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摘 要：以前期实验从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象，利用α-淀粉酶透明圈和α-淀粉酶活性测定相结合的方法从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株GX05。 通过形态观察及生理生化试验和16S rDNA 分子生物学鉴定为假蕈状芽孢杆菌属（Bacillus pseudomycoides），并对该菌株产酶条件进行研究，最适条件为外加碳源为葡萄糖，氮源为尿素，初始pH 6， 接种量13 % ，培养时间72 h，酶活可以达到180.12 U/g。
关键词：酱香菌株 α-淀粉酶 分离鉴定 酶活
酱香型大曲酒生产历史悠久、源远流长，是我国传统白酒三大基本香型之一，以其酱香突出、幽雅细腻、丰满味长、空杯留香持久为消费者所喜爱。高温大曲是产酱香微生物的重要来源，在发酵和贮存时微生物会分泌多种酶，这些酶不仅对原料的利用有重要作用，对于白酒风味的形成也有重要贡献[1-2]，而且积累的酶和发酵的前体物质，对白酒有重要的增香作用[3-4]。
α-淀粉酶是酿酒大曲中的重要指标，也是大部分酒厂衡量大曲质量的指标。酱香型白酒固态发酵过程中，耐高温 α-淀粉酶能在55 ℃甚至更高温度下继续分解粮食中的淀粉，提高粮食利用率。而在液态白酒生产过程中加入耐高温 α-淀粉酶，采用“中温蒸煮”法，有利于浓醪发酵并稳定出酒率，提高基酒的质量[5]。目前我国的白酒行业存在的问题是粮耗高，以及粮食利用率不高等问题，因此提高白酒原料利用率和产品质量将是今后白酒行业发展的重要方向。研究以前期从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象，利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出高产α-淀粉酶的菌株，以期提高基酒的质量和白酒原料利用率。
1 材料与方法
1.1 材料
酱香型高温大曲：由河南省驻马店市某酒厂提供。
培养基：淀粉琼脂筛选培养基（牛肉膏 0.5 %，蛋白胨1 %，氯化钠 0.5 %，可溶性淀粉 2 %，琼脂粉 2 %，121 ℃，灭菌 20 min）；种子液培养基（牛肉膏 0.5 %，NaCl 0.5 %，可溶性淀粉 0.5 %，蛋白胨 1 %，调pH 7.0）；基础发酵培养基（麸皮 10 g，K2HPO4 0.02 g，MgSO4 0.02 g，KNO3 0.3 g，水 6 mL）；斜面保藏培养基（牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，水1 L，pH7.0，1×105 Pa ，灭菌20 min）。其他试剂均为分析纯试剂。
仪器： LDKM-40KCS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SHP-250FE智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；ZWY-240恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净操作台，苏州苏洁净化设备有限公司；JB5374-91电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； PHS-3C精密pH计，上海仪电分析仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 α-淀粉酶透明圈初筛和酶活复筛
将初期已筛选得到的8株产酱香细菌分别接种到种子液培养基上进行活化，37 ℃培养18～20 h，然后分别稀释涂布于淀粉琼脂筛选培养基上，置于50 ℃恒温培养箱中培养48 h后，挑出各菌株的单菌落平板，用卢氏碘液喷洒染色至碘液将平板覆盖均匀，静置 1 min，产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株。最后挑选出产生透明圈的菌株，测定菌落直径（D1）和透明圈的直径（D2），并计算其 HC 值（D2/D1）。根据各菌种透明圈的大小，初步评价各菌株产淀粉酶的能力[6]。
将初筛菌种接种到种子培养基中，37 ℃，160 r/min，摇床培养 12 h。按照5 %的接种量将种子液接到三角瓶固料培养基中，50 ℃培养 48 h。称取 3.0 g 固体发酵物，置于100 mL 容量瓶中，用水定容，混匀后在室温（30 ℃）下放置 20 min，每隔 3 min 振荡1次，最后用滤纸过滤，取滤液测其淀粉酶活性[7-8]。
固体发酵α-淀粉酶酶活力测定：采用3，5-二硝基水杨酸显色法[9]。麦芽糖标准曲线见图1。
1.2.2 高产α-淀粉酶菌株鉴定
菌落形态观察及生理生化鉴定，参照《伯杰细菌鉴定手册》[10]。另外对该菌株进行分子生物学鉴定，菌体总DNA的提取[11]：菌株基因组用Sigmen Bacteria DNA Kit 提取，具体操作步骤按照试剂盒附带的说明书进行。16S rDNA 测序由南京金瑞斯生物工程有限公司完成。将测序结果与NCBI中的BLAST结果对比，用Neighbor-Joining[12]构建目标菌的系统发育树。
1.2.3 高产α-淀粉酶菌株产酶发酵条件研究
通过单因素试验，分别研究不同氮源（尿素，硫酸铵，硝酸铵，黄豆，蛋白胨）、不同碳源（高粱，麸皮，可溶性淀粉，葡萄糖）、初始pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、不同接种量（3 %，5 %，7 %，9 %，11 %，13 %，15 %），不同发酵时间（24、36、48、60、72、84、96 h）对产酶的影响，将目标菌株活化后，按5 %的接种量接入250 mL三角瓶基础发酵培养基。培养到最优产酶时间后，测定发酵液的淀粉酶活性，再进一步通过正交试验法确定最优发酵培养基。
2 结果与分析
2.1 高产α-淀粉酶酶活菌株的筛选
前期已从高温大曲中筛选得到8株产酱香的细菌，对8种菌透明圈的大小进行了比较，其中GX05的比值较大，为1.49。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，因此又通过固态发酵复筛测定酶活，GX05菌株酶活最高，固态发酵酶活为66.55 U/g，与初筛结果一致见表1。 2.2 菌种鉴定结果
从形态观察看该菌菌落大小适中，中央有突起，圆形，规则，颜色呈灰白色，不透明。显微镜观察菌体特征是杆状，革兰氏阳性菌，其部分生理生化特征见表2。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌的描述，初步确定GX05为芽孢杆菌类。
16S rDNA序列是细菌鉴定的重要指标，已成为现代细菌分类的重要手段。本研究通过扩增菌株GX05的16S rDNA序列，得扩增结果；将该片段用NCBI的Blast软件进行核苷酸同源性比对，得出其分类地位的系统发育树。系统发育树见图2，菌株扩增结果见图3。该菌株与Bacillus pseudomycoides DSM 12442T相似度为99 %，综合形态学及生理生化试验结果，可以初步判定GX05为假蕈状芽孢杆菌。
2.3 单因素优化结果
2.3.1 不同氮源对酶活的影响
保持碳源不变，选取不同的氮源，接种5 %的种子液于发酵培养基中，测定α-淀粉酶酶活力，结果如图4所示，其中以尿素为氮源时淀粉酶活力最高，硫酸铵次之，因此选择尿素为最佳氮源。2.3.2 不同碳源对酶活的影响
在最佳氮源确定后，改变固体发酵培养基中的碳源，当以葡萄糖为碳源加入固体发酵培养基培养48 h时，酶活力最高，其他碳源对酶活力的增加效果不明显。最终选择葡萄糖为最佳碳源，如图5。
2.3.3 初始 pH 的影响
选用上述优化好的碳源和氮源，调节培养基的初始pH，在其他成分及培养条件不变的情况下测定发酵24 h的酶活力，其中当初始 pH 为 6.0时，有利于产生α-淀粉酶，此时产酶活力最高。因此选择发酵初始pH为6.0，见图6。
2.3.4 不同接种量对酶活的影响
经优化后的培养基，按照不同比例的接种量3 %、5 %、7 %、9 %、11 %、13 %、15 %，接入种子液，50 ℃培养 52 h后测定酶活力。结果如图7所示，接种量为11 %时酶活力为最好。随着菌体接种量的增大，培养基的消耗速度也在加快，这样不利于产物的合成，因此接种量为11 %最合适。
2.3.5 不同发酵时间对酶活的影响
结合已经确定的最佳发酵条件，通过调整不同的发酵时间24、36、48、60、72、84、96 h后，对酶活力进行测定。由图8可知，产酶适宜发酵时间为60～84 h，在此时间范围内，产酶能力逐渐增强，并且在 72 h时酶活力达到最高，但是72 h 过后，产酶能力增速放缓，因此确定发酵时间为72 h。
2.4 正交试验
综合以上各单因素试验结果，选定尿素为最佳氮源，葡萄糖为最佳外加碳源，选择pH（A）、接种量（B）、发酵时间（C）设计3因素3水平的 L9（33） 正交试验（表3），试验结果见表4。
依据正交试验的直观分析结果，3 个因素对α-淀粉酶酶活力的影响大小依次为：发酵时间（C） > pH（A）>接种量（B），其中发酵时间对淀粉酶酶活的影响较为显著。由表4可知，4号试验组组合酶活力大小最高，为175.99 U/g。由均值K得出的最佳组合为A2B3C2，即pH值为6， 接种量13 % ，培养时间72 h。在此条件下进行验证试验，酶活为180.12 U/g。由表5正交试验方差分析可知，发酵时间对发酵产物α-淀粉酶酶活的影响显著，pH值和接种量对试验的结果没有显著性影响。
3 结论
从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象，利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株，酶活为66.55 U/g，经鉴定为假蕈状芽孢杆菌属（Bacillus pseudomycoides）。同时对该菌株产酶条件进行研究，最适条件为外加碳源为葡萄糖，外加氮源为尿素，初始pH 6， 接种量13 % ，培养时间72 h，此时酶活可以达到180.12 U/g。国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等[13]从土壤中筛选出1株能产 2 种α-淀粉酶的脂肪芽孢杆菌， 测定其发酵液酶活为70 U/ mL。卢涛等[7]分离到1株产α-淀粉酶的凝结芽孢杆菌， 经过诱变筛选后发酵液酶活达 100 U/mL。李习等[6]从白云边高温大曲中筛选出1株高产α-淀粉酶活力的地衣芽孢杆菌，并利用该菌制备功能性强化麸曲模拟酒厂的固态发酵过程，通过气相色谱分析得到加入该菌株强化麸曲的基酒的出酒率高，总酸和总酯含量也较高。
由于传统优质大曲的生产受到地理、气候、水质等环境条件以及在此环境中滋生和孕育的其他微生物的影响，从而阻碍了制曲生产异地化发展[14]。本研究从当地酒厂的高温大曲中筛选高液化力功能菌株，进一步改良大曲发酵功能菌群，为制曲生产异地化再现奠定基础。由于时间的问题，实验还是存在着不足。菌种产酶是多样的，液化酶只是其中一种，后期工作中将会对该菌株多种酶的代谢，以及关于菌株功能特性和大曲风味成分之间的联系做进一步研究。
参考文献
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[5] 王楠，马荣山. 耐高温α-淀粉酶的研究进展[J].中国食品添加剂， 2007（4）： 90-92. [6] 李习.高产α-淀粉酶地衣芽孢杆菌的筛选及重组质粒的构建[D]. 武汉：湖北工业大学，
2014.
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[8] 翁庆北，赵维娜，等. 茅台酒曲中产淀粉酶细菌分类及性质[J].贵州师范大学学报，2005，23（2）：20-28.
[9] 唐丽江，王振华，等. 高产淀粉酶芽孢杆菌菌株的筛选[J].安徽农业科学， 2009， 37（12）：5362-5363.
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[13] 张丽苹， 徐岩. 酸性α-淀粉酶生产菌株的选育的初步研究[J]. 工业微生物，2002，32（4）：12-14.
[14] 陈晓旭，明红梅，罗惠波，等. 浓香型大曲中1株高液化力功能细菌的筛选与鉴定[J].贵州农业科学，2015，43（7）：110-113.
Abstract：A bacterial strain GX05 with high-yield of α-amylase was screened from 8 Maotai-flavor microbial species isolated from high-temperature Daqu by the detection of transparent circle of α-amylase and its activity. It was identified as Bacillus pseudomycoides through 16S rDNA gene phylogenetic analysis. The fermentation conditions for α-amylase production optimized by the single factor experiments and the orthogonal experiments with strain GX05： glucose as external carbon source， urea as external nitrogen source， initial pH6， inoculum concentration 13%， and fermentation time 72 h； under the optimal conditions， the α-amylase activity of strain GX05 reached 180.12 U/g.
Key words：Maotai-flavor strain； α-amylase； isolation and identification；enzyme activity
关键词：酱香菌株 α-淀粉酶 分离鉴定 酶活
酱香型大曲酒生产历史悠久、源远流长，是我国传统白酒三大基本香型之一，以其酱香突出、幽雅细腻、丰满味长、空杯留香持久为消费者所喜爱。高温大曲是产酱香微生物的重要来源，在发酵和贮存时微生物会分泌多种酶，这些酶不仅对原料的利用有重要作用，对于白酒风味的形成也有重要贡献[1-2]，而且积累的酶和发酵的前体物质，对白酒有重要的增香作用[3-4]。
α-淀粉酶是酿酒大曲中的重要指标，也是大部分酒厂衡量大曲质量的指标。酱香型白酒固态发酵过程中，耐高温 α-淀粉酶能在55 ℃甚至更高温度下继续分解粮食中的淀粉，提高粮食利用率。而在液态白酒生产过程中加入耐高温 α-淀粉酶，采用“中温蒸煮”法，有利于浓醪发酵并稳定出酒率，提高基酒的质量[5]。目前我国的白酒行业存在的问题是粮耗高，以及粮食利用率不高等问题，因此提高白酒原料利用率和产品质量将是今后白酒行业发展的重要方向。研究以前期从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象，利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出高产α-淀粉酶的菌株，以期提高基酒的质量和白酒原料利用率。
1 材料与方法
1.1 材料
酱香型高温大曲：由河南省驻马店市某酒厂提供。
培养基：淀粉琼脂筛选培养基（牛肉膏 0.5 %，蛋白胨1 %，氯化钠 0.5 %，可溶性淀粉 2 %，琼脂粉 2 %，121 ℃，灭菌 20 min）；种子液培养基（牛肉膏 0.5 %，NaCl 0.5 %，可溶性淀粉 0.5 %，蛋白胨 1 %，调pH 7.0）；基础发酵培养基（麸皮 10 g，K2HPO4 0.02 g，MgSO4 0.02 g，KNO3 0.3 g，水 6 mL）；斜面保藏培养基（牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 20 g，水1 L，pH7.0，1×105 Pa ，灭菌20 min）。其他试剂均为分析纯试剂。
仪器： LDKM-40KCS立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；SHP-250FE智能生化培养箱，上海三发科学仪器有限公司；ZWY-240恒温振荡培养箱，上海智城分析仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净操作台，苏州苏洁净化设备有限公司；JB5374-91电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司； PHS-3C精密pH计，上海仪电分析仪器有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 α-淀粉酶透明圈初筛和酶活复筛
将初期已筛选得到的8株产酱香细菌分别接种到种子液培养基上进行活化，37 ℃培养18～20 h，然后分别稀释涂布于淀粉琼脂筛选培养基上，置于50 ℃恒温培养箱中培养48 h后，挑出各菌株的单菌落平板，用卢氏碘液喷洒染色至碘液将平板覆盖均匀，静置 1 min，产生透明圈的菌株初步定为淀粉酶产生菌株。最后挑选出产生透明圈的菌株，测定菌落直径（D1）和透明圈的直径（D2），并计算其 HC 值（D2/D1）。根据各菌种透明圈的大小，初步评价各菌株产淀粉酶的能力[6]。
将初筛菌种接种到种子培养基中，37 ℃，160 r/min，摇床培养 12 h。按照5 %的接种量将种子液接到三角瓶固料培养基中，50 ℃培养 48 h。称取 3.0 g 固体发酵物，置于100 mL 容量瓶中，用水定容，混匀后在室温（30 ℃）下放置 20 min，每隔 3 min 振荡1次，最后用滤纸过滤，取滤液测其淀粉酶活性[7-8]。
固体发酵α-淀粉酶酶活力测定：采用3，5-二硝基水杨酸显色法[9]。麦芽糖标准曲线见图1。
1.2.2 高产α-淀粉酶菌株鉴定
菌落形态观察及生理生化鉴定，参照《伯杰细菌鉴定手册》[10]。另外对该菌株进行分子生物学鉴定，菌体总DNA的提取[11]：菌株基因组用Sigmen Bacteria DNA Kit 提取，具体操作步骤按照试剂盒附带的说明书进行。16S rDNA 测序由南京金瑞斯生物工程有限公司完成。将测序结果与NCBI中的BLAST结果对比，用Neighbor-Joining[12]构建目标菌的系统发育树。
1.2.3 高产α-淀粉酶菌株产酶发酵条件研究
通过单因素试验，分别研究不同氮源（尿素，硫酸铵，硝酸铵，黄豆，蛋白胨）、不同碳源（高粱，麸皮，可溶性淀粉，葡萄糖）、初始pH值（4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0）、不同接种量（3 %，5 %，7 %，9 %，11 %，13 %，15 %），不同发酵时间（24、36、48、60、72、84、96 h）对产酶的影响，将目标菌株活化后，按5 %的接种量接入250 mL三角瓶基础发酵培养基。培养到最优产酶时间后，测定发酵液的淀粉酶活性，再进一步通过正交试验法确定最优发酵培养基。
2 结果与分析
2.1 高产α-淀粉酶酶活菌株的筛选
前期已从高温大曲中筛选得到8株产酱香的细菌，对8种菌透明圈的大小进行了比较，其中GX05的比值较大，为1.49。虽然透明圈的大小直接反映了酶浓度的高低，但不能完全代表菌株产酶能力，因此又通过固态发酵复筛测定酶活，GX05菌株酶活最高，固态发酵酶活为66.55 U/g，与初筛结果一致见表1。 2.2 菌种鉴定结果
从形态观察看该菌菌落大小适中，中央有突起，圆形，规则，颜色呈灰白色，不透明。显微镜观察菌体特征是杆状，革兰氏阳性菌，其部分生理生化特征见表2。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》对芽孢杆菌的描述，初步确定GX05为芽孢杆菌类。
16S rDNA序列是细菌鉴定的重要指标，已成为现代细菌分类的重要手段。本研究通过扩增菌株GX05的16S rDNA序列，得扩增结果；将该片段用NCBI的Blast软件进行核苷酸同源性比对，得出其分类地位的系统发育树。系统发育树见图2，菌株扩增结果见图3。该菌株与Bacillus pseudomycoides DSM 12442T相似度为99 %，综合形态学及生理生化试验结果，可以初步判定GX05为假蕈状芽孢杆菌。
2.3 单因素优化结果
2.3.1 不同氮源对酶活的影响
保持碳源不变，选取不同的氮源，接种5 %的种子液于发酵培养基中，测定α-淀粉酶酶活力，结果如图4所示，其中以尿素为氮源时淀粉酶活力最高，硫酸铵次之，因此选择尿素为最佳氮源。2.3.2 不同碳源对酶活的影响
在最佳氮源确定后，改变固体发酵培养基中的碳源，当以葡萄糖为碳源加入固体发酵培养基培养48 h时，酶活力最高，其他碳源对酶活力的增加效果不明显。最终选择葡萄糖为最佳碳源，如图5。
2.3.3 初始 pH 的影响
选用上述优化好的碳源和氮源，调节培养基的初始pH，在其他成分及培养条件不变的情况下测定发酵24 h的酶活力，其中当初始 pH 为 6.0时，有利于产生α-淀粉酶，此时产酶活力最高。因此选择发酵初始pH为6.0，见图6。
2.3.4 不同接种量对酶活的影响
经优化后的培养基，按照不同比例的接种量3 %、5 %、7 %、9 %、11 %、13 %、15 %，接入种子液，50 ℃培养 52 h后测定酶活力。结果如图7所示，接种量为11 %时酶活力为最好。随着菌体接种量的增大，培养基的消耗速度也在加快，这样不利于产物的合成，因此接种量为11 %最合适。
2.3.5 不同发酵时间对酶活的影响
结合已经确定的最佳发酵条件，通过调整不同的发酵时间24、36、48、60、72、84、96 h后，对酶活力进行测定。由图8可知，产酶适宜发酵时间为60～84 h，在此时间范围内，产酶能力逐渐增强，并且在 72 h时酶活力达到最高，但是72 h 过后，产酶能力增速放缓，因此确定发酵时间为72 h。
2.4 正交试验
综合以上各单因素试验结果，选定尿素为最佳氮源，葡萄糖为最佳外加碳源，选择pH（A）、接种量（B）、发酵时间（C）设计3因素3水平的 L9（33） 正交试验（表3），试验结果见表4。
依据正交试验的直观分析结果，3 个因素对α-淀粉酶酶活力的影响大小依次为：发酵时间（C） > pH（A）>接种量（B），其中发酵时间对淀粉酶酶活的影响较为显著。由表4可知，4号试验组组合酶活力大小最高，为175.99 U/g。由均值K得出的最佳组合为A2B3C2，即pH值为6， 接种量13 % ，培养时间72 h。在此条件下进行验证试验，酶活为180.12 U/g。由表5正交试验方差分析可知，发酵时间对发酵产物α-淀粉酶酶活的影响显著，pH值和接种量对试验的结果没有显著性影响。
3 结论
从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象，利用透明圈初筛和固体发酵复筛从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株，酶活为66.55 U/g，经鉴定为假蕈状芽孢杆菌属（Bacillus pseudomycoides）。同时对该菌株产酶条件进行研究，最适条件为外加碳源为葡萄糖，外加氮源为尿素，初始pH 6， 接种量13 % ，培养时间72 h，此时酶活可以达到180.12 U/g。国内学者对产生淀粉酶的芽孢杆菌的筛选、芽孢杆菌淀粉酶的性质、基因序列分析等也作了大量的研究。张丽苹等[13]从土壤中筛选出1株能产 2 种α-淀粉酶的脂肪芽孢杆菌， 测定其发酵液酶活为70 U/ mL。卢涛等[7]分离到1株产α-淀粉酶的凝结芽孢杆菌， 经过诱变筛选后发酵液酶活达 100 U/mL。李习等[6]从白云边高温大曲中筛选出1株高产α-淀粉酶活力的地衣芽孢杆菌，并利用该菌制备功能性强化麸曲模拟酒厂的固态发酵过程，通过气相色谱分析得到加入该菌株强化麸曲的基酒的出酒率高，总酸和总酯含量也较高。
由于传统优质大曲的生产受到地理、气候、水质等环境条件以及在此环境中滋生和孕育的其他微生物的影响，从而阻碍了制曲生产异地化发展[14]。本研究从当地酒厂的高温大曲中筛选高液化力功能菌株，进一步改良大曲发酵功能菌群，为制曲生产异地化再现奠定基础。由于时间的问题，实验还是存在着不足。菌种产酶是多样的，液化酶只是其中一种，后期工作中将会对该菌株多种酶的代谢，以及关于菌株功能特性和大曲风味成分之间的联系做进一步研究。
参考文献
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Abstract：A bacterial strain GX05 with high-yield of α-amylase was screened from 8 Maotai-flavor microbial species isolated from high-temperature Daqu by the detection of transparent circle of α-amylase and its activity. It was identified as Bacillus pseudomycoides through 16S rDNA gene phylogenetic analysis. The fermentation conditions for α-amylase production optimized by the single factor experiments and the orthogonal experiments with strain GX05： glucose as external carbon source， urea as external nitrogen source， initial pH6， inoculum concentration 13%， and fermentation time 72 h； under the optimal conditions， the α-amylase activity of strain GX05 reached 180.12 U/g.
Key words：Maotai-flavor strain； α-amylase； isolation and identification；enzyme activity