【摘 要】
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[目的]发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量.[方法]首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白.然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证.同时,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力.[结果]经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子PWV和PAB结合的调控蛋白.在QQ-
【机 构】
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上海交通大学生命科学技术学院,微生物代谢国家重点实验室,上海200240
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[目的]发现游动放线菌Actinoplanes sp.SE50/110中阿卡波糖生物合成的调控因子,并提高其产量.[方法]首先,利用DNA亲和层析技术,钓取与阿卡波糖生物合成基因簇2个双向启动子区域结合的调控蛋白.然后,在阿卡波糖产生菌QQ-2中强化表达或敲除这些调控蛋白编码基因,进行体内功能验证.同时,利用大肠杆菌BL21(DE3)异源表达获得可溶性蛋白,通过凝胶阻滞实验验证蛋白与启动子区域的结合能力.[结果]经DNA亲和层析及蛋白质质谱分析,钓取出9个与双向启动子PWV和PAB结合的调控蛋白.在QQ-2中分别强化表达和缺失这9个调控基因后发现,基因ACPL_1889的强化表达使阿卡波糖产量提高25％,而该基因的缺失使产量降低22％;基因ACPL_5445、ACPL_3989的强化表达使阿卡波糖产量分别降低12％和39％,而这两个基因的缺失使产量分别提高15％和8％.对阿卡波糖生物合成基因转录水平的检测发现,强化表达基因ACPL_ 1889使acbA、acbB、acbW、acbV的转录水平升高,而缺失该基因使这4个基因的转录水平降低;敲除基因ACPL 5445使这4个基因转录水平均有提高;强化表达基因ACPL_ 3989使这4个基因的转录水平均下降,而其敲除使acbW和acbA的转录水平分别提高了约100倍和40倍.在凝胶阻滞实验中,ACPL_ 1889与ACPL_ 3989均能与acb基因簇的启动子区域结合.最后将正调控基因的强化表达和负调控基因的敲除进行组合,使阿卡波糖产量提升32％.[结论]本研究发现了9个与阿卡波糖生物合成基因簇的启动子区域结合的调控蛋白,通过体内、体外实验证明ACPL_ 1889为阿卡波糖生物合成的正调控因子、ACPL_5445和ACPL_3989为负调控因子,不但为揭示阿卡波糖生物合成的转录调控机制奠定了基础,而且这些调控基因的改造显著提升了阿卡波糖的产量.
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