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摘要[目的] 探讨家蚕核型多角体病毒BmOrf99在杆状病毒生命周期中的功能。[方法] 运用Red同源重组技术构建BmOrf99缺失型重组病毒，研究BmOrf99对病毒复制、BV产生和病毒形态发生的影响。[结果]病毒转染细胞1.5 h可检测到BmOrf99表达；通过Red重组系统构建敲除型病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP，转染结果显示，敲除BmOrf99病毒仍能增殖复制，透射电镜观察显示，BmOrf99敲除对病毒粒子装配和多角体形成无明显影响。病毒DNA转染后24～72 h，敲除型病毒转染细胞培养上清BV水平略高于对照病毒BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；转染后72 h，前者细胞培养上清TCID50略高于后者；转染6～72 h，敲除型病毒转染细胞中病毒DNA水平高于对照病毒转染细胞；敲除型病毒感染72 h后，细胞中BmOrf98a表达水平比对照组提高2.21倍。[结论]BmOrf99为病毒早期基因，且复制非必需，缺失可促进病毒DNA复制，略增加BV水平，但对病毒形态发生无影响，BmOrf99有可能通过调节病毒其他基因的表达而发挥作用。
关键词家蚕核型多角体病毒；BmOrf99；敲除；BV；ODV
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-043-07
家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）属于甲型杆状病毒属，具有囊膜包被的双链环状DNA，是主要寄生于节肢动物的一类病原微生物[1]。BmNPV基因组序列测定由Gomi 等[2]于1999 年完成，其基因组DNA全长128 413 bp，G+C含量占40%，含有136个潜在的开放阅读框（open reading frame，ORF）。BmNPV与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）基因组结构非常接近，比较BmNPV和AcMNPV的核苷酸序列，发现有115个ORFs（占基因组的78%）是高度保守的（同源性超过90%），同源ORFs之间的氨基酸序列同源性达93%[3]。在杆状病毒感染复制周期中，能够形成2种不同类型的病毒粒子，一种是独特的非包涵体形态，核衣壳在细胞核内形成后，通过细胞质膜出芽时获得囊膜，并释放到细胞间质中，即出芽型病毒粒子（budded virus，BV），另外一种在细胞核内获得囊膜的病毒最后被包埋在由多角体蛋白质组成的包涵体内，被称为包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）。病毒感染周期分为2个阶段，包涵体在宿主肠内的碱性蛋白酶裂解下释放ODV，ODV感染细胞产生子代 BV，此为初级感染阶段；产生的 BV继续感染其他细胞和组织形成 ODV 和多角体，即为次级感染阶段。
杆状病毒与其他大型DNA病毒一样，其基因表达具有时序性。根据表达时间顺序可将基因分为立即早期基因、延迟早期基因、晚期基因和极晚期基因[4]，这些基因在调节病毒DNA复制、病毒基因的转录[5-6]、病毒RNA聚合酶组成[7]、病毒粒子的形成[8-9]和调控宿主基因表达[10]等方面发挥重要作用。推测约有50%数量的基因通过参与调节基因表达、DNA复制和病毒粒子装配等在病毒繁殖过程发挥关键作用；在病毒基因組中，还存在一些不参与病毒复制、表达和装配的非必需基因，这些病毒非必需基因可能通过与其病毒或者宿主基因发生交互而发挥重要作用。在AcMNPV和BmNPV中，通过基因敲除构建敲除型重组病毒已有许多基因的功能被研究，但有超过1/3的病毒基因功能仍未知[11]。
杆状病毒基因组中存在一些小开放读码框（small open reading frame，sORF），编码小于100个氨基酸残基的小肽，其中杆状病毒编码的泛素可参与病毒粒子形成、病毒出芽增殖[12]、宿主细胞凋亡调控和宿主免疫系统调控[13]。BmNPV的BmOrf99基因位于基因组（GenBank登录号：NC_001962.1）第94 540～94 725 nt区域，全长仅186 bp，可编码61个氨基酸，预计分子量为7 100 Da，但BmOrf99在病毒生活史中的作用仍不清楚。
为了探讨BmOrf99可能的功能，笔者运用Red同源重组技术构建了BmOrf99缺失型重组病毒，研究了缺失BmOrf99对病毒复制、BV产生和病毒形态发生的影响，发现BmOrf99为病毒早期基因，缺失后，对病毒的复制增殖、病毒增殖无明显影响。
1材料与方法
1.1材料
含有能够表达Red重组酶pKD46质粒的大肠杆菌BW25113菌株（BW21153/pKD46/Bac）和含有氯霉素抗性基因（cat）的pKD3质粒由江苏大学郭忠建副教授惠赠，含有helper质粒和BmNPV bacmid的大肠杆菌DH10菌株由苏州大学分子生物学实验室保存，具有AcMNPV iel启动子控制的绿色荧光蛋白基因（egfp）和自身启动子控制的多角体基因（polh）的重组pFASTbPHGFP供体质粒由苏州大学分子生物学实验室构建并保存。
1.2序列分析
BmOrf99基因序列来自BmNPV（T3株）（GenBank，NC001962），将GenBank中获得的BmOrf99蛋白序列用BLASTp搜索引擎在GenBank/EMBL等数据库中寻找同源序列。结构域利用在线软件（http：//smart.emblheidelberg.de/）进行分析。蛋白三级结构预测使用在线分析工具（http：//swissmodel.expasy.org）进行。同源序列比较运用在线软件（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）进行。基于氨基酸序列的系统进化树使用MEGA5软件中邻接（NJ）法进行分析构建。 1.3细胞培养
卵巢来源的BmN细胞以含10%胎牛血清（美国Gibco）的TC100液体培养基在27 ℃条件下培养。
1.4BmOrf99敲除型病毒Bacmid的构建与鉴定
根据Red重组系统原理设计一段同源序列对BmOrf99进行敲除，该同源序列包含氯霉素抗性（cat）基因和一段48 bp的BmOrf99同源臂。以含有cat基因的pKD3质粒为模板，以BmOrf99KO1/BmOrf99KO2为引物（表1）进行PCR扩增，获得同源序列；将该序列以电击参数为2.5 kV电压，200Ω电阻，25 μF电容进行电击转化进入含有能够表达Red重组酶的pKD46质粒的大肠杆菌BW25113感受态（BW21153/pKD46/Bac）细胞，电击后立刻加入1 ml无抗生素的LB培养基37 ℃复苏培养4 h，然后涂布培养于含氯霉素（Chl）（34 μg/ml）和卡那霉素（Kan）（50 μg/ml）的LB固体平板上。挑取克隆，并用BmOrf99KO引物对和Cat引物对（表1）进行PCR验证，将鉴定正确的重组Bacmid命名为Bm99KOBacmid。
1.5含有多角体基因和绿色荧光标记基因的BmOrf99基因缺失Bacmid的构建与鉴定
含有多角体基因和绿色荧光蛋白标记基因的BmOrf99缺失型bacmid按如下步骤构建：
①提取BmOrf99KOBacmid，电击转化菌株DH10，在含Kan、Chl的平板培养基上筛选，挑取转化子用BmOrf99KO和CAT引物对进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌株命名为BmOrf99KOBacmidDH10。
②pFASTbPHGFP供体转化BmOrf99KOBacmidDH10感受态细胞，在含Kan、四环素（Tet，10 μg/ml）、庆大霉素（Gen，7 μg/ml）、IPTG（40 μg/ml）、Xgal（20 μg/ml）的平板培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，用M13引物对（表1）进行PCR鉴定，鉴定正确的即为带多角体基因和荧光蛋白标记的BmNPVBmOrf99KOBacmid，命名为BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。
1.6含有多角体基因和绿色荧光标记基因的野生型Bacmid的构建与鉴定
pFASTbPHGFP质粒转化大肠杆菌DH10菌株，在含有Kan、Tet、Gen、IPTG、Xgal的平板上筛选，挑取白色菌落，用M13引物对进行PCR鉴定，将鉴定正确的Bacmid命名为BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。
1.7重组病毒的构建
将生长状态良好的家蚕BmN细胞铺于细胞瓶或6孔板中，掌握细胞密度为1×105/ml，27 ℃培养12 h，使细胞完全贴壁。取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各1 μg，与2 μl脂质体混匀，转染家蚕BmN细胞并于27 ℃培养，3 d后在绿色荧光显微镜下观察细胞发病情况，收集上清转接正常BmN，收集上清，即成功获得重组型病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。
1.8BmOrf99基因转录时相检测
取3 μg重组质粒BmNPVBmOrf99WTpolhGFP与脂质体混合后转染BmN细胞（5.6×105个），于转染后0、1.5、3.0、4.5和6.0 h分别收集BmN细胞，提取细胞总RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能带入的基因组污染，并用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。取2 μg RNA，反转录合成cDNA。用BmOrf99特异性引物BmOrf99 RT1/BmOrf99 RT2（表1），按以下条件进行PCR反应：94 ℃ 1 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环；最后72 ℃延伸2 min。以A3action基因作为内参。反应结束后，取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.9BV产量与TCID50测定
分别取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg与脂质体混合后分别转染BmN细胞（5.6×105个），按转后6、12、24、48、72和96 h收集细胞培养上清，离心（5 000 r/min，5 min）去除细胞碎片。取转染后不同时间点收集的细胞培养上清250 μl，利用viral DNA Kit（OMEGA）抽提试剂盒按说明书所述步骤提取病毒DNA，用QBV1/QBV2为引物（表1）进行qPCR定量检测。反应体系为：模板DNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa）10 μl，引物0.5 μl （20 μmol/L），加H2O至总体积20 μl；反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。同时，提取转染BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 72 h后上清病毒DNA，并测定其OD值，将此DNA经10倍梯度稀释为模板进行qPCR，根据qPCR结果，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线，并进一步根据标准曲线计算不同转染时间细胞上清中的BV水平。
对病毒转染6和72 h的细胞培养上清，进一步通过终点稀释法测定了TCID50。主要步骤为：将待測样品用培养基作10倍梯度稀释，制备不同稀释度的病毒悬液，即10-1、10-2、10-3……10-9；在96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，各孔细胞分别接种100 μl不同稀释度的病毒悬液，每一个稀释度的病毒设置8个重复。27 ℃培养，逐日观察细胞病变并记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID50。以未转染病毒的BmN细胞培养上清为对照。 1.10病毒DNA的复制分析
分别取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg与脂质体混合后分别转染BmN细胞（5.6×105个），按转后6、12、24、48、72和96 h收集细胞离心（5 000 r/min，5 min）去上清，用酚氯仿法抽提细胞总DNA。用于检测病毒DNA复制的引物qPCRDF/qPCRDB可扩增BmNPV gp41基因的部分序列（100 bp），该序列内存在3个Dpn I酶切位点。因为Dpn I只能识别甲基化的位点，所以可利用Dpn I消除转染的Bacmid DNA，而在细胞内复制的病毒DNA不能被酶切。取从不同样品中提取的总DNA 1.324 μg，用Dpn I酶切过夜，以酶切后的DNA经10倍梯度稀释为模板进行qPCR检测。qPCR的反应体系：8 μl病毒DNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），补水至总体积为20 μl。反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。同时，将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，根据qPCR结果，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线，并进一步根据标准曲线计算不同转染时间细胞内的病毒DNA水平。
1.11透射电镜观察
为了探讨BmOrf99基因的敲除对病毒形态发生的影响，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞72 h后，收集细胞，PBS洗涤细胞3次，用2.5%戊二醛4 ℃固定过夜。离心弃固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min，洗去多余的戊二醛；用1%锇酸溶液固定样品1 h；倒掉固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用梯度浓度（包括50%、70%、80%、90%、95%和100%）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用纯丙酮处理20 min；用包埋剂（环氧树脂618）与丙酮的混合液（V/V=1∶1）处理样品1 h后，再用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3∶1）处理样品3 h，然后纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中制作超薄切片，切片经过柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液染色后，即可在日本JEOL公司的JEM1230型透射电镜下以120 kV的电压观察超薄切片并拍照。
1.12敲除BmOrf99对其重叠基因BmOrf98a表达量的影响
在BmNPV基因组中BmORF99的3′端与BmOrf98a的3′端部分重叠，其ORF分别位于DNA的不同链上，为了分析敲除BmOrf99对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响，取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各10 μl分别感染BmN细胞（5.6×105个），于感染72 h后分别收集BmN细胞，提取细胞总RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能带入的基因组污染，并用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。分别取2 μg RNA，反转录合成cDNA。用BmOrf98a特异性引物BmOrf98a RT1/BmOrf98a RT2（表1），以A3action基因作为内参。qPCR的反应体系：2 μl cDNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），补水至总体积为20 μl。反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。
2结果与分析
2.1BmOrf99基因的序列分析
BmOrf99基因位于BmNPV基因组94 540～94 725 nt，该基因的ORF 为185 bp，编码61个氨基酸，理论分子量为7 100 Da。结构域的预测分析显示，该蛋白含有1个跨膜结构，N端1～3氨基酸为膜外结构域，4～23氨基酸为跨膜结构域，24～61氨基酸为膜内结构域；蛋白三级结构预测结果显示，BmOrf99的三级结构有1个螺旋结构。
使用在线软件对BmOrf99蛋白序列同源性进行分析（图1A），发现BmOrf99与中国野桑蚕NPV 的类Ac122蛋白、灰色尺蠖蛾NPV的假设蛋白和苜蓿丫纹夜蛾NPV的Ac122的同源性分别为98%、92%、90%，而与其他杆状病毒的BmOrf99同源体的同源性较低。基于氨基酸序列的进化分析结果显示，BmOrf99和中国野桑蚕NPV 的类Ac122蛋白亲缘关系最接近（图1B）。
2.2BmOrf99KOBacmid、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP、BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的鉴定
为了检测BmOrf99基因是否通过Red重组被cat基因取代，用CAT引物对和BmOrf99KO引物对对BmOrf99敲除型病毒 bacmid进行PCR鉴定，电泳结果显示，可分别扩增出约500和1 100 bp的片段（图2A），与理论值相符，说明通过γRed同源重组技术已获得Orf99缺失型bacmid（BmOrf99KOBacmid）。
nucleopolyhedrovirus）Orf99（GenBank登录号：NP_047519.1）；Ac122like protein，野桑蚕核型多角体病毒（Bombyx mandarina nucleopolyhedrovirus）类Ac122蛋白（GenBank登录号：YP_002884344.1）；hypothetical protein，灰色尺蠖蛾多角体病毒（Rachiplusia ou MNPV）的假设蛋白（GenBank登录号：NP_703109.1）；AcOrf122 peptide，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus）AcOrf122多肽（GenBank登录号：NP_054152.1）；hypothetical protein（2），金翅夜蛾亚科核型多角体病毒（Thysanoplusia orichalcea nucleopolyhedrovirus）假设蛋白（2）（GenBank登录号：YP_007250527.1）；DekiORF33，思茅松毛虫核型多角体病毒（Dendrolimus kikuchii nucleopolyhedrovirus）ORF 33（GenBank登录号：AFS51911.1）；hypothetical protein AGNV_gp120，大豆夜蛾核型多角体病毒（Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus）假设蛋白AGNV_gp120（GenBank登录号：YP_803514.1）；hypothetical protein CFDNVgORF117，東部云杉色卷蛾DEF多样核型多角体病毒（Choristoneura fumiferana DEF multiple nucleopolyhedrovirus）假设蛋白CFDNVgORF117（GenBanK登录号：NP_932726.1）；hypothetical protein chmu038，欧洲云杉卷叶蛾杆状病毒（Choristoneura murinana alphabaculovirus）假设蛋白chmu038（GenBank登录号：YP_008992130.1）。 2为BmOrf99KO引物对PCR扩增产物。
B.BmNPVBmOrf99WTpolhGFP、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的PCR鉴定，M为DNA 1 kb Marker，3为BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的M13引物对PCR扩增产物，4为BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的 M13引物对PCR扩增产物。
C.野生型WTBacmid的PCR鉴定，M为DNA 1 kb Marker，5为野生型WTBacmid的M13引物对PCR扩增产物。
BmOrf99 KOBacmid电转进入DH10后获得BmOrf99 KOBacmidDH10菌株，然后，再用pFastBacPHGFP转化，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落用M13引物进行PCR鉴定，结果可扩增出与理论值相符的5.5 kb的特异性条带（图2B），表明通过BactoBac系统已按试验设计获得了具有多角体蛋白基因和GFP标记的Orf99 缺失重组Bacmid BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。同样，用供体质粒pFastBacPHGFP转化含有野生型Bacmid的DH10B，通过筛选、鉴定获得了具有多角体蛋白基因和GFP标记的Orf99 非缺失型重组Bacmid BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（图2B），用M13引物对其进行PCR鉴定，可扩增出5.5 kb的特异性条带，而野生型Bacmid只可扩增出300 bp左右的特异性条带（图2C）。
2.3BmOrf99基因表达时相分析
病毒转染细胞后，通过qPCR检测不同转染时间 BmOrf99的表达，结果显示，病毒转染1.5 h后就可以检测到BmOrf99的表达，之后表达水平逐渐升高（图3），表明Orf99是一个早期基因。
2.4BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞的荧光观察
用BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP分别转染家蚕卵巢细胞，24 h后可观察到少量细胞发出绿色荧光，说明GFP表达元件正确表达；48 h后，绿色荧光细胞数量明显增加，部分细胞明显变圆，72 h后，细胞体积进一步增大，部分细胞上浮，出现明显的细胞病变。比较2种重组Bacmid转染细胞引起的细胞病变，发现二者之间无明显差异（图4），说明BmOrf99缺失后，病毒仍能增殖，BmOrf99为BmNPV复制非必需基因。
2.5BmOrf99敲除对BV产量的影响
为了检测BmOrf99敲除对BV产量的影响，将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线（图5A），再进一步根据标准曲线计算病毒DNA转染后不同时间培养细胞上清中的BV水平。结果显示，在转染6～12 h ，培养细胞上清中的BV水平在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP无明显差异；转染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP
转染细胞培养上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；96 h后BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞中BV水平差异不明显（图5B）；TCID50测定结果显示，在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染6 h的培养细胞上清中，几乎检测不到病毒，而转染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞培养上清的TCID50略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（图5C）。对2种重组病毒的TCID50进行差异性分析，不存在显著性差异（P>0.05）。
图5BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的BV转染细胞培养上清中BV增长曲线及TCID50
2.6BmOrf99敲除对病毒DNA复制的影响
将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线（图6A），再进一步根据标准曲线计算转染后不同时间培养细胞中的病毒DNA水平。结果显示，在转染6～72 h，各个转染时间点BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染的细胞，至转染后96 h，2种病毒转染细胞中的病毒DNA水平没有明显差异（图6B）。
2.7BmOrf99敲除对病毒形态发生的影响
BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉染BmN细胞72 h后，用透射电镜观察病毒的形态发生。由图7可见，在转染细胞中可观察到游离的完整病毒粒子，也可观察到包埋进多角体的病毒粒子，子代病毒的形态发生与BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP间并无异样。
2.8BmOrf99敲除对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响
BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞后，通过qPCR检测BmOrf99敲除对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响。结果显示（图8），在感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染细胞中BmOrf98a表达水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞提高221倍，差异达到显著水平（P值=0.004 6<0.05，t=7.671）。
3讨论
BmOrf99为编码61氨基酸的小ORF，同源搜寻结果显示，在登录的杆状病毒全基因组序列中[14]，仅有8种杆状病毒含有BmOrf99的同源基因；同源性比对分析发现，BmNPV Orf99与野桑蚕NPV、灰色尺蠖蛾NPV、苜蓿银纹夜蛾核NPV 的相应蛋白有较高的同源性，与其他杆状病毒的蛋白几乎无同源性，暗示该基因并不是核型多角体病毒中的功能性保守基因，并不是不可或缺的[15]。 对BmOrf99基因起始密码ATG上游序列的分析显示，发现该基因既含有早期转录起始位点CACT和TATA，同时也具有晚期转录起始位点GTAAA，说明BmOrf99既是一个早期转录基因也是一个晚期转录基因。BmOrf99基因的转录分析结果显示，在病毒转染1.5 h后，就可以检测BmOrf99转录，之后转录水平逐渐提高，该结果与BmOrf基因启动子区域序列分析结果相一致，推测BmOrf99可能参与病毒基因的转录调控[16]。该研究的qPCR分析结果显示，在病毒感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染细胞中BmOrf98a表达水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞提高221倍，推測BmOrf99对BmOrf98a基因表达有调控作用，BmOrf99可能通过调控病毒其他基因的表达而发挥作用。
为进一步研究BmOrf99基因在BmNPV生命周期中的功能，运用杆状病毒BactoBac表达系统和Red重组系统构建了一个BmOrf99敲除型重组病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。试验结果显示，BmOrf99基因敲除后的重组病毒仍能增殖、转染引起的细胞病变与野生病毒并无明显差异，因此可以认为BmOrf99为BmNPV复制非必需基因，缺失不影响病毒在BmN细胞间传播。透射电镜观察结果显示，在BmNPVBmOrf99 KOBacmid转染的BmN细胞中，病毒发生基质、病毒粒子的形态发生和多角体对病毒的包埋均与野生病毒无明显差异，表明BmOrf99缺失对病毒粒子及包涵体形态发生无影响。
BmNPV基因组约有30个可编码100左右氨基酸残基的小ORF，其中一些sORF功能已经被探究，敲除ORF143发现病毒感染速度明显降低，缺失Orf64基因严重影响病毒的感染性，而Lef10为病毒复制必需基因[11]。该研究结果显示，转染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞培养上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；转染72 h后，前者TCID50高于后者，推测缺失BmOrf99有提高BV产量的倾向；转染细胞中病毒DNA水平检测结果显示，在转染6～72 h，各个转染时间点BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染的细胞，说明缺失BmOrf99可提高病毒DNA的复制水平，缺失BmOrf99引起BV产量提高与病毒DNA的复制水平提高有关。
2012年Ono等运用杆状病毒表达系统和Red重组系统，分别构建了 BmNPV中141个基因的敲除型病毒，综合分析了BmNPV基因组中基因在病毒间感染或病毒、宿主之间的相互作用，并按照敲除后不同的表现型将这141个基因分成4类[11]（A、B、C、D），其中A类特点是敲除掉目的基因后产生的子代病毒感染速率和对照组一样，但GFP表达不如对照组。B类是敲除掉目的基因后产生的子代病毒感染速度明显降低，这可能是由于子代病毒产量低或者产生的子代病毒感染性低，例如敲除Bm15、Bm65、gp41和Bm131基因。C类是敲除掉目的基因后产生的子代病毒在细胞间无感染性，但是细胞内多角体仍能形成，这些基因在BmNPV形态发生上起到重要作用。例如lef1（Bm6）、lef2（Bm135）和dnapol（Bm53），它们仍是DNA复制所必需的[17-19]，而不是多角体蛋白表达所必需的。D类特点是敲除掉目的基因后GFP不表达也不能产生可感染性的子代病毒，这类基因参与病毒复制或作为病毒RNA聚合酶调控晚期基因表达[6，17-18]，在病毒复制和多角体蛋白形成方面起到必不可少的作用。而该研究结果显示，BmOrf99敲除后，病毒DNA水平提高，BV产量有增加倾向，而病毒的形态发生无明显变化，说明BmOrf99与上述BmNPV的A、B、C和D 4类基因不同。
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关键词家蚕核型多角体病毒；BmOrf99；敲除；BV；ODV
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-043-07
家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）属于甲型杆状病毒属，具有囊膜包被的双链环状DNA，是主要寄生于节肢动物的一类病原微生物[1]。BmNPV基因组序列测定由Gomi 等[2]于1999 年完成，其基因组DNA全长128 413 bp，G+C含量占40%，含有136个潜在的开放阅读框（open reading frame，ORF）。BmNPV与苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）基因组结构非常接近，比较BmNPV和AcMNPV的核苷酸序列，发现有115个ORFs（占基因组的78%）是高度保守的（同源性超过90%），同源ORFs之间的氨基酸序列同源性达93%[3]。在杆状病毒感染复制周期中，能够形成2种不同类型的病毒粒子，一种是独特的非包涵体形态，核衣壳在细胞核内形成后，通过细胞质膜出芽时获得囊膜，并释放到细胞间质中，即出芽型病毒粒子（budded virus，BV），另外一种在细胞核内获得囊膜的病毒最后被包埋在由多角体蛋白质组成的包涵体内，被称为包埋型病毒粒子（occlusion derived virus，ODV）。病毒感染周期分为2个阶段，包涵体在宿主肠内的碱性蛋白酶裂解下释放ODV，ODV感染细胞产生子代 BV，此为初级感染阶段；产生的 BV继续感染其他细胞和组织形成 ODV 和多角体，即为次级感染阶段。
杆状病毒与其他大型DNA病毒一样，其基因表达具有时序性。根据表达时间顺序可将基因分为立即早期基因、延迟早期基因、晚期基因和极晚期基因[4]，这些基因在调节病毒DNA复制、病毒基因的转录[5-6]、病毒RNA聚合酶组成[7]、病毒粒子的形成[8-9]和调控宿主基因表达[10]等方面发挥重要作用。推测约有50%数量的基因通过参与调节基因表达、DNA复制和病毒粒子装配等在病毒繁殖过程发挥关键作用；在病毒基因組中，还存在一些不参与病毒复制、表达和装配的非必需基因，这些病毒非必需基因可能通过与其病毒或者宿主基因发生交互而发挥重要作用。在AcMNPV和BmNPV中，通过基因敲除构建敲除型重组病毒已有许多基因的功能被研究，但有超过1/3的病毒基因功能仍未知[11]。
杆状病毒基因组中存在一些小开放读码框（small open reading frame，sORF），编码小于100个氨基酸残基的小肽，其中杆状病毒编码的泛素可参与病毒粒子形成、病毒出芽增殖[12]、宿主细胞凋亡调控和宿主免疫系统调控[13]。BmNPV的BmOrf99基因位于基因组（GenBank登录号：NC_001962.1）第94 540～94 725 nt区域，全长仅186 bp，可编码61个氨基酸，预计分子量为7 100 Da，但BmOrf99在病毒生活史中的作用仍不清楚。
为了探讨BmOrf99可能的功能，笔者运用Red同源重组技术构建了BmOrf99缺失型重组病毒，研究了缺失BmOrf99对病毒复制、BV产生和病毒形态发生的影响，发现BmOrf99为病毒早期基因，缺失后，对病毒的复制增殖、病毒增殖无明显影响。
1材料与方法
1.1材料
含有能够表达Red重组酶pKD46质粒的大肠杆菌BW25113菌株（BW21153/pKD46/Bac）和含有氯霉素抗性基因（cat）的pKD3质粒由江苏大学郭忠建副教授惠赠，含有helper质粒和BmNPV bacmid的大肠杆菌DH10菌株由苏州大学分子生物学实验室保存，具有AcMNPV iel启动子控制的绿色荧光蛋白基因（egfp）和自身启动子控制的多角体基因（polh）的重组pFASTbPHGFP供体质粒由苏州大学分子生物学实验室构建并保存。
1.2序列分析
BmOrf99基因序列来自BmNPV（T3株）（GenBank，NC001962），将GenBank中获得的BmOrf99蛋白序列用BLASTp搜索引擎在GenBank/EMBL等数据库中寻找同源序列。结构域利用在线软件（http：//smart.emblheidelberg.de/）进行分析。蛋白三级结构预测使用在线分析工具（http：//swissmodel.expasy.org）进行。同源序列比较运用在线软件（http：//multalin.toulouse.inra.fr/multalin/）进行。基于氨基酸序列的系统进化树使用MEGA5软件中邻接（NJ）法进行分析构建。 1.3细胞培养
卵巢来源的BmN细胞以含10%胎牛血清（美国Gibco）的TC100液体培养基在27 ℃条件下培养。
1.4BmOrf99敲除型病毒Bacmid的构建与鉴定
根据Red重组系统原理设计一段同源序列对BmOrf99进行敲除，该同源序列包含氯霉素抗性（cat）基因和一段48 bp的BmOrf99同源臂。以含有cat基因的pKD3质粒为模板，以BmOrf99KO1/BmOrf99KO2为引物（表1）进行PCR扩增，获得同源序列；将该序列以电击参数为2.5 kV电压，200Ω电阻，25 μF电容进行电击转化进入含有能够表达Red重组酶的pKD46质粒的大肠杆菌BW25113感受态（BW21153/pKD46/Bac）细胞，电击后立刻加入1 ml无抗生素的LB培养基37 ℃复苏培养4 h，然后涂布培养于含氯霉素（Chl）（34 μg/ml）和卡那霉素（Kan）（50 μg/ml）的LB固体平板上。挑取克隆，并用BmOrf99KO引物对和Cat引物对（表1）进行PCR验证，将鉴定正确的重组Bacmid命名为Bm99KOBacmid。
1.5含有多角体基因和绿色荧光标记基因的BmOrf99基因缺失Bacmid的构建与鉴定
含有多角体基因和绿色荧光蛋白标记基因的BmOrf99缺失型bacmid按如下步骤构建：
①提取BmOrf99KOBacmid，电击转化菌株DH10，在含Kan、Chl的平板培养基上筛选，挑取转化子用BmOrf99KO和CAT引物对进行PCR鉴定，将鉴定正确的菌株命名为BmOrf99KOBacmidDH10。
②pFASTbPHGFP供体转化BmOrf99KOBacmidDH10感受态细胞，在含Kan、四环素（Tet，10 μg/ml）、庆大霉素（Gen，7 μg/ml）、IPTG（40 μg/ml）、Xgal（20 μg/ml）的平板培养基上进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，用M13引物对（表1）进行PCR鉴定，鉴定正确的即为带多角体基因和荧光蛋白标记的BmNPVBmOrf99KOBacmid，命名为BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。
1.6含有多角体基因和绿色荧光标记基因的野生型Bacmid的构建与鉴定
pFASTbPHGFP质粒转化大肠杆菌DH10菌株，在含有Kan、Tet、Gen、IPTG、Xgal的平板上筛选，挑取白色菌落，用M13引物对进行PCR鉴定，将鉴定正确的Bacmid命名为BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。
1.7重组病毒的构建
将生长状态良好的家蚕BmN细胞铺于细胞瓶或6孔板中，掌握细胞密度为1×105/ml，27 ℃培养12 h，使细胞完全贴壁。取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各1 μg，与2 μl脂质体混匀，转染家蚕BmN细胞并于27 ℃培养，3 d后在绿色荧光显微镜下观察细胞发病情况，收集上清转接正常BmN，收集上清，即成功获得重组型病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP。
1.8BmOrf99基因转录时相检测
取3 μg重组质粒BmNPVBmOrf99WTpolhGFP与脂质体混合后转染BmN细胞（5.6×105个），于转染后0、1.5、3.0、4.5和6.0 h分别收集BmN细胞，提取细胞总RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能带入的基因组污染，并用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。取2 μg RNA，反转录合成cDNA。用BmOrf99特异性引物BmOrf99 RT1/BmOrf99 RT2（表1），按以下条件进行PCR反应：94 ℃ 1 min，94 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，共40个循环；最后72 ℃延伸2 min。以A3action基因作为内参。反应结束后，取5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。
1.9BV产量与TCID50测定
分别取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg与脂质体混合后分别转染BmN细胞（5.6×105个），按转后6、12、24、48、72和96 h收集细胞培养上清，离心（5 000 r/min，5 min）去除细胞碎片。取转染后不同时间点收集的细胞培养上清250 μl，利用viral DNA Kit（OMEGA）抽提试剂盒按说明书所述步骤提取病毒DNA，用QBV1/QBV2为引物（表1）进行qPCR定量检测。反应体系为：模板DNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa）10 μl，引物0.5 μl （20 μmol/L），加H2O至总体积20 μl；反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。同时，提取转染BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 72 h后上清病毒DNA，并测定其OD值，将此DNA经10倍梯度稀释为模板进行qPCR，根据qPCR结果，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线，并进一步根据标准曲线计算不同转染时间细胞上清中的BV水平。
对病毒转染6和72 h的细胞培养上清，进一步通过终点稀释法测定了TCID50。主要步骤为：将待測样品用培养基作10倍梯度稀释，制备不同稀释度的病毒悬液，即10-1、10-2、10-3……10-9；在96孔细胞培养板中，每孔加入100 μl细胞悬液，各孔细胞分别接种100 μl不同稀释度的病毒悬液，每一个稀释度的病毒设置8个重复。27 ℃培养，逐日观察细胞病变并记录结果。按Reed和Muench两氏法计算TCID50。以未转染病毒的BmN细胞培养上清为对照。 1.10病毒DNA的复制分析
分别取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 3 μg与脂质体混合后分别转染BmN细胞（5.6×105个），按转后6、12、24、48、72和96 h收集细胞离心（5 000 r/min，5 min）去上清，用酚氯仿法抽提细胞总DNA。用于检测病毒DNA复制的引物qPCRDF/qPCRDB可扩增BmNPV gp41基因的部分序列（100 bp），该序列内存在3个Dpn I酶切位点。因为Dpn I只能识别甲基化的位点，所以可利用Dpn I消除转染的Bacmid DNA，而在细胞内复制的病毒DNA不能被酶切。取从不同样品中提取的总DNA 1.324 μg，用Dpn I酶切过夜，以酶切后的DNA经10倍梯度稀释为模板进行qPCR检测。qPCR的反应体系：8 μl病毒DNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），补水至总体积为20 μl。反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。同时，将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，根据qPCR结果，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线，并进一步根据标准曲线计算不同转染时间细胞内的病毒DNA水平。
1.11透射电镜观察
为了探讨BmOrf99基因的敲除对病毒形态发生的影响，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞72 h后，收集细胞，PBS洗涤细胞3次，用2.5%戊二醛4 ℃固定过夜。离心弃固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min，洗去多余的戊二醛；用1%锇酸溶液固定样品1 h；倒掉固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸缓冲液漂洗样品3次，每次15 min；用梯度浓度（包括50%、70%、80%、90%、95%和100%）的乙醇溶液对样品进行脱水处理，每种浓度处理15 min，再用纯丙酮处理20 min；用包埋剂（环氧树脂618）与丙酮的混合液（V/V=1∶1）处理样品1 h后，再用包埋剂与丙酮的混合液（V/V=3∶1）处理样品3 h，然后纯包埋剂处理样品过夜；将经过渗透处理的样品包埋起来，70 ℃加热过夜，即得到包埋好的样品。样品在Reichert超薄切片机中制作超薄切片，切片经过柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液染色后，即可在日本JEOL公司的JEM1230型透射电镜下以120 kV的电压观察超薄切片并拍照。
1.12敲除BmOrf99对其重叠基因BmOrf98a表达量的影响
在BmNPV基因组中BmORF99的3′端与BmOrf98a的3′端部分重叠，其ORF分别位于DNA的不同链上，为了分析敲除BmOrf99对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响，取BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP 各10 μl分别感染BmN细胞（5.6×105个），于感染72 h后分别收集BmN细胞，提取细胞总RNA，用DNase I（TaKaRa）消化，去除可能带入的基因组污染，并用紫外分光光度计检测RNA的纯度及浓度。分别取2 μg RNA，反转录合成cDNA。用BmOrf98a特异性引物BmOrf98a RT1/BmOrf98a RT2（表1），以A3action基因作为内参。qPCR的反应体系：2 μl cDNA，10 μl SYBR Premix Ex Taq TM（TaKaRa），引物0.5 μl（20 μmol/L），补水至总体积为20 μl。反应程序：95 ℃ 3 min后，按 95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，扩增40个循环。试验重复3次。
2结果与分析
2.1BmOrf99基因的序列分析
BmOrf99基因位于BmNPV基因组94 540～94 725 nt，该基因的ORF 为185 bp，编码61个氨基酸，理论分子量为7 100 Da。结构域的预测分析显示，该蛋白含有1个跨膜结构，N端1～3氨基酸为膜外结构域，4～23氨基酸为跨膜结构域，24～61氨基酸为膜内结构域；蛋白三级结构预测结果显示，BmOrf99的三级结构有1个螺旋结构。
使用在线软件对BmOrf99蛋白序列同源性进行分析（图1A），发现BmOrf99与中国野桑蚕NPV 的类Ac122蛋白、灰色尺蠖蛾NPV的假设蛋白和苜蓿丫纹夜蛾NPV的Ac122的同源性分别为98%、92%、90%，而与其他杆状病毒的BmOrf99同源体的同源性较低。基于氨基酸序列的进化分析结果显示，BmOrf99和中国野桑蚕NPV 的类Ac122蛋白亲缘关系最接近（图1B）。
2.2BmOrf99KOBacmid、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP、BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的鉴定
为了检测BmOrf99基因是否通过Red重组被cat基因取代，用CAT引物对和BmOrf99KO引物对对BmOrf99敲除型病毒 bacmid进行PCR鉴定，电泳结果显示，可分别扩增出约500和1 100 bp的片段（图2A），与理论值相符，说明通过γRed同源重组技术已获得Orf99缺失型bacmid（BmOrf99KOBacmid）。
nucleopolyhedrovirus）Orf99（GenBank登录号：NP_047519.1）；Ac122like protein，野桑蚕核型多角体病毒（Bombyx mandarina nucleopolyhedrovirus）类Ac122蛋白（GenBank登录号：YP_002884344.1）；hypothetical protein，灰色尺蠖蛾多角体病毒（Rachiplusia ou MNPV）的假设蛋白（GenBank登录号：NP_703109.1）；AcOrf122 peptide，苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒（Autographa californica nucleopolyhedrovirus）AcOrf122多肽（GenBank登录号：NP_054152.1）；hypothetical protein（2），金翅夜蛾亚科核型多角体病毒（Thysanoplusia orichalcea nucleopolyhedrovirus）假设蛋白（2）（GenBank登录号：YP_007250527.1）；DekiORF33，思茅松毛虫核型多角体病毒（Dendrolimus kikuchii nucleopolyhedrovirus）ORF 33（GenBank登录号：AFS51911.1）；hypothetical protein AGNV_gp120，大豆夜蛾核型多角体病毒（Anticarsia gemmatalis nucleopolyhedrovirus）假设蛋白AGNV_gp120（GenBank登录号：YP_803514.1）；hypothetical protein CFDNVgORF117，東部云杉色卷蛾DEF多样核型多角体病毒（Choristoneura fumiferana DEF multiple nucleopolyhedrovirus）假设蛋白CFDNVgORF117（GenBanK登录号：NP_932726.1）；hypothetical protein chmu038，欧洲云杉卷叶蛾杆状病毒（Choristoneura murinana alphabaculovirus）假设蛋白chmu038（GenBank登录号：YP_008992130.1）。 2为BmOrf99KO引物对PCR扩增产物。
B.BmNPVBmOrf99WTpolhGFP、BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的PCR鉴定，M为DNA 1 kb Marker，3为BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的M13引物对PCR扩增产物，4为BmNPVBmOrf99KOpolhGFP的 M13引物对PCR扩增产物。
C.野生型WTBacmid的PCR鉴定，M为DNA 1 kb Marker，5为野生型WTBacmid的M13引物对PCR扩增产物。
BmOrf99 KOBacmid电转进入DH10后获得BmOrf99 KOBacmidDH10菌株，然后，再用pFastBacPHGFP转化，蓝白斑筛选，挑取白色单菌落用M13引物进行PCR鉴定，结果可扩增出与理论值相符的5.5 kb的特异性条带（图2B），表明通过BactoBac系统已按试验设计获得了具有多角体蛋白基因和GFP标记的Orf99 缺失重组Bacmid BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。同样，用供体质粒pFastBacPHGFP转化含有野生型Bacmid的DH10B，通过筛选、鉴定获得了具有多角体蛋白基因和GFP标记的Orf99 非缺失型重组Bacmid BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（图2B），用M13引物对其进行PCR鉴定，可扩增出5.5 kb的特异性条带，而野生型Bacmid只可扩增出300 bp左右的特异性条带（图2C）。
2.3BmOrf99基因表达时相分析
病毒转染细胞后，通过qPCR检测不同转染时间 BmOrf99的表达，结果显示，病毒转染1.5 h后就可以检测到BmOrf99的表达，之后表达水平逐渐升高（图3），表明Orf99是一个早期基因。
2.4BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞的荧光观察
用BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和 BmNPVBmOrf99WTpolhGFP分别转染家蚕卵巢细胞，24 h后可观察到少量细胞发出绿色荧光，说明GFP表达元件正确表达；48 h后，绿色荧光细胞数量明显增加，部分细胞明显变圆，72 h后，细胞体积进一步增大，部分细胞上浮，出现明显的细胞病变。比较2种重组Bacmid转染细胞引起的细胞病变，发现二者之间无明显差异（图4），说明BmOrf99缺失后，病毒仍能增殖，BmOrf99为BmNPV复制非必需基因。
2.5BmOrf99敲除对BV产量的影响
为了检测BmOrf99敲除对BV产量的影响，将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线（图5A），再进一步根据标准曲线计算病毒DNA转染后不同时间培养细胞上清中的BV水平。结果显示，在转染6～12 h ，培养细胞上清中的BV水平在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP无明显差异；转染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP
转染细胞培养上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；96 h后BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染细胞中BV水平差异不明显（图5B）；TCID50测定结果显示，在BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染6 h的培养细胞上清中，几乎检测不到病毒，而转染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞培养上清的TCID50略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP（图5C）。对2种重组病毒的TCID50进行差异性分析，不存在显著性差异（P>0.05）。
图5BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP的BV转染细胞培养上清中BV增长曲线及TCID50
2.6BmOrf99敲除对病毒DNA复制的影响
将已知浓度的病毒DNA经10倍梯度系列稀释后为模板进行qPCR，绘制病毒DNA浓度与Ct值的标准曲线（图6A），再进一步根据标准曲线计算转染后不同时间培养细胞中的病毒DNA水平。结果显示，在转染6～72 h，各个转染时间点BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染的细胞，至转染后96 h，2种病毒转染细胞中的病毒DNA水平没有明显差异（图6B）。
2.7BmOrf99敲除对病毒形态发生的影响
BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP轉染BmN细胞72 h后，用透射电镜观察病毒的形态发生。由图7可见，在转染细胞中可观察到游离的完整病毒粒子，也可观察到包埋进多角体的病毒粒子，子代病毒的形态发生与BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP间并无异样。
2.8BmOrf99敲除对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响
BmNPVBmOrf99KOpolhGFP和BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞后，通过qPCR检测BmOrf99敲除对其重叠基因BmOrf98a表达水平的影响。结果显示（图8），在感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染细胞中BmOrf98a表达水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞提高221倍，差异达到显著水平（P值=0.004 6<0.05，t=7.671）。
3讨论
BmOrf99为编码61氨基酸的小ORF，同源搜寻结果显示，在登录的杆状病毒全基因组序列中[14]，仅有8种杆状病毒含有BmOrf99的同源基因；同源性比对分析发现，BmNPV Orf99与野桑蚕NPV、灰色尺蠖蛾NPV、苜蓿银纹夜蛾核NPV 的相应蛋白有较高的同源性，与其他杆状病毒的蛋白几乎无同源性，暗示该基因并不是核型多角体病毒中的功能性保守基因，并不是不可或缺的[15]。 对BmOrf99基因起始密码ATG上游序列的分析显示，发现该基因既含有早期转录起始位点CACT和TATA，同时也具有晚期转录起始位点GTAAA，说明BmOrf99既是一个早期转录基因也是一个晚期转录基因。BmOrf99基因的转录分析结果显示，在病毒转染1.5 h后，就可以检测BmOrf99转录，之后转录水平逐渐提高，该结果与BmOrf基因启动子区域序列分析结果相一致，推测BmOrf99可能参与病毒基因的转录调控[16]。该研究的qPCR分析结果显示，在病毒感染72 h后，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP感染细胞中BmOrf98a表达水平比BmNPVBmOrf99WTpolhGFP感染细胞提高221倍，推測BmOrf99对BmOrf98a基因表达有调控作用，BmOrf99可能通过调控病毒其他基因的表达而发挥作用。
为进一步研究BmOrf99基因在BmNPV生命周期中的功能，运用杆状病毒BactoBac表达系统和Red重组系统构建了一个BmOrf99敲除型重组病毒BmNPVBmOrf99KOpolhGFP。试验结果显示，BmOrf99基因敲除后的重组病毒仍能增殖、转染引起的细胞病变与野生病毒并无明显差异，因此可以认为BmOrf99为BmNPV复制非必需基因，缺失不影响病毒在BmN细胞间传播。透射电镜观察结果显示，在BmNPVBmOrf99 KOBacmid转染的BmN细胞中，病毒发生基质、病毒粒子的形态发生和多角体对病毒的包埋均与野生病毒无明显差异，表明BmOrf99缺失对病毒粒子及包涵体形态发生无影响。
BmNPV基因组约有30个可编码100左右氨基酸残基的小ORF，其中一些sORF功能已经被探究，敲除ORF143发现病毒感染速度明显降低，缺失Orf64基因严重影响病毒的感染性，而Lef10为病毒复制必需基因[11]。该研究结果显示，转染后24～72 h，BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞培养上清中的BV水平略高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP；转染72 h后，前者TCID50高于后者，推测缺失BmOrf99有提高BV产量的倾向；转染细胞中病毒DNA水平检测结果显示，在转染6～72 h，各个转染时间点BmNPVBmOrf99KOpolhGFP转染细胞中的病毒DNA水平均高于BmNPVBmOrf99WTpolhGFP转染的细胞，说明缺失BmOrf99可提高病毒DNA的复制水平，缺失BmOrf99引起BV产量提高与病毒DNA的复制水平提高有关。
2012年Ono等运用杆状病毒表达系统和Red重组系统，分别构建了 BmNPV中141个基因的敲除型病毒，综合分析了BmNPV基因组中基因在病毒间感染或病毒、宿主之间的相互作用，并按照敲除后不同的表现型将这141个基因分成4类[11]（A、B、C、D），其中A类特点是敲除掉目的基因后产生的子代病毒感染速率和对照组一样，但GFP表达不如对照组。B类是敲除掉目的基因后产生的子代病毒感染速度明显降低，这可能是由于子代病毒产量低或者产生的子代病毒感染性低，例如敲除Bm15、Bm65、gp41和Bm131基因。C类是敲除掉目的基因后产生的子代病毒在细胞间无感染性，但是细胞内多角体仍能形成，这些基因在BmNPV形态发生上起到重要作用。例如lef1（Bm6）、lef2（Bm135）和dnapol（Bm53），它们仍是DNA复制所必需的[17-19]，而不是多角体蛋白表达所必需的。D类特点是敲除掉目的基因后GFP不表达也不能产生可感染性的子代病毒，这类基因参与病毒复制或作为病毒RNA聚合酶调控晚期基因表达[6，17-18]，在病毒复制和多角体蛋白形成方面起到必不可少的作用。而该研究结果显示，BmOrf99敲除后，病毒DNA水平提高，BV产量有增加倾向，而病毒的形态发生无明显变化，说明BmOrf99与上述BmNPV的A、B、C和D 4类基因不同。
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