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摘要：目的 建立高效毛细管电泳法测定灯盏花素固体分散体中野黄芩苷含量的方法。方法 电泳条件：石英毛细管柱（60 cm×75 ?m），运行缓冲液40 mmol/L硼砂溶液（25 ℃，pH=9.0），分离电压20 kV，进样时长同为5 s，温度为25 ℃，检测波长为280 nm。结果 野黄芩苷在0.1～4 mg/mL范围内呈良好的线性关系，加样回收率为99.35%，RSD=0.47%（n=9）。结论 毛细管电泳法用于测定灯盏花素中野黄芩苷的含量稳定可行。
关键词：灯盏花素固体分散体；野黄芩苷；高效毛细管电泳
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.022
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0058-03
灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus （Vant.）Hand.-Mazz全草中提取的黄酮类化合物，主要成分为野黄芩苷，又称灯盏花乙素，其结构式为5，6，4’-三羟基黄酮- 7-O-B-D-葡萄糖酸苷[1]。现代药理研究表明，灯盏花素能够显著降低血液黏度和血脂水平，改善血流量，降低血管阻力和抗血小板凝集及抗血栓的形成，临床多用于治疗高血压、脑血栓、慢性肺源性心脏病[2-3]，并对乳腺癌术后转移和复发有预防作用[4]。由于灯盏花素溶解性较差，故不宜口服给药。为提高灯盏花素溶解性，我们采用固体分散技术，以聚乙二醇6000 （PEG6000）为载体制备灯盏花素固体分散体，并对其进行物相鉴别，现欲制定其质量标准，建立灯盏花素固体分散体含量测定方法。毛细管电泳是近年来发展迅速的一项分析技术，具有电泳和色谱技术的双重特点，且灵敏度高，分析速度快，样品用量少，运行费用低，在中药及其制剂分析中有着高效液相色谱法无法比拟的优点。笔者采用毛细管电泳检测法测定灯盏花素固体分散体中的野黄芩苷含量，现报道如下。
1 仪器与试药
Beckman P/ACEMDQ型高效毛细管电泳仪，二极管阵列检测器（PAD，Beckman公司）；未涂层弹性石英毛细管柱（60 cm×75 ?m，有效长度50 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司）；PHS-25B型精密酸度计（上海大谱仪器有限公司）；KQ-100型超
基金项目：河南省教育厅自然科学研究项目（2006350006）
声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
野黄芩苷对照品（批号110842-200607，购自中国药品生物制品检定所）；PEG6000（广州市医药公司进口分装）；甲醇（色谱纯，天津四友）；水为二次蒸馏水；硼砂、氢氧化钠均为分析纯；灯盏花素固体分散体（河南中医学院中药药剂学与药剂学学科）。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的野黄芩苷对照品 50.02 mg，置5 mL量瓶中，加缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取固体分散体粉（60目）适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加硼砂缓冲液适量，超声处理（100 W， 45 kHz）5 min，放置室温后，定容至10 mL，摇匀，即得。进样前用0.45 ?m微孔滤膜滤过。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取PEG6000适量，按“2.1.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.2 毛细管电泳条件
毛细管柱（60 cm×75 ?m），缓冲溶液为40 mmol/L硼砂，分离电压20 kV，柱温25 ℃，检测波长280 nm，压力进样：20 mbar×5 s。毛细管柱第1次使用前用蒸馏水、1.0 mol/L HCl溶液、1.0 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L NaOH溶液、蒸馏水、电泳缓冲溶液依次冲洗20 min。每次电泳后毛细管分别用0.1 mol/L HCl、0.1 moL/L NaOH冲洗 5 min，以运行缓冲液冲洗5 min，以保证重复性。每进6次样更换缓冲液。在此条件下对照品、供试品、阴性对照色谱图见图1。
2.3 标准曲线的制备
分别吸取对照品贮备液适量，加缓冲液稀释成野黄芩苷质量浓度为0.1、0.2、0.4、1、2、4 mg/mL的溶液。依次压力进样5 s，每个浓度测定3次以上。以色谱峰的面积为因变量，以对照品的浓度为自变量，进行线性回归，得回归方程Y=258 643X+10 778，r=0.999 2。表明野黄芩苷在0.1～4 mg/mL范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取供试品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定6次，记录峰面积并计算。结果野黄芩苷峰面积的RSD=1.75%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取同一批号（090617）灯盏花素固体分散体，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h分别压力进样5 s，测定峰面积并计算。结果野黄芩苷峰面积RSD=1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.6 重复性试验
取同一批号（090617）的灯盏花素固体分散体6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果灯盏花素固体分散体中野黄芩苷含量为97.9 mg/g，RSD=1.42%（n=6），表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
称取已知含量灯盏花素固体分散体共9份，分别加入一定量的野黄芩苷对照品，按“2.1.2”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。灯盏花素固体分散体中野黄芩苷平均回收率为99.35%，RSD=0.47%。结果表明方法准确可靠。 2.8 样品含量测定
取灯盏花素固体分散体5批，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。5批样品中野黄芩苷含量测定结果见表2。
3 讨论
未涂层弹性石英毛细管柱是目前中药及其制剂分析中常用的毛细管柱，笔者以检验灵敏度、分离效果为指标对将该类型内径为25、50、75 ?m毛细管柱进行比较，最终选择内径为75 ?m毛细管柱。
野黄芩苷极性较强，容易离子化；而在硼砂溶液中，野黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过试验确定其最佳浓度为40 mmol/L。
灯盏花素属黄酮类成分，主要含有野黄芩苷，其7位上连接一葡萄糖醛酸，在5，6，4’位上有3个羟基，因此具有较强的酸性，在碱性介质中易溶，故摸索条件在pH值8～9之间进行。试验分析表明，在pH值8～9时，野黄芩苷的峰可以得到很好分离，但在pH值9时野黄芩苷峰形较为尖锐对称，故选择缓冲液的pH值为9。
在上述缓冲液条件下考察分离电压在15～25 kV范围内对分离度的影响，随着工作电压的升高，基线噪声增加，使检测灵敏度降低，当工作电压超过20 kV后这种影响变得明显。综合考虑分离度、峰高和灵敏度等因素，故选择20 kV为工作电压。毛细管柱温升高，分离时间几乎呈平行线性递减，说明分离时间随温度的变化率是不变的，因此选用25 ℃为柱温。
预试验对野黄芩苷进行全波长检测，筛选出215、254、280、335 nm进行进一步分析考察，综合基线平滑度、柱效、分离度等因素，选择280 nm为检测波长。
参考文献：
[1] 胡倩，戴霖霖，王玲，等.灯盏花素的提取与分离工艺优化研究[J].化学 与生物工程，2009，26（4）：58-60.
[2] 高翔，梁群.灯盏花素治疗慢性肺源性心脏病的疗效观察[J].中医药信息，2009，26（3）：41-42.
[3] 张晓丹，刘婧，张伟兵，等.灯盏花素心血管药理及临床研究进展[J].中国药业，2007，16（21）：3-5.
[4] 于丽娟，林海红，杜钢军，等.灯盏花素对小鼠乳腺癌术后转移和复发的预防作用[J].河南大学学报：医学版，2009，28（3）：182-184.
（收稿日期：2012-04-28，编辑：陈静）
关键词：灯盏花素固体分散体；野黄芩苷；高效毛细管电泳
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2012.10.022
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2012）10-0058-03
灯盏花素是从菊科植物短葶飞蓬Erigeron breviscapus （Vant.）Hand.-Mazz全草中提取的黄酮类化合物，主要成分为野黄芩苷，又称灯盏花乙素，其结构式为5，6，4’-三羟基黄酮- 7-O-B-D-葡萄糖酸苷[1]。现代药理研究表明，灯盏花素能够显著降低血液黏度和血脂水平，改善血流量，降低血管阻力和抗血小板凝集及抗血栓的形成，临床多用于治疗高血压、脑血栓、慢性肺源性心脏病[2-3]，并对乳腺癌术后转移和复发有预防作用[4]。由于灯盏花素溶解性较差，故不宜口服给药。为提高灯盏花素溶解性，我们采用固体分散技术，以聚乙二醇6000 （PEG6000）为载体制备灯盏花素固体分散体，并对其进行物相鉴别，现欲制定其质量标准，建立灯盏花素固体分散体含量测定方法。毛细管电泳是近年来发展迅速的一项分析技术，具有电泳和色谱技术的双重特点，且灵敏度高，分析速度快，样品用量少，运行费用低，在中药及其制剂分析中有着高效液相色谱法无法比拟的优点。笔者采用毛细管电泳检测法测定灯盏花素固体分散体中的野黄芩苷含量，现报道如下。
1 仪器与试药
Beckman P/ACEMDQ型高效毛细管电泳仪，二极管阵列检测器（PAD，Beckman公司）；未涂层弹性石英毛细管柱（60 cm×75 ?m，有效长度50 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司）；PHS-25B型精密酸度计（上海大谱仪器有限公司）；KQ-100型超
基金项目：河南省教育厅自然科学研究项目（2006350006）
声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
野黄芩苷对照品（批号110842-200607，购自中国药品生物制品检定所）；PEG6000（广州市医药公司进口分装）；甲醇（色谱纯，天津四友）；水为二次蒸馏水；硼砂、氢氧化钠均为分析纯；灯盏花素固体分散体（河南中医学院中药药剂学与药剂学学科）。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取在60 ℃减压干燥4 h的野黄芩苷对照品 50.02 mg，置5 mL量瓶中，加缓冲液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。
2.1.2 供试品溶液的制备 取固体分散体粉（60目）适量，精密称定，置10 mL容量瓶中，加硼砂缓冲液适量，超声处理（100 W， 45 kHz）5 min，放置室温后，定容至10 mL，摇匀，即得。进样前用0.45 ?m微孔滤膜滤过。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取PEG6000适量，按“2.1.2”项下方法制成阴性对照溶液。
2.2 毛细管电泳条件
毛细管柱（60 cm×75 ?m），缓冲溶液为40 mmol/L硼砂，分离电压20 kV，柱温25 ℃，检测波长280 nm，压力进样：20 mbar×5 s。毛细管柱第1次使用前用蒸馏水、1.0 mol/L HCl溶液、1.0 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L NaOH溶液、蒸馏水、电泳缓冲溶液依次冲洗20 min。每次电泳后毛细管分别用0.1 mol/L HCl、0.1 moL/L NaOH冲洗 5 min，以运行缓冲液冲洗5 min，以保证重复性。每进6次样更换缓冲液。在此条件下对照品、供试品、阴性对照色谱图见图1。
2.3 标准曲线的制备
分别吸取对照品贮备液适量，加缓冲液稀释成野黄芩苷质量浓度为0.1、0.2、0.4、1、2、4 mg/mL的溶液。依次压力进样5 s，每个浓度测定3次以上。以色谱峰的面积为因变量，以对照品的浓度为自变量，进行线性回归，得回归方程Y=258 643X+10 778，r=0.999 2。表明野黄芩苷在0.1～4 mg/mL范围内线性关系良好。
2.4 精密度试验
取供试品溶液，按“2.2”项下电泳条件，连续测定6次，记录峰面积并计算。结果野黄芩苷峰面积的RSD=1.75%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验
取同一批号（090617）灯盏花素固体分散体，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在0、2、4、6、8、12 h分别压力进样5 s，测定峰面积并计算。结果野黄芩苷峰面积RSD=1.3%，表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.6 重复性试验
取同一批号（090617）的灯盏花素固体分散体6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。结果灯盏花素固体分散体中野黄芩苷含量为97.9 mg/g，RSD=1.42%（n=6），表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验
称取已知含量灯盏花素固体分散体共9份，分别加入一定量的野黄芩苷对照品，按“2.1.2”项下方法处理并依法测定，计算回收率，结果见表1。灯盏花素固体分散体中野黄芩苷平均回收率为99.35%，RSD=0.47%。结果表明方法准确可靠。 2.8 样品含量测定
取灯盏花素固体分散体5批，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定。5批样品中野黄芩苷含量测定结果见表2。
3 讨论
未涂层弹性石英毛细管柱是目前中药及其制剂分析中常用的毛细管柱，笔者以检验灵敏度、分离效果为指标对将该类型内径为25、50、75 ?m毛细管柱进行比较，最终选择内径为75 ?m毛细管柱。
野黄芩苷极性较强，容易离子化；而在硼砂溶液中，野黄芩苷中邻二羟基基团更易形成络离子，加快离子化。因此选择硼砂溶液为运行缓冲液，并通过试验确定其最佳浓度为40 mmol/L。
灯盏花素属黄酮类成分，主要含有野黄芩苷，其7位上连接一葡萄糖醛酸，在5，6，4’位上有3个羟基，因此具有较强的酸性，在碱性介质中易溶，故摸索条件在pH值8～9之间进行。试验分析表明，在pH值8～9时，野黄芩苷的峰可以得到很好分离，但在pH值9时野黄芩苷峰形较为尖锐对称，故选择缓冲液的pH值为9。
在上述缓冲液条件下考察分离电压在15～25 kV范围内对分离度的影响，随着工作电压的升高，基线噪声增加，使检测灵敏度降低，当工作电压超过20 kV后这种影响变得明显。综合考虑分离度、峰高和灵敏度等因素，故选择20 kV为工作电压。毛细管柱温升高，分离时间几乎呈平行线性递减，说明分离时间随温度的变化率是不变的，因此选用25 ℃为柱温。
预试验对野黄芩苷进行全波长检测，筛选出215、254、280、335 nm进行进一步分析考察，综合基线平滑度、柱效、分离度等因素，选择280 nm为检测波长。
参考文献：
[1] 胡倩，戴霖霖，王玲，等.灯盏花素的提取与分离工艺优化研究[J].化学 与生物工程，2009，26（4）：58-60.
[2] 高翔，梁群.灯盏花素治疗慢性肺源性心脏病的疗效观察[J].中医药信息，2009，26（3）：41-42.
[3] 张晓丹，刘婧，张伟兵，等.灯盏花素心血管药理及临床研究进展[J].中国药业，2007，16（21）：3-5.
[4] 于丽娟，林海红，杜钢军，等.灯盏花素对小鼠乳腺癌术后转移和复发的预防作用[J].河南大学学报：医学版，2009，28（3）：182-184.
（收稿日期：2012-04-28，编辑：陈静）