 d又略有升高，第7～9 d再次降低至对照水平;其他4个基因的表达水平在接种后9 d内略有波动，但整体变化不明显。
2. 3 印楝种子粗提物对烟草PPO、POD和PAL活性的影响
喷施不同溶剂萃取的印楝种子提取物溶液后，烟叶中PPO、POD和PAL活性表现各异。不同处理的PPO活性在接种后第1 d无明显差异;接种后第3 d，甲醇提取物处理的PPO活性达峰值，为对照的11.75倍，活性增加明显，其次为乙酸乙酯提取物处理，PPO活性也较对照明显增加，而石油醚提取物处理的PPO活性略高于对照;接种后第5～11 d，不同处理的PPO活性变化趋势不同，但整体上以甲醇提取物的PPO活性相对较高。不同处理的POD活性整体上呈先升高后降低再升高的变化趋势，其中甲醇提取物的POD活性在接种后第3 d达峰值，为对照的2.98倍，且明显高于其他处理;接种后第7～11 d也以甲醇提取物处理的POD活性整体较高。不同处理的PAL活性在接种后第1～11 d整体上呈升高—降低—升高—降低的变化趋势，各处理均在接种后第3 d达峰值，但同一接种时间下不同处理间无明显差异。综上所述，以甲醇提取物对烟草PPO和POD活性的提升效果较优。
2. 4 印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草总酚含量的影响
酚类化合物是许多植物体本身的固有成分，也是植物的次生代谢产物，在植物的抗病机制中发挥重要作用。通过测定印楝种子甲醇提取物各流分对烟叶总酚含量的影响，发现3组流分处理均可使烟叶总酚含量提高，均呈先升高后降低再升高的变化趋势。如图3所示，氯仿∶丙酮（95∶5）处理后2 h总酚含量达峰值（44.70 mg/gFW），为对照的2.63倍;氯仿∶丙酮（1∶1）处理后96 h总酚含量达峰值（123.77 mg/gFW），为对照的4.13倍;丙酮流分处理后第6和96 h烟叶总酚含量出现两个高峰（81.15和90.45 mg/gFW），分别为对照的2.52和3.34倍。
2. 5 印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草炭疽病抗性的影响
印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草炭疽病抗性的测定结果（表3）表明，3个处理的病情指数排序为丙酮<氯仿：丙酮（1：1）<氯仿：丙酮（95：5），抗性均顯著高于对照，尤其以丙酮流分处理的诱导抗性能力最强。
3 讨论
本研究采用印楝种子粉末进行烟苗根施处理，发现其可降低烟草炭疽病病情指数;进一步采用柱层析分离法，确定印楝种子粗提物诱导活性成分主要在印楝种子甲醇提取物的丙酮流分中。前人已有研究表明，印楝提取物可激活植物的抗病能力。本研究中，根施印楝种子粉末使烟草炭疽病的发病指数由74.17%降至26.67%，且qRT-PCR测定结果表明，在不同时间段可明显提高抗病基因NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a的表达量，其原因可能与印楝种子粉末可诱导烟草抗病相关。进一步对印楝种子的甲醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物诱导烟草的PPO、POD和PAL活性进行分析，发现印楝种子提取物不同有机溶剂浸提物对诱导烟草抗炭疽菌的活性有所差异，其中对烟草PPO和POD活性提升明显且效果最佳的是甲醇提取物。由此也可衡量不同溶剂的提取效果，以便于诱导活性物质的分离、提纯及检测，同时为下一步研究打下基础。鉴于印楝种子甲醇提取物良好的酶诱导效果，对其进行柱层析粗分离，综合烟叶总酚含量测定及对烟草炭疽病的病情指数测定，确定印楝种子甲醇提取物的丙酮流分诱导烟草抗炭疽病的效果最好。因此，推测印楝诱导活性物质可能存在于印楝种子甲醇提取物的丙酮流分段中。
诱导抗性是指由于外源生物或非生物因子的作用，激活植物自身防御体系，从而产生对病原物系统抗性的现象，其中研究较多的是系统获得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）。水杨酸（Salicylic acid，SA）是诱发SAR产生的关键信号分子之一，而茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和乙烯是诱发ISR产生的关键信号分子。NPR1蛋白还原成单体及其在细胞核内的积累是诱导水杨酸介导PR基因表达和SAR表现的必要条件（张红志和蔡新忠，2005）;NtRar1基因上调，可诱导植物体内H2O2含量升高（Ramegowda et al.，2013）;NtSGT1和PR1a分别通过激活半乳糖苷酶和葡萄糖醛酸酶诱导烟草产生抗性（Saito et al.，2014）。本研究中，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a 4个基因在处理后第1～7 d分别出现明显上调表达趋势，表明印楝诱导烟草抗炭疽病通过此4条通路激活植物的抗性，此阶段是植株多种抗性表达的活跃时期。 在模式植物中通过基因沉默、突变体和转基因等试验证明，SGT1与植物的抗病基因功能表达、超敏反应和非宿主抗性有密切关系，SGT1基因沉默或突变会导致一些抗病基因介导抗性的丧失，而 SGT1基因超表达会增强植株的某些抗病能力（Austin et al.，2002;Muskett and Parker，2003）。NTF6基因是调控SAR的关键基因，当烟草中NTF6基因沉默表达时烟草对烟草花叶病毒和假单胞杆菌的抗性减弱。当寄主被病毒、细菌和真菌等病原菌侵染时均会激发MAP激酶产生（Wilson et al.，1995）。Yang等（2001）在发现一种NtMEK2-SIPK/WIPK级联能控制PAL的表达，而这个基因所编码的酶在水杨酸生物合成途径中发挥重要作用，说明MAPK级联参与了防御反应，且在其中控制多条反应途径（肖文娟等，2004）。病菌侵染或激发子处理可明显增强PAL基因的转录水平（Weaver and Herrmann，1997）。有些植物在病原菌侵染时能产生两类富含脱氨酸的小分子抗菌多肽——植物防御素（Plant defensins，PDF）。PDF对许多真菌的生长有抑制作用，病原真菌Alternaria brassicicola侵染或茉莉酸甲酯处理拟南芥，能强烈诱导PDF基因的转录表达（Thomma et al.，1998）。控制脂肪氧化酶合成的LOX-1基因通过控制茉莉酸及其甲酯和前体物质合成而调节植物的诱导抗病性，是植物抗病性相关的抗病基因，LOX-1代谢产物可以作为抗菌或抗虫性物质。周延清等（2012）通过对不同品种的花生抗性研究发现脂肪氧化酶基因LOX-1的表达量也可作为鉴定花生品种抗性的一项指标。本研究中，施用印楝种子粉末对烟草的NTF6、PAL、NtLox1和PDF基因的表达量增加均不明显，表明印楝诱导烟草抗炭疽病可能不作用在此4条通路。
综上所述，印楝诱导的烟草抗烟草炭疽病是通过水杨酸信号传导等多个通路所完成。本研究发现印楝种子甲醇提取物的丙酮流分段可激活烟草的水杨酸信号抗病途径，但印楝种子粉末中的诱抗化合物有待进一步分离纯化。
4 结论
印楝种子提取物通过诱导提高PPO和POD抗病相关酶活性及诱导NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相关基因的表达而产生抗炭疽病作用，且诱导活性成分主要存在于甲醇提取物中。因此，印楝种子甲醇提取物丙酮流分可作为烟草炭疽病的诱抗剂推广应用于烟草生产。
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（責任编辑 王 晖）
关键词： 烟草;炭疽病;印楝种子粗提物;诱导抗性;抗性机理
中图分类号： S572.01 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）03-0524-09
0 引言
【研究意义】烟草炭疽病（Colletotrichum nicotia-nae Av. Sacca）是烟草的主要病害之一（孔凡彬等，2006）。目前防治烟草炭疽病仍以化学防治为主，由于缺乏对炭疽病抗药性状况的了解，一味增加用药量及用药次数，极易对环境造成污染，并引起病菌抗药性，特别是烟叶农药残留偏高，给烟叶出口和卷烟安全性带来不利影响（董志坚等，2004）。植物诱抗剂能诱导植物产生抗病性，且具有系统性、广谱性、安全性和持续性等特点，近年来已逐渐成为绿色农药开发的重要方向（刘勇鹏等，2017）。印楝（Azadirachta indica A. Juss）是世界上公认的最优秀生物农药之一。印楝可杀虫、抗菌和治病，在农业、园艺、花卉栽培、化妆品和医药等方面具有重要应用价值（Amadioha，1998），且其活性成分在自然界中无累积，对环境安全，对作物不产生药害，特别适用于蔬菜、水果、烟草和茶叶等直接食用的作物（徐汉虹等，2017）。因此，探究印楝诱导烟草抗炭疽病的机理具有重要理论意义和应用价值，并为印楝在防治烟草炭疽病中的应用提供理论依据。【前人研究进展】吴钜文和陈建峰（2002）研究表明，印楝制剂Tril-ogy[?]和Triac[?] 90% EC可用于防治果树和作物的斑点落叶病、炭疽病及早疫病等真菌病害。赵淑英等（2004）比较了印楝素和苦楝素对4种常见植物病原菌的抑制效果，结果表明印楝素和苦楝素均具有较好的抑菌活性，且印楝素的抑菌活性明显高于苦楝素，其中以甲醇提取物的活性最高。林靖凌等（2008）发现印楝的甲醇提取物对番木瓜炭疽病病原菌的抑制率可达39.72%。叶敏等（2009）研究表明，在一定时间范围内，印楝素对植物病原菌菌丝生长的抑制率随时间延长逐渐增加，但各供试病原菌抑制率随时间延长而增加的速率存在差异。江厚龙等（2014）研究发现，诱抗剂处理后的烟草叶片，其抗性相关酶[过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）]活性均有所提高。赖多等（2017）研究发现，印楝渣生物药肥可有效控制香蕉枯萎病，且可促进香蕉的生长。杨鑫等（2018）研究发现，植物诱抗剂可通过增强抗氧化酶的活性及降低细胞膜脂质过氧化[丙二醛（MDA）含量]来激活植株的系统抗病性。【本研究切入点】印楝种子提取获得的印楝素一直是农药学的研究热点，国内外有关印楝素和印楝的文献报道已有2000多篇（徐汉虹等，2017），但针对印楝提取物在烟草炭疽病防治方面的研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】以烟草品种K326为试验材料，研究印楝对烟草炭疽病的诱抗作用，利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术探究8个相关抗病基因的诱导表达，并测定印楝粗提物对烟草抗氧化酶活性和总酚含量变化的影响及烟草炭疽病诱导抗病效果，为利用印楝进行烟草炭疽病的生物防治提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试烟草品种K326由广东烟草南雄科学研究所提供。印楝种仁采集自四川，低温干燥，粉碎过20目筛。烟草炭疽病菌（C. nicotianae）由华南农业大学植物病理研究室提供。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 印楝诱导烟草炭疽病抗性测定
1. 2. 1. 1 烟苗培育 参照李海宾和于嘉（2012）的方法在华南农业大学温室进行烟苗培育，以大田土壤装钵，每钵1000 g，在14～24 ℃、光照12 h/d、湿度30%条件下育苗，每周施一次营养液，每钵约50 mL。
1. 2. 1. 2 接种菌液制备 参照李东升（2010）的方法，将炭疽病病原菌接种在PDA培养基上（200 g/L马铃薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L琼脂）28 ℃培养7 d，待充分产孢后，加入含0.02%（v/v）吐温-20的无菌水10 mL浸泡15 min，用无菌棉签洗下孢子和菌丝体，经无菌脱脂棉过滤，除去菌丝体，稀释成1×107个/mL的孢子悬浮液。
1. 2. 1. 3 接种方法 烟苗培养至5～6片叶时，以每株烟草根施60 g印楝种子粉末为处理，以不施用印楝种子粉末为对照。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%条件下保湿3 d后接种。接种方法参照宾金华等（2000）方法，烟草叶片表面用无菌水擦拭干净，将少量细金刚砂（600目）撒在待接种的烟草叶面上，手指在叶面上轻轻摩擦，然后用1×107个/mL的炭疽病孢子悬浮液涂抹于叶片表面直至形成一层水膜，接种后放置在温度25～26 ℃、湿度55%～60%的恒温箱中黑暗培育12 h，黑暗处理后放回温室中培育，温室中提供稳定光源，光照时间为12 h/d，温度控制在25～26 ℃，湿度为55%～60%。每處理接种30株烟苗，发病后逐株调查病情指数。 1. 2. 1. 4 植株病情调查 参照王金华（2005）的方法，以病斑扩展垂直两个方向的平均宽度计算单个病斑的直径（d），进而计算每个接种斑点的面积，病斑面积（mm2）=3.14×（d/2）2。
炭疽病病情分级标准（陈瑞泰等，1997）：0级，全叶无病;1级，病斑面积占整片叶的5%以下;2级，病斑面积占整片叶的5%～10%;3级，病斑面积占整片叶的10%～25%;4级，病斑面积占整片叶的25% 以上。
病性指数=[（病株数×发病级数）总株数×最高发病级别数]×100
1. 2. 2 印楝诱导烟草抗性相关基因表达测定
1. 2. 2. 1 样品处理 温室培养至5～6片叶的K326烟苗，以每株根施60 g印楝种子粉末为处理，以不施用印楝种子粉末为对照。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%条件下保湿3 d后接种，在接种后1、3、5、7和9 d各取样1次，炭疽病接种试验和烟草的培养参考1.2.1。
1. 2. 2. 2 总RNA提取及cRNA合成 采用RNAiso Plus试剂盒（TaKaRa）提取处理后的烟草RNA，以RNA为模板利用逆转录试剂盒反转录合成第一条cDNA链，再利用DNA聚合酶合成第二条cDNA链。
1. 2. 2. 3 qRT-PCR检测 利用SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）在TP900 Thermal Cycler DiceTM Real Time System（TaKaRa）上进行qRT-PCR检测，利用Premier 5.0设计特异性扩增引物（表1），由上海博尚生物技术有限公司合成。反应体系25.0 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL，10.0 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序：95 ℃ 预变性5 min;94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，进行40个循环;72 ℃延伸10 min。在每一个循环的退火阶段收集荧光进行实时检测，反应结束后，得到含有所有标本的记录点曲线。最终显示的数据通过2-ΔΔCt方法，以β-actin为内参基因。对于每个样品，将两个相对独立的反转录反应合并在一起，所有的qRT-PCR检测均依据相同的合成cDNA。每次试验进行3次技术重复和3次生物学重复。
1. 2. 3 印楝种子粗提物对烟草POD、PPO和PAL活性的影响
1. 2. 3. 1 印楝种子有效成分提取 将印楝种仁低温干燥，粉碎过20目筛，取20 g粉末置于三角瓶中，分别用甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取浓缩滤液。甲醇提取物处理后为浅黄色粉末，乙酸乙酯提取物为褐色膏状物，石油醚提取物为油状物。将3种不同的印楝提取物分别置于冰箱内冷藏备用。
1. 2. 3. 2 烟草处理 烟草培养至5～6片叶时，分别喷施3种印楝萃取物配制成的溶液，以喷施清水为对照。每处理重复3次。在温度25～26 ℃、湿度55%～60%下保湿3 d后接种。在接种后1、3、5、7、9和11 d分别取样1次，测定PLA、PPO和POD活性。
1. 2. 3. 3 粗酶液制备 PPO和POD粗酶液：取烟叶0.5 g，放入预冷研钵中液氮速冻，加入0.1 mol/L、 pH 6.8的磷酸缓冲液1.5 mL和少量石英砂，冰浴中研磨成匀浆。将匀浆液全部转入离心管中，于4 ℃、12000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，转入 5 mL试管待用。PAL粗酶液制备参照Gonzalez-Aguilar等（2004）的方法：取烟叶0.5 g，放入预冷的研钵中液氮速冻，加入0.1 mol/L pH 8.8的硼酸缓冲液（含5 mmol/L巯基乙醇、1 mmol/L EDTA及1% PVP）1.5 mL，在冰浴中研磨成匀浆，然后于4 ℃下12000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液，转入5 mL试管待用。
1. 2. 3. 4 酶活性测定 PPO活性测定参照Tan和Harris（1995）的方法，反应体系：0.1 mL粗酶液、0.02 mol/L邻苯二酚溶液1.4 mL（用pH 6.8缓冲液配制）、1.5 mL磷酸缓冲液。对照组中以磷酸缓冲液代替粗酶液，其他同反应体系。室温下测定410 nm处吸光值，每30 s记录1次，连续测定3 min，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
POD活性测定参照李易兴（2016）的方法，反应体系：2.9 mL pH 6.0磷酸缓冲液、0.1 mL粗酶液、0.05 mol/L愈创木酚30 ?L（用pH 6.0磷酸缓冲液配制后于30 ℃水浴中保温10 min）、30%过氧化氢50 ?L。对照组中以磷酸缓冲液代替粗酶液，其他同反应体系。室温下测定470 nm处吸光值，每30 s记录1次，连续测定3 min，以每分钟吸光值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
PAL活性测定参照杨光道等（2007）的方法，反应体系：0.2 mL酶液、1.0 mL硼酸缓冲液和0.02 mol/L L-苯丙氨酸1.0 mL。对照组中不加粗酶液而用0.2 mL硼酸缓冲液代替，其余同反应体系。反应体系于40 ℃水浴60 min，加入0.2 mL 6 mol/L HCI终止反应，随后测定OD290值，以OD值变化0.01为1个酶活性单位（U），每处理重复3次。
1. 2. 4 印楝种子甲醇提取物粗分离 取少量100～200目硅胶，置于研钵内，用少量丙酮溶解甲醇提取的印楝素干粉，并用滴管滴加到硅胶上，玻棒搅散，待丙酮挥发后将样品碾匀备用。
将200～300目硅胶G加到氯仿中，充分搅匀后转入玻璃层析柱中，静置过夜，检查柱中气泡情况，若状态良好，将拌入硅胶中的样品上柱，再加入2～3 cm厚的石英砂。流动相为氯仿、氯仿∶丙酮（体积比分别为95∶5、90∶10、1∶1）和丙酮，每次收集100 mL。以TLC点板顯色比较，分别合并相近的流分，将合并溶液减压蒸干备用。 1. 2. 5 总酚含量测定 采用福林—酚比色法测定多酚含量（田桂芝等，2015）。
1. 2. 6 印楝种子甲醇提取物各流分产物对烟草炭疽病抗性测定 将氯仿∶丙酮（体积比分别为95∶5、1∶1）和丙酮流分物质配成适宜浓度喷施在烟草上，12 h后用1×107个/mL的孢子悬浮液接种供试烟草叶片。接种方法和炭疽病发病情况统计参照1.2.1。
1. 3 统计分析
采用Excel 2007和SPSS 17.0对数据进行整理和统计分析。
2 结果与分析
2. 1 印楝诱导烟草炭疽病抗性测定结果
印楝诱导烟草炭疽病抗性试验结果（表2）显示，印楝处理的烟草炭疽病病情指数为26.67%，而对照的病情指数达74.17%，二者差异显著（P<0.05，下同）。这可能是由于印楝处理后的烟草具有诱导抗性，使得其病情指数显著低于对照，说明根施印楝种子粉末可有效提高烟草对炭疽病的抗性。
2. 2 印楝诱导烟草抗性基因的表达结果
qRT-PCR检测结果显示，接种烟草炭疽病菌后，对照烟叶中抗病相关基因NPR1、NTF6、Ntlox1、NtRar1、NtSGT1、PAL、PDF1.2和PR1a的表达变化均不明显。印楝处理的烟草叶片中，接种后第1 d NPR1基因的相对表达水平很低，接种后第3～5 d急剧升高，第3 d升至对照的2562倍，第5 d升至对照的10789倍，第7 d急剧降至接种后第1 d的水平，随后略有升高;NtRar1基因的表达水平在接种后第1 d略高于对照，第3 d时低于对照，至第5 d达峰值，为对照的10.15倍，接种后第7～9 d降至对照水平;NtSGT1基因的相对表达量在接种后第1～5 d变化不明显，且均低于对照，至第7 d时达峰值，为对照的12.76倍，接种后第9 d降低至对照水平;PR1a基因的表达水平在接种后第1 d达峰值，为对照的6872倍，第3 d时急剧降低，第5 d又略有升高，第7～9 d再次降低至对照水平;其他4个基因的表达水平在接种后9 d内略有波动，但整体变化不明显。
2. 3 印楝种子粗提物对烟草PPO、POD和PAL活性的影响
喷施不同溶剂萃取的印楝种子提取物溶液后，烟叶中PPO、POD和PAL活性表现各异。不同处理的PPO活性在接种后第1 d无明显差异;接种后第3 d，甲醇提取物处理的PPO活性达峰值，为对照的11.75倍，活性增加明显，其次为乙酸乙酯提取物处理，PPO活性也较对照明显增加，而石油醚提取物处理的PPO活性略高于对照;接种后第5～11 d，不同处理的PPO活性变化趋势不同，但整体上以甲醇提取物的PPO活性相对较高。不同处理的POD活性整体上呈先升高后降低再升高的变化趋势，其中甲醇提取物的POD活性在接种后第3 d达峰值，为对照的2.98倍，且明显高于其他处理;接种后第7～11 d也以甲醇提取物处理的POD活性整体较高。不同处理的PAL活性在接种后第1～11 d整体上呈升高—降低—升高—降低的变化趋势，各处理均在接种后第3 d达峰值，但同一接种时间下不同处理间无明显差异。综上所述，以甲醇提取物对烟草PPO和POD活性的提升效果较优。
2. 4 印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草总酚含量的影响
酚类化合物是许多植物体本身的固有成分，也是植物的次生代谢产物，在植物的抗病机制中发挥重要作用。通过测定印楝种子甲醇提取物各流分对烟叶总酚含量的影响，发现3组流分处理均可使烟叶总酚含量提高，均呈先升高后降低再升高的变化趋势。如图3所示，氯仿∶丙酮（95∶5）处理后2 h总酚含量达峰值（44.70 mg/gFW），为对照的2.63倍;氯仿∶丙酮（1∶1）处理后96 h总酚含量达峰值（123.77 mg/gFW），为对照的4.13倍;丙酮流分处理后第6和96 h烟叶总酚含量出现两个高峰（81.15和90.45 mg/gFW），分别为对照的2.52和3.34倍。
2. 5 印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草炭疽病抗性的影响
印楝种子甲醇提取物不同流分对烟草炭疽病抗性的测定结果（表3）表明，3个处理的病情指数排序为丙酮<氯仿：丙酮（1：1）<氯仿：丙酮（95：5），抗性均顯著高于对照，尤其以丙酮流分处理的诱导抗性能力最强。
3 讨论
本研究采用印楝种子粉末进行烟苗根施处理，发现其可降低烟草炭疽病病情指数;进一步采用柱层析分离法，确定印楝种子粗提物诱导活性成分主要在印楝种子甲醇提取物的丙酮流分中。前人已有研究表明，印楝提取物可激活植物的抗病能力。本研究中，根施印楝种子粉末使烟草炭疽病的发病指数由74.17%降至26.67%，且qRT-PCR测定结果表明，在不同时间段可明显提高抗病基因NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a的表达量，其原因可能与印楝种子粉末可诱导烟草抗病相关。进一步对印楝种子的甲醇提取物、乙酸乙酯提取物和石油醚提取物诱导烟草的PPO、POD和PAL活性进行分析，发现印楝种子提取物不同有机溶剂浸提物对诱导烟草抗炭疽菌的活性有所差异，其中对烟草PPO和POD活性提升明显且效果最佳的是甲醇提取物。由此也可衡量不同溶剂的提取效果，以便于诱导活性物质的分离、提纯及检测，同时为下一步研究打下基础。鉴于印楝种子甲醇提取物良好的酶诱导效果，对其进行柱层析粗分离，综合烟叶总酚含量测定及对烟草炭疽病的病情指数测定，确定印楝种子甲醇提取物的丙酮流分诱导烟草抗炭疽病的效果最好。因此，推测印楝诱导活性物质可能存在于印楝种子甲醇提取物的丙酮流分段中。
诱导抗性是指由于外源生物或非生物因子的作用，激活植物自身防御体系，从而产生对病原物系统抗性的现象，其中研究较多的是系统获得抗性（Systemic acquired resistance，SAR）和诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）。水杨酸（Salicylic acid，SA）是诱发SAR产生的关键信号分子之一，而茉莉酸（Jasmonic acid，JA）和乙烯是诱发ISR产生的关键信号分子。NPR1蛋白还原成单体及其在细胞核内的积累是诱导水杨酸介导PR基因表达和SAR表现的必要条件（张红志和蔡新忠，2005）;NtRar1基因上调，可诱导植物体内H2O2含量升高（Ramegowda et al.，2013）;NtSGT1和PR1a分别通过激活半乳糖苷酶和葡萄糖醛酸酶诱导烟草产生抗性（Saito et al.，2014）。本研究中，NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a 4个基因在处理后第1～7 d分别出现明显上调表达趋势，表明印楝诱导烟草抗炭疽病通过此4条通路激活植物的抗性，此阶段是植株多种抗性表达的活跃时期。 在模式植物中通过基因沉默、突变体和转基因等试验证明，SGT1与植物的抗病基因功能表达、超敏反应和非宿主抗性有密切关系，SGT1基因沉默或突变会导致一些抗病基因介导抗性的丧失，而 SGT1基因超表达会增强植株的某些抗病能力（Austin et al.，2002;Muskett and Parker，2003）。NTF6基因是调控SAR的关键基因，当烟草中NTF6基因沉默表达时烟草对烟草花叶病毒和假单胞杆菌的抗性减弱。当寄主被病毒、细菌和真菌等病原菌侵染时均会激发MAP激酶产生（Wilson et al.，1995）。Yang等（2001）在发现一种NtMEK2-SIPK/WIPK级联能控制PAL的表达，而这个基因所编码的酶在水杨酸生物合成途径中发挥重要作用，说明MAPK级联参与了防御反应，且在其中控制多条反应途径（肖文娟等，2004）。病菌侵染或激发子处理可明显增强PAL基因的转录水平（Weaver and Herrmann，1997）。有些植物在病原菌侵染时能产生两类富含脱氨酸的小分子抗菌多肽——植物防御素（Plant defensins，PDF）。PDF对许多真菌的生长有抑制作用，病原真菌Alternaria brassicicola侵染或茉莉酸甲酯处理拟南芥，能强烈诱导PDF基因的转录表达（Thomma et al.，1998）。控制脂肪氧化酶合成的LOX-1基因通过控制茉莉酸及其甲酯和前体物质合成而调节植物的诱导抗病性，是植物抗病性相关的抗病基因，LOX-1代谢产物可以作为抗菌或抗虫性物质。周延清等（2012）通过对不同品种的花生抗性研究发现脂肪氧化酶基因LOX-1的表达量也可作为鉴定花生品种抗性的一项指标。本研究中，施用印楝种子粉末对烟草的NTF6、PAL、NtLox1和PDF基因的表达量增加均不明显，表明印楝诱导烟草抗炭疽病可能不作用在此4条通路。
综上所述，印楝诱导的烟草抗烟草炭疽病是通过水杨酸信号传导等多个通路所完成。本研究发现印楝种子甲醇提取物的丙酮流分段可激活烟草的水杨酸信号抗病途径，但印楝种子粉末中的诱抗化合物有待进一步分离纯化。
4 结论
印楝种子提取物通过诱导提高PPO和POD抗病相关酶活性及诱导NPR1、NtRar1、NtSGT1和PR1a等抗病相关基因的表达而产生抗炭疽病作用，且诱导活性成分主要存在于甲醇提取物中。因此，印楝种子甲醇提取物丙酮流分可作为烟草炭疽病的诱抗剂推广应用于烟草生产。
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（責任编辑 王 晖）