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家蚕不仅是一种鳞翅目模式昆虫,还是一种重要的经济性昆虫。目前养蚕业在发展中国家的经济发展中仍然占有一定重要的作用。家蚕核型多角体病毒(Bombyx mari nuclearpolyhedrosisvirus,BmNPV)感染家蚕后引发的家蚕核型多角体病毒病是养蚕业主要的病害之一,每年都会导致严重的经济损失。家蚕中肠是家蚕抵御外界病原菌侵染的第一道屏障,研究家蚕中肠应答侵染BmNPV的第一反应有助于阐明家蚕抗病毒侵染的分子机理。本研究采用比较转录组以及比较亚细胞蛋白质组学对感染BmNPV前后的近等基因系BC9(抗性品系)和轮回亲本P50(感性品系)进行分析,筛选与抗性相关的差异表达基因和蛋白。另外,在转录组和亚细胞蛋白质组关联性分析的基础上,采用Far-western blot从P50中肠线粒体、微粒体和胞质酶源中筛选与BmNPV互作的蛋白。基于以上研究结果,综合分析家蚕抗BmNPV侵染的分子机理。主要的研究结果如下:1.基于比较转录组学在转录水平分析不同抗性家蚕品系中肠应答BmNPV的侵染。以抗性家蚕品系A35为供体亲本和感性品系P50为轮回亲本构建的近等基因系BC9(抗性品系)和P50添毒前后的四个转录组中共得到14,300个功能基因,其中869个基因在两品系之间以及添毒前后表现出显著的差异表达。BC9和P50之间以及P50感染病毒前后中的上调表达和下调表达基因数量基本相同,而在BC9感染病毒前后中的下调表达基因的数量是上调表达的2倍以上。利用GO对BC9和P50感染BmNPV前后以及两品系之间的差异表达基因进行分析,结果表明 Cellular component 中的 macromolecular complex、Molecular function 中的 transporter activity 以及 Biological progresses 中的 metabolism processes和localization相关差异表达基因的数量在BC9和P50感染BmNPV后表现出明显的差异。相关通路分析表明,参与蛋白代谢、细胞骨架以及细胞凋亡相关的基因在两品系感染病毒前后表现出显著的差异表达,推测这些基因与家蚕抗BmNPV的侵染有关。此外,免疫相关的基因在感染BmNPV后也表现出明显的变化。特别是,在移除遗传背景和个体免疫应答相关差异表达基因后,共筛选出22个可能与抗BmNPV侵染相关的差异表达基因,这些基因在BC9添毒后均表现出下调表达。根据相关文献报道,这些基因主要参与转运、病毒复制、胞内先天免疫以及细胞凋亡过程。为了进一步验证抗性相关基因的功能,利用RT-qPCR对部分抗性相关基因在A35、BC9以及P50添毒前后的表达水平进行分析,结果表明这些抗性相关基因确实存在应答BmNPV侵染的现象。2.基于比较亚细胞蛋白质组学分析不同抗性家蚕品系中肠应答BmNPV的侵染。利用双向电泳(Two-dimensional gel electrophoresis,2-DE)结合质谱(mass spectrometry,MS)的方法对感染BmNPV后近等基因系BC9(抗性品系)和轮回亲本P50(感性品系)中肠的微粒体、线粒体和胞质酶源三个亚组分蛋白分别进行分析。经过比较BC9和P50感染BmNPV前后以及两品系之间的蛋白表达谱,共筛选出87个显著差异表达的蛋白点,并成功的得到MS鉴定。在感染BmNPV后,大部分的差异表达蛋白来源于胞质酶源和微粒体两个亚细胞组分,这可能是由于这两个亚细胞组分在抗BmNPV侵染过程中起到更加重要的作用。根据相关文献报道,这些蛋白主要参与了能量代谢、蛋白代谢、信号通路、疾病以及转运过程。三个亚细胞组分中的差异表达蛋白KEGG通路分析表明,疾病相关的蛋白主要分布于微粒体中。尤其是,在去除遗传背景和个体免疫相关的差异表达蛋白后,共筛选出16个可能参与抗BmNPV侵染的差异表达蛋白。RT-qPCR结果表明其中8个蛋白对应的基因表达水平与2-DE的结果是一致的。3.家蚕转录组与亚细胞蛋白组学的关联性分析。为了系统的分析家蚕抗BmNPV的分子机理,对转录组和亚细胞蛋白质组学的数据进行整合分析。通过对转录组和亚细胞蛋白质组学的数据进行关联性分析,两组学在能量代谢通路和其他一些相关的通路中表现出关联性;此外,在两组学中还发现均存在Vacuolar ATP synthase(V-ATPase)家族成员。这些候选基因和蛋白的功能将在后续的工作中深入研究。4.家蚕中肠V-ATPase与BmNPV的互作分析。基于SDS-PAGE结合Far-western blot和LC-MS/Ms的方法,从家蚕P50中肠线粒体组分与BmNPV互作的信号中鉴定出V-ATPase A和B蛋白。为进一步证明V-ATPase A和B与BmNPV之间的互作关系,首先对V-ATPase A和B进行原核表达,再以Far-western blot方法验证了目标蛋白与BmNPV之间的互作关系。综上所述,本研究基于比较转录组和亚细胞蛋白质组学从家蚕中肠组织中鉴定应答BmNPV侵染的差异表达基因和蛋白。关联性分析发现转录组和亚细胞蛋白组学在相关通路中均存在关联性。另外,两组学中均存在V-ATPase家族成员,且从家蚕中肠线粒体中鉴定出与BmNPV互作的蛋白V-ATPaseA和B。这些研究的结果将为阐明家蚕抗BmNPV侵染的分子机理提供有力的参考依据。