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摘 要： 鹽角草是一种耐盐植物，有重要的食用、药用价值。为研究盐角草的内生真菌及其活性次生代谢产物的多样性，该文对采集于广西北部湾沿海盐角草的内生真菌进行分离纯化，采用RAPD对内生真菌多样性进行分析，采用ITS基因序列对内生真菌进行鉴定，并对内生真菌提取物抑制等3种水产腐败细菌的活性进行筛选。结果表明：（1）从北部湾盐角草植物中分离到14株形态不同的内生真菌，RAPD分析这些内生真菌有6种不同型别。ITS基因序列分析表明，这些菌株分别和Curvularia lunata、Aspergillus candidus、Guignardia mangiferae、Neocamarosporium chichastianum有较高的序列相似性;其中有三株与Neocamarosporium chichastianum IBRC-M：30126的相似性为94%～95%，从系统发育树和菌落形态上看可能为Neocamarosporium salicornicola进化关系较近的一个新种。（2）抑菌实验表明，内生菌YJCJ3提取物具有比较好的抑制副溶血弧菌（Vibrio Parahaemolyticus）的活性，其菌丝体提取物的甲醇、石油醚和乙酸乙酯的溶解液都具有较强的抑制副溶血弧菌的活性;而YJCJ5表现了较为广谱的抑制诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）等3种水产腐败细菌的活性，其中YJCJ5的菌丝体石油醚和乙酸乙酯溶解液有抑制诺氏布丘氏菌和气单胞菌的活性，甲醇和石油醚溶解液具有一定的抑制乡间布丘氏菌的活性。该研究结果表明盐角草存在较为丰富的内生真菌多样性，可以发现一些新的内生真菌种群，其具有多种活性提取物，可用于抑制水产品的腐败细菌的生长，具有较好的开发价值。
关键词： 盐角草， 内生真菌， 水产腐败细菌， 抑菌活性， 北部湾
中图分类号： S917.1
文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-0883-07
收稿日期： 2020-08-15
基金项目： 国家自然科学基金（31560727）;广西自然科学基金（2018JJA130187）;广西高校中青年教师基础能力提升项目（2017KY0778）;广西教育厅高校科研项目（KY2015ZD132）;广西北部湾海岸科学与工程实验室项目（2016ZYB04）;广西北部湾海洋灾害研究重点实验室项目（2017ZD01） [Supported by the National Natural Science Foundation of China （31560727）; Guangxi Natural Science Foundation （2018JJA130187）; Basic Ability Improvement Project for Young and Middle-Aged Teachers in Universities of Guangxi （2017KY0778）;Scientific Research Foundation of Guangxi Educational Committee（KY2015ZD132）;Foundation of Guangxi Beibu Gulf Coastal Science and Engineering Laboratory （2016ZYB04）; Foundation of Guangxi Key Laboratory of Marine Disaster （2017ZD01）]。
作者简介： 张艳秋（1979-），博士，副教授，研究方向为海洋生物资源开发与利用，（E-mail）[email protected]。
*通信作者： 龚斌，博士，教授，研究方向为海洋微生物，（E-mail）[email protected]。
Endophytic fungi isolated from Salicornia europaea and their antibacteria activities to aquatic spoilage bacteria
ZHANG Yanqiu2，3， FANG Huaiyi3， CAO Hongming1， GONG Bin1，2*， DENG Zongjian2， CHEN Meihua4， SONG Jingjing3， ZHANG Hong2
（ 1. Guangxi Key Laboratory of Marine Disaster in the Beibu Gulf， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 2. School of Ocean Sciences， Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 3. Guangxi Key Laboratory Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 4. School of Food Science and Engineering， Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China ）
Abstract： Salicornia europaea is a kind of salt tolerant plant with important edible and medicinal value. Because this coastal plant grow in extreme salt tolerant environment， the diversity of its endophytic fungi and their active secondary metabolites may be distinctive from other plants. In our study， the endophytic fungi were isolated and purified， and the diversity of endophytic fungi was analyzed by RAPD， then the endophytic fungi were identified by ITS gene analysis. Finally， their activity inhibiting several aquatic spoilage bacteria was screened. The results were as follows： （1） A total of 14 endophytic fungi with different morphological characteristics were isolated from Salicornia europaea in Beibu Gulf. According to the RAPD analysis， these endophytic fungi had six different genetic types. The sequence analysis of ITS gene showed that these fungi had high sequence similarity with Curvularia lunata， Aspergillus candidus， Guarantaria mangiferae and Neocamarosporium chichastianum， and three of which showed relatively lower similarity with Neocamarosporium chichastianum IBRC-M：30126， which indicated 94%-95%. From the phylogenetic tree and colony morphology， three endophytic fungi， named YJCY2， YJCY3 and YJCG2， may be a new species closely related to Neocamarosporium salicornicola. （2） The antibacterial experiment showed that the extract content of strain YJCJ3 was a strong antibacterial activity to Vibrio parahaemolyticus， and the methanol， petroleum ether and ethyl acetate solution of the mycelium extract had a strong inhibiting activity against Vibrio parahaemolyticus. YJCJ5 showed a broad spectrum to inhibit several aquatic spoilage bacteria Buttiauxella noackiae， Aeromonas dhakensis and Buttiauxella gaviniae， in which the petroleum ether and ethyl acetate solution of mycelium inhibited the growth of Buttiauxella noackiae and Aeromonas dhakensis， while the extract content of methanol and petroleum ether solution inhibited the activities of Buttiauxella gaviniae. Our result is significant， for that the diversity of endophytic fungi in Salicornia europaea was extremely abundant， and that new endophytic fungi could be isolated and identified from this plant， a variety of whose active extracts can be screened and used to inhibit the growth of spoilage bacteria in aquatic products showing good potential for their utilization in this area.
Key words： Salicornia europaea， endophytic fungi， aquatic spoilage bacteria， antibacterial activity， Beibu Gulf
盐角草（Salicornia europaea），别名海芦笋，属于藜科（Chenopodiaceae）盐角草属（Salicornia L.）植物，生于盐湖、盐碱地、海岸边等盐度比较高的生境（Shi et al.， 2006），是目前认识的最耐盐的植物之一（赵惠明， 2004），其分布于世界很多地方。盐角草是一种药食两用植物。一方面，盐角草可作为蔬菜食用，其含有的蛋白质、脂肪和氨基酸等营养成分丰富（李建伟等，2012）;另一方面，盐角草也具有较好的药用价值，盐角草全草在中药里称为海蓬子，《中华本草》中记载其可以治疗高血压和头痛（国家中药管理局， 1999）。姜丹等（2012）发现盐角草甲醇提取物中芦丁对中肋骨条藻的生长具有一定的抑制作用;许伟等（2011）从盐角草中提取总生物碱，发现其具有抑菌活性;张丹玉等（2014）发现盐生植物北美海蓬子的提取物具有抗肿瘤活性;管福琴（2016）发现海蓬子的三萜皂苷具有抗乳腺癌的活性。
内生真菌是在健康植物中共生的一类真菌，很多内生真菌都能够产生结构多样的活性化合物（Schulz et al.， 2002; Jia et al.， 2016）。目前，关于盐角草内生菌的研究还比较少，赵育卉等（2013）从盐角草中分离了两株内生真菌，分别为点青霉属和镰刀菌属;冉火苗等（2016）从野生盐角草中分离了13株内生细菌，利用8种病原细菌作为指示菌对内生细菌进行研究，发现有两株菌对这些病原菌有较好的抑制作用;赵帅等（2016）利用高通量测序的方法研究了盐角草根部内生细菌多样性，揭示内生细菌在宿主关键发育期变化规律;张志东等（2020）利用高通量测序的方法研究了新疆地区盐湖生长的鹽角草内生真菌的多样性。
广西北部湾海岸线1 629 km，属于亚热带季风气候，常年高温多雨，孕育了丰富的海洋生物多样性（Wu et al.， 2017）。广西北部湾盐角草对比其他区域而言，其内生真菌多样性如何？是否存在一些独特的种群？另外，对于这种生活在极端环境中的植物，其内生真菌的活性、次生代谢产物多样性如何？本研究从钦州沿海的盐角草中分离内生真菌，采用RAPD方法对内生真菌进行多样性研究，并利用ITS基因序列对内生真菌进行鉴定，并评价了这些内生真菌抑制几种水产腐败细菌的活性。本研究对于北部湾耐盐植物内生菌资源的开发具有较重要意义。
1 材料与方法
1.1 盐角草材料的采集
盐角草全草采自北部湾钦州沿海月亮湾附近盐田，经专家鉴定为盐角草（Salicornia europaea）。采集的盐角草放入冰盒后迅速转移到实验室进行下一步研究。
1.2 培养基
内生真菌的分离培养基为SPDA培养基，是在普通的PDA培养基（Gong et al.， 2017）里添加1.5%的海水晶;指示菌培养基为普通LB培养基（胰化蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，调pH至7.4左右，用纯净水定容至1 L）。
1.3 盐角草内生真菌的分离纯化
自来水冲洗盐角草样品，按Gong et al.（2017）的方法进行样品表面消毒，用无菌水洗净后在超净操作台中晾干。无菌条件下将盐角草根、茎和叶剪成0.5 cm的小段，置于SPDA培养基（添加50 μg·mL-1氯霉素）中。倒置，26～28 ℃培养，每天观察，挑取长出的菌丝，在新的SPDA平板上生长，待菌落长出来后，挑取少量边缘的菌丝重复本操作2次对真菌进行纯化。
1.4 内生真菌的分子鉴定
收集液体培养的内生真菌菌丝体，采用液氮反复冻融3次，利用真菌 DNA 提取试剂盒（美国，Omega） 提取真菌的总DNA（龚斌等，2017）。合成S系列随机引物，对引物进行筛选，选择稳定、重复性好的引物进行下一步实验，实验的具体步骤参考龚斌等（2017）。内生真菌的ITS基因分析鉴定参考Gong et al.（2014）的方法，采用SPDA液体培养基培养5 mL真菌，10 000 r·min-1离心5 min后收集菌丝体，用液氮冻融菌丝体3次，用灭菌玻璃棒迅速将菌丝体研磨成匀浆，按照操作说明书采用真菌基因组DNA提取试剂盒（Solarbio公司）提取真菌染色体DNA，提取的DNA用NanoDrop 2000进行质量检测和定量，吸取一定量DNA，使用通用引物ITS1和ITS4扩增真菌ITS基因片段（Gong et al.， 2015），扩增出的片段经过PCR产物回收试剂盒回收后，送金唯智生物有限公司测序。
1.5 真菌次生代谢产物的提取和抑菌活性测定 接种真菌于200 mL液体SPDA培养基，200 r·min-1，26～28 ℃，发酵培养10～20 d至菌丝体长满三角瓶。8 000 r·min-1离心收集菌丝体，常温下风扇吹干水分。干燥后的菌体称取0.3 g加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5）浸泡，将提取液均匀吸入3个EP管，静置待提取液挥发，在EP管中分别加入有机溶剂石油醚、乙酸乙酯和甲醇来溶解提取物。抑菌活性指示菌诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）分别来自腐败的鱼肉和其他水产品，由本实验室分离保藏。分别接种到LB液体培养基中，28 ℃摇床上以200 r·min-1的转速培养过夜。将上述菌液200 μL采用混菌法接种于培养皿中，采用滤纸片法测定抑菌活性（Gong et al.， 2018）。本实验使用滤纸片分别蘸取乙酸乙酯、甲醇和乙酸作为空白对照，阳性对照为滤纸片蘸取50 μL·mL-1的卡那霉素和氯霉素。
2 结果与分析
2.1 盐角草内生真菌的分离结果
从广西北部湾钦州沿海盐田边生长的盐角草的根、茎、叶中共分离纯化得到48株内生真菌，其中茎中得到真菌22株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有5株，命名为YJCJ1、YJCJ2、YJCJ3、YJCJ4和YJCG5），根中得到12株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有6株，命名为YJCG1、YJCG2、YJCG3、YJCG4、YJCG5和YJCG6），叶中得到14株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有3株，命名为YJCY1、YJCY2和YJCY3）（表 1）。由表1可知，从茎中分离的真菌是最多的，但是根中得到的真菌更为丰富。
2.2 RAPD分析内生真菌多样性
对14种菌落形态有差异的内生真菌，进一步提取总DNA后，进行RAPD多样性分析（图1），通过指纹条带分析，确定有6种不同的遗传类型，其中YJCY1、YJCJ1、YJCJ3、YJCJ4、YJCJ5、YJCG1、YJCG3、YJCG4、YJCG6相同，YJCJ2和YJCG5分别为独立类型，YJCG2、YJCY2和YJCY3相似但不完全相同。
2.3 内生真菌的ITS分子鉴定
通过对14株真菌ITS序列的分析，从核酸序列数据库中找到与本研究序列相似度最高的菌株（图2），结果表明有9株与Curvularia lunata PSU-ES195的相似性最高，为99%～100%;YJCJ2与Aspergillus candidus ATCC 1002的相似性为99%;YJCG5与Guignardia mangiferae GZAAS6.1243的相似性为99%。ITS基因序列与RAPD多态性分型的分析方法得到的結果非常接近，说明RAPD在对分离的内生真菌进行类群初步划分也是非常有效的，可以节省分型的成本。
GenBank中与YJCY2、YJCY3和YJCG2相似性最高的菌株为Neocamarosporium chichastianum IBRC-M：30126（94%～95%），相似性比较低。为了进一步确定其分类地位，我们构建了YJCY2、YJCY3和YJCG2及GenBank中ITS基因序列相似性最高的菌株的系统发育树，结果表明YJCY2、YJCY3和YJCG2与Neocamarosporium salicornicola在进化树中为一个分支。Blastn分析与进化树的结果有一定差异，这可能是因为相似性和进化树的分析计算方法不同，相似性计算时只考虑比对的序列碱基中相同的碱基所占的百分比，而进化树是按Neighbour-Joining的方法对序列进行两两比较，从而计算序列中间的进化或亲缘关系，两者在概念上存在一定的差异。另外，YJCY2、YJCY3和YJCG2是否为新种有待进一步确定。
2.4 盐角草内生真菌提取物抑菌活性的测定
将所得的代谢产物和菌体浸出物用不同的有机溶剂甲醇、石油醚和乙酸乙酯提取做抑菌实验，用提取液对4种指示菌Buttiauxella gaviniae、Aeromonas dhakensis、Buttiauxella noackiae、Vibrio parahaemolyticus进行抗菌活性试验，结果表明14株内生真菌中，有4株内生真菌对一种或者多种指示菌具有抑菌活性（表3）， 其中YJCJ1对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌活性，对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌活性;YJCJ5对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌活性，且在石油醚中抑菌效果比较强，对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌活性;YJCJ3在3种溶剂中对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）都有很强的抑菌活性，在诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）中无抑菌效果;YJCG5对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌效果，对气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌效果。 3 讨论与结论
本研究从盐角草不同组织分离到形态不同的内生真菌14株，其中根部分离到的内生真菌最多，有6株，占42.86%;分离到的优势种类为Curvularia lunata，在根中占优势，叶中的优势种为Neocamarosporium chichastianum; 其他分离到的种包括Guignardia mangiferae和Aspergillus candidus。这与张志东等（2020）的研究结果不同，其中Alternaria、Cladosporium、Podospora 3个属为盐角草内生真菌优势菌群;本研究和赵育卉等（2013）报道的结果也不一样，他们分离到的真菌比较少，仅有点青霉属和镰刀菌属。本研究与这些结果的差异可能来自分离环境的差异。张志东等（2020）研究的盐角草来自新疆天山的盐渍土，赵育卉等（2013）研究的盐角草来自江苏的盐碱地，而本研究的盐角草来自北部湾的盐田，在空间上的距离比较远，其生长环境的差异也会造成其所共生的内生真菌类群不同。另外，从盐角草中分离的内生真菌相对于其他植物而言偏少，这可能是因为盐角草生长在高盐的极端环境，对内生真菌有选择作用。
本研究分离的YJCY2、YJCY3和YJCG2在进化关系上与Neocamarosporium salicornicola距离最近，Neocamarosporium salicornicola 模式种（MycoBank MB821971）2015年分离于泰国的盐角草死亡的茎，这与本研究的真菌来源植物基本相同，说明Neocamarosporium salicornicola类真菌可能是盐角草专性寄生的真菌（Wanasinghe et al.， 2017）。Wanasinghe et al.（2017）研究发现Neocamarosporium salicornicola 真菌在16 ℃ PDA培养基上培养3周时的菌落为3 cm;菌落正面为灰色，背面周围为微黄色，中间为黑色。本研究分离的真菌为菌丝为白色绒毛状，菌落中间为淡红色，存在一定差异，因此YJCY2、YJCY3和YJCG2可能为Neocamarosporium的新种，但有待进一步实验证实。
本研究分离到的菌株YJCJ3提取物表现了比较好的抑制副溶血弧菌的潜力，而YJCJ5表现了较为广谱的抑制几种水产腐败细菌Buttiauxella noackiae、Aeromonas dhakensis、Buttiauxella gaviniae的活性。YJCJ3和YJCJ5均为Curvularia属真菌。Khiralla et al.（2019）研究表明Curvularia属是产生活性次生代谢产物的“明星真菌”之一，可以从内生菌、病原菌、海葵和鱼等分离，产生抗疟疾、抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌和抗癌等活性物质。因为副溶血弧菌和其他几种水产腐败细菌Buttiauxella gaviniae（王发祥等，2012）、Aeromonas dhakensis （Carriero et al.， 2016）、Buttiauxella noackiae是水产品储运中较易出现的，并对人体健康有较大威胁的细菌（由高铭等，2018），所以新型保鲜剂的研发也非常紧迫（陈文慧等，2017）。本研究的结果提供了几个非常有应用前景的内生真菌，以后的研究可以考虑从这些内生真菌中提取抗菌活性物质用于抑制水产品的腐败。
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（责任编辑 何永艳）
关键词： 盐角草， 内生真菌， 水产腐败细菌， 抑菌活性， 北部湾
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文献标识码： A
文章编号： 1000-3142（2021）06-0883-07
收稿日期： 2020-08-15
基金项目： 国家自然科学基金（31560727）;广西自然科学基金（2018JJA130187）;广西高校中青年教师基础能力提升项目（2017KY0778）;广西教育厅高校科研项目（KY2015ZD132）;广西北部湾海岸科学与工程实验室项目（2016ZYB04）;广西北部湾海洋灾害研究重点实验室项目（2017ZD01） [Supported by the National Natural Science Foundation of China （31560727）; Guangxi Natural Science Foundation （2018JJA130187）; Basic Ability Improvement Project for Young and Middle-Aged Teachers in Universities of Guangxi （2017KY0778）;Scientific Research Foundation of Guangxi Educational Committee（KY2015ZD132）;Foundation of Guangxi Beibu Gulf Coastal Science and Engineering Laboratory （2016ZYB04）; Foundation of Guangxi Key Laboratory of Marine Disaster （2017ZD01）]。
作者简介： 张艳秋（1979-），博士，副教授，研究方向为海洋生物资源开发与利用，（E-mail）[email protected]。
*通信作者： 龚斌，博士，教授，研究方向为海洋微生物，（E-mail）[email protected]。
Endophytic fungi isolated from Salicornia europaea and their antibacteria activities to aquatic spoilage bacteria
ZHANG Yanqiu2，3， FANG Huaiyi3， CAO Hongming1， GONG Bin1，2*， DENG Zongjian2， CHEN Meihua4， SONG Jingjing3， ZHANG Hong2
（ 1. Guangxi Key Laboratory of Marine Disaster in the Beibu Gulf， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 2. School of Ocean Sciences， Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 3. Guangxi Key Laboratory Beibu Gulf Marine Biodiversity Conservation， Qinzhou 535011， Guangxi， China; 4. School of Food Science and Engineering， Beibu Gulf University， Qinzhou 535011， Guangxi， China ）
Abstract： Salicornia europaea is a kind of salt tolerant plant with important edible and medicinal value. Because this coastal plant grow in extreme salt tolerant environment， the diversity of its endophytic fungi and their active secondary metabolites may be distinctive from other plants. In our study， the endophytic fungi were isolated and purified， and the diversity of endophytic fungi was analyzed by RAPD， then the endophytic fungi were identified by ITS gene analysis. Finally， their activity inhibiting several aquatic spoilage bacteria was screened. The results were as follows： （1） A total of 14 endophytic fungi with different morphological characteristics were isolated from Salicornia europaea in Beibu Gulf. According to the RAPD analysis， these endophytic fungi had six different genetic types. The sequence analysis of ITS gene showed that these fungi had high sequence similarity with Curvularia lunata， Aspergillus candidus， Guarantaria mangiferae and Neocamarosporium chichastianum， and three of which showed relatively lower similarity with Neocamarosporium chichastianum IBRC-M：30126， which indicated 94%-95%. From the phylogenetic tree and colony morphology， three endophytic fungi， named YJCY2， YJCY3 and YJCG2， may be a new species closely related to Neocamarosporium salicornicola. （2） The antibacterial experiment showed that the extract content of strain YJCJ3 was a strong antibacterial activity to Vibrio parahaemolyticus， and the methanol， petroleum ether and ethyl acetate solution of the mycelium extract had a strong inhibiting activity against Vibrio parahaemolyticus. YJCJ5 showed a broad spectrum to inhibit several aquatic spoilage bacteria Buttiauxella noackiae， Aeromonas dhakensis and Buttiauxella gaviniae， in which the petroleum ether and ethyl acetate solution of mycelium inhibited the growth of Buttiauxella noackiae and Aeromonas dhakensis， while the extract content of methanol and petroleum ether solution inhibited the activities of Buttiauxella gaviniae. Our result is significant， for that the diversity of endophytic fungi in Salicornia europaea was extremely abundant， and that new endophytic fungi could be isolated and identified from this plant， a variety of whose active extracts can be screened and used to inhibit the growth of spoilage bacteria in aquatic products showing good potential for their utilization in this area.
Key words： Salicornia europaea， endophytic fungi， aquatic spoilage bacteria， antibacterial activity， Beibu Gulf
盐角草（Salicornia europaea），别名海芦笋，属于藜科（Chenopodiaceae）盐角草属（Salicornia L.）植物，生于盐湖、盐碱地、海岸边等盐度比较高的生境（Shi et al.， 2006），是目前认识的最耐盐的植物之一（赵惠明， 2004），其分布于世界很多地方。盐角草是一种药食两用植物。一方面，盐角草可作为蔬菜食用，其含有的蛋白质、脂肪和氨基酸等营养成分丰富（李建伟等，2012）;另一方面，盐角草也具有较好的药用价值，盐角草全草在中药里称为海蓬子，《中华本草》中记载其可以治疗高血压和头痛（国家中药管理局， 1999）。姜丹等（2012）发现盐角草甲醇提取物中芦丁对中肋骨条藻的生长具有一定的抑制作用;许伟等（2011）从盐角草中提取总生物碱，发现其具有抑菌活性;张丹玉等（2014）发现盐生植物北美海蓬子的提取物具有抗肿瘤活性;管福琴（2016）发现海蓬子的三萜皂苷具有抗乳腺癌的活性。
内生真菌是在健康植物中共生的一类真菌，很多内生真菌都能够产生结构多样的活性化合物（Schulz et al.， 2002; Jia et al.， 2016）。目前，关于盐角草内生菌的研究还比较少，赵育卉等（2013）从盐角草中分离了两株内生真菌，分别为点青霉属和镰刀菌属;冉火苗等（2016）从野生盐角草中分离了13株内生细菌，利用8种病原细菌作为指示菌对内生细菌进行研究，发现有两株菌对这些病原菌有较好的抑制作用;赵帅等（2016）利用高通量测序的方法研究了盐角草根部内生细菌多样性，揭示内生细菌在宿主关键发育期变化规律;张志东等（2020）利用高通量测序的方法研究了新疆地区盐湖生长的鹽角草内生真菌的多样性。
广西北部湾海岸线1 629 km，属于亚热带季风气候，常年高温多雨，孕育了丰富的海洋生物多样性（Wu et al.， 2017）。广西北部湾盐角草对比其他区域而言，其内生真菌多样性如何？是否存在一些独特的种群？另外，对于这种生活在极端环境中的植物，其内生真菌的活性、次生代谢产物多样性如何？本研究从钦州沿海的盐角草中分离内生真菌，采用RAPD方法对内生真菌进行多样性研究，并利用ITS基因序列对内生真菌进行鉴定，并评价了这些内生真菌抑制几种水产腐败细菌的活性。本研究对于北部湾耐盐植物内生菌资源的开发具有较重要意义。
1 材料与方法
1.1 盐角草材料的采集
盐角草全草采自北部湾钦州沿海月亮湾附近盐田，经专家鉴定为盐角草（Salicornia europaea）。采集的盐角草放入冰盒后迅速转移到实验室进行下一步研究。
1.2 培养基
内生真菌的分离培养基为SPDA培养基，是在普通的PDA培养基（Gong et al.， 2017）里添加1.5%的海水晶;指示菌培养基为普通LB培养基（胰化蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，调pH至7.4左右，用纯净水定容至1 L）。
1.3 盐角草内生真菌的分离纯化
自来水冲洗盐角草样品，按Gong et al.（2017）的方法进行样品表面消毒，用无菌水洗净后在超净操作台中晾干。无菌条件下将盐角草根、茎和叶剪成0.5 cm的小段，置于SPDA培养基（添加50 μg·mL-1氯霉素）中。倒置，26～28 ℃培养，每天观察，挑取长出的菌丝，在新的SPDA平板上生长，待菌落长出来后，挑取少量边缘的菌丝重复本操作2次对真菌进行纯化。
1.4 内生真菌的分子鉴定
收集液体培养的内生真菌菌丝体，采用液氮反复冻融3次，利用真菌 DNA 提取试剂盒（美国，Omega） 提取真菌的总DNA（龚斌等，2017）。合成S系列随机引物，对引物进行筛选，选择稳定、重复性好的引物进行下一步实验，实验的具体步骤参考龚斌等（2017）。内生真菌的ITS基因分析鉴定参考Gong et al.（2014）的方法，采用SPDA液体培养基培养5 mL真菌，10 000 r·min-1离心5 min后收集菌丝体，用液氮冻融菌丝体3次，用灭菌玻璃棒迅速将菌丝体研磨成匀浆，按照操作说明书采用真菌基因组DNA提取试剂盒（Solarbio公司）提取真菌染色体DNA，提取的DNA用NanoDrop 2000进行质量检测和定量，吸取一定量DNA，使用通用引物ITS1和ITS4扩增真菌ITS基因片段（Gong et al.， 2015），扩增出的片段经过PCR产物回收试剂盒回收后，送金唯智生物有限公司测序。
1.5 真菌次生代谢产物的提取和抑菌活性测定 接种真菌于200 mL液体SPDA培养基，200 r·min-1，26～28 ℃，发酵培养10～20 d至菌丝体长满三角瓶。8 000 r·min-1离心收集菌丝体，常温下风扇吹干水分。干燥后的菌体称取0.3 g加入5 mL提取液（乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸=80∶15∶5）浸泡，将提取液均匀吸入3个EP管，静置待提取液挥发，在EP管中分别加入有机溶剂石油醚、乙酸乙酯和甲醇来溶解提取物。抑菌活性指示菌诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）分别来自腐败的鱼肉和其他水产品，由本实验室分离保藏。分别接种到LB液体培养基中，28 ℃摇床上以200 r·min-1的转速培养过夜。将上述菌液200 μL采用混菌法接种于培养皿中，采用滤纸片法测定抑菌活性（Gong et al.， 2018）。本实验使用滤纸片分别蘸取乙酸乙酯、甲醇和乙酸作为空白对照，阳性对照为滤纸片蘸取50 μL·mL-1的卡那霉素和氯霉素。
2 结果与分析
2.1 盐角草内生真菌的分离结果
从广西北部湾钦州沿海盐田边生长的盐角草的根、茎、叶中共分离纯化得到48株内生真菌，其中茎中得到真菌22株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有5株，命名为YJCJ1、YJCJ2、YJCJ3、YJCJ4和YJCG5），根中得到12株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有6株，命名为YJCG1、YJCG2、YJCG3、YJCG4、YJCG5和YJCG6），叶中得到14株（相同菌落形态的真菌合并为一种后共有3株，命名为YJCY1、YJCY2和YJCY3）（表 1）。由表1可知，从茎中分离的真菌是最多的，但是根中得到的真菌更为丰富。
2.2 RAPD分析内生真菌多样性
对14种菌落形态有差异的内生真菌，进一步提取总DNA后，进行RAPD多样性分析（图1），通过指纹条带分析，确定有6种不同的遗传类型，其中YJCY1、YJCJ1、YJCJ3、YJCJ4、YJCJ5、YJCG1、YJCG3、YJCG4、YJCG6相同，YJCJ2和YJCG5分别为独立类型，YJCG2、YJCY2和YJCY3相似但不完全相同。
2.3 内生真菌的ITS分子鉴定
通过对14株真菌ITS序列的分析，从核酸序列数据库中找到与本研究序列相似度最高的菌株（图2），结果表明有9株与Curvularia lunata PSU-ES195的相似性最高，为99%～100%;YJCJ2与Aspergillus candidus ATCC 1002的相似性为99%;YJCG5与Guignardia mangiferae GZAAS6.1243的相似性为99%。ITS基因序列与RAPD多态性分型的分析方法得到的結果非常接近，说明RAPD在对分离的内生真菌进行类群初步划分也是非常有效的，可以节省分型的成本。
GenBank中与YJCY2、YJCY3和YJCG2相似性最高的菌株为Neocamarosporium chichastianum IBRC-M：30126（94%～95%），相似性比较低。为了进一步确定其分类地位，我们构建了YJCY2、YJCY3和YJCG2及GenBank中ITS基因序列相似性最高的菌株的系统发育树，结果表明YJCY2、YJCY3和YJCG2与Neocamarosporium salicornicola在进化树中为一个分支。Blastn分析与进化树的结果有一定差异，这可能是因为相似性和进化树的分析计算方法不同，相似性计算时只考虑比对的序列碱基中相同的碱基所占的百分比，而进化树是按Neighbour-Joining的方法对序列进行两两比较，从而计算序列中间的进化或亲缘关系，两者在概念上存在一定的差异。另外，YJCY2、YJCY3和YJCG2是否为新种有待进一步确定。
2.4 盐角草内生真菌提取物抑菌活性的测定
将所得的代谢产物和菌体浸出物用不同的有机溶剂甲醇、石油醚和乙酸乙酯提取做抑菌实验，用提取液对4种指示菌Buttiauxella gaviniae、Aeromonas dhakensis、Buttiauxella noackiae、Vibrio parahaemolyticus进行抗菌活性试验，结果表明14株内生真菌中，有4株内生真菌对一种或者多种指示菌具有抑菌活性（表3）， 其中YJCJ1对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌活性，对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌活性;YJCJ5对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌活性，且在石油醚中抑菌效果比较强，对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌活性;YJCJ3在3种溶剂中对副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）都有很强的抑菌活性，在诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）中无抑菌效果;YJCG5对诺氏布丘氏菌（Buttiauxella noackiae）、乡间布丘氏菌（Buttiauxella gaviniae）有抑菌效果，对气单胞菌（Aeromonas dhakensis）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）无抑菌效果。 3 讨论与结论
本研究从盐角草不同组织分离到形态不同的内生真菌14株，其中根部分离到的内生真菌最多，有6株，占42.86%;分离到的优势种类为Curvularia lunata，在根中占优势，叶中的优势种为Neocamarosporium chichastianum; 其他分离到的种包括Guignardia mangiferae和Aspergillus candidus。这与张志东等（2020）的研究结果不同，其中Alternaria、Cladosporium、Podospora 3个属为盐角草内生真菌优势菌群;本研究和赵育卉等（2013）报道的结果也不一样，他们分离到的真菌比较少，仅有点青霉属和镰刀菌属。本研究与这些结果的差异可能来自分离环境的差异。张志东等（2020）研究的盐角草来自新疆天山的盐渍土，赵育卉等（2013）研究的盐角草来自江苏的盐碱地，而本研究的盐角草来自北部湾的盐田，在空间上的距离比较远，其生长环境的差异也会造成其所共生的内生真菌类群不同。另外，从盐角草中分离的内生真菌相对于其他植物而言偏少，这可能是因为盐角草生长在高盐的极端环境，对内生真菌有选择作用。
本研究分离的YJCY2、YJCY3和YJCG2在进化关系上与Neocamarosporium salicornicola距离最近，Neocamarosporium salicornicola 模式种（MycoBank MB821971）2015年分离于泰国的盐角草死亡的茎，这与本研究的真菌来源植物基本相同，说明Neocamarosporium salicornicola类真菌可能是盐角草专性寄生的真菌（Wanasinghe et al.， 2017）。Wanasinghe et al.（2017）研究发现Neocamarosporium salicornicola 真菌在16 ℃ PDA培养基上培养3周时的菌落为3 cm;菌落正面为灰色，背面周围为微黄色，中间为黑色。本研究分离的真菌为菌丝为白色绒毛状，菌落中间为淡红色，存在一定差异，因此YJCY2、YJCY3和YJCG2可能为Neocamarosporium的新种，但有待进一步实验证实。
本研究分离到的菌株YJCJ3提取物表现了比较好的抑制副溶血弧菌的潜力，而YJCJ5表现了较为广谱的抑制几种水产腐败细菌Buttiauxella noackiae、Aeromonas dhakensis、Buttiauxella gaviniae的活性。YJCJ3和YJCJ5均为Curvularia属真菌。Khiralla et al.（2019）研究表明Curvularia属是产生活性次生代谢产物的“明星真菌”之一，可以从内生菌、病原菌、海葵和鱼等分离，产生抗疟疾、抗炎、抗氧化、抗菌、抗真菌和抗癌等活性物质。因为副溶血弧菌和其他几种水产腐败细菌Buttiauxella gaviniae（王发祥等，2012）、Aeromonas dhakensis （Carriero et al.， 2016）、Buttiauxella noackiae是水产品储运中较易出现的，并对人体健康有较大威胁的细菌（由高铭等，2018），所以新型保鲜剂的研发也非常紧迫（陈文慧等，2017）。本研究的结果提供了几个非常有应用前景的内生真菌，以后的研究可以考虑从这些内生真菌中提取抗菌活性物质用于抑制水产品的腐败。
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（责任编辑 何永艳）