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摘 要：为测定水产品中呋喃唑酮代谢物（AOZ）的残留量，采用2-硝基苯甲醛进行衍生，乙酸乙酯提取AOZ。通过样品中残留的AOZ和酶标板上预包被的抗原竞争抗体，加入酶标二抗后与底物显色，测得样品中AOZ的残留量。测定了四组水产品中AOZ的残留量，测定浓度均小于1 μg/kg，结果为阴性。向空白样品中分别添加0.5 μg/kg、1.5 μg/kg 和2 μg/kg的AOZ标准品，回收率为90%、109%和101%。因此得出结论：采用酶联免疫法测定水产品中AOZ残留量操作简单，检测时间短，结果准确，是一种适合大批量水产样品筛选的检测方法。
关键词：酶联免疫法；水产品；呋喃唑酮代谢物；残留量
硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，常用于水产动物疾病的治疗。常见的硝基呋喃类药物主要指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，它们的代谢产物分别为AOZ、AMOZ、AHD和SEM[1]。硝基呋喃类药物在体内代谢分解迅速，很难直接检测。而其代谢产物大部分与蛋白质紧密结合，在体内残留时间较长且较为稳定[2]，采用普通的加工方法也很难使其大量降解。因此一般采用对硝基呋喃类代谢产物的检测[3-5]，以达到硝基呋喃类药物的管理和监控目的。
呋喃唑酮代谢物（AOZ）为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种，目前各国对呋喃唑酮的使用都有严格的规定。欧盟规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃（包括呋喃唑酮）。美国 1993年禁止呋喃唑酮作为兽药。我国农业部农牧发[2002]1号《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中规定动物源性食品中呋喃唑酮不得检出。最常用的检测呋喃唑酮的方法主要有：酶联免疫法（ELISA）[6-7]、高效液相色谱法（HPLC）[8]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[9]。酶联免疫法测定呋喃唑酮代谢物具有精密度和灵敏度较高、检测时间短、且检测样本量大等特点。
1 材料与方法
1.1 材料及设备
1.1.1 实验材料 鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼，均来源于唐山市各县市区水产养殖场及水产公司。
1.1.2 试剂及主要设备 乙酸乙酯，正己烷，三水合磷酸氢二钾，浓盐酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。
酶标仪 Thermo MK3；氮气吹干仪（天津艾维欧科技发展有限公司）；恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；均质机（天津市太斯特仪器有限公司）；涡旋仪（上海跃进医疗器械厂）；微量移液器 Thermo Electron；AOZ酶联免疫试剂盒（北京望尔生物技术有限公司生产，灵敏度：0.025 μg/kg，最低检测限：0.1 μg/kg）。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理 选取鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼四类样品，剔去鱼皮、鱼骨和内脏，取鱼肉部分均质备用。称取1.00 g±0.05 g已均质样品于50 mL离心管中，分别加入4 mL 去离子水，0.5 mL 1 mol/L盐酸，100 μL衍生化试剂，充分振荡，置于37 ℃孵育16 h。分别加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾、0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠和5 mL乙酸乙酯，充分振荡， 4 000 r/min离心 10 min。取2.5 mL乙酸乙酯相于10 mL玻璃试管中，50 ℃ N2吹干。加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL复溶液，振荡混合，4 000 r/min 离心10 min，除去上层有机相，取下层水相50 μL用于分析。
2.2.2 检测步骤 取出试验所需数量的微孔板条，插入框架。将样品和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔和样品孔所在位置。加入50 μL的标准液、样品到对应微孔中。然后加入抗体工作液50 μL，轻轻震荡混匀后于室温下避光环境中反应30 min。甩出孔中液体，每孔每次用250 μL洗涤液洗板3～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。加入酶标二抗溶液100 μL（将酶标二抗浓缩液用复溶工作液按照1∶10进行稀释），充分混匀，用盖板膜盖板后于避光环境中反应30 min。重复洗板。每个孔中加入底物A溶液50 μL，再加底物B溶液50 μL轻轻振荡混匀，室温环境下避光反应15 min。每孔加终止液50 μL，振荡混匀，酶标仪在波长450 nm/630 nm处读取OD值。
1.3 结果计算
1.3.1 百分吸光率的计算 样品或标准品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光度的平均值（B）除以0 μg/kg标准的吸光度值（B0），再乘以100%。
1.3.2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线中读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中AOZ的实际浓度。本实验采用试剂盒专业分析软件进行绘制标准曲线和样品浓度的计算。
1.3.3 回收率的计算 添加AOZ样品的计算浓度（x1）减去空白样品中AOZ的浓度（x0）除以实际添加AOZ的浓度（x），再乘以100%。
2 结果与讨论
2.1 样品衍生化与前处理
在AOZ的检测中，一般先加入衍生化试剂进行衍生。AOZ衍生过程反应如图1所示。这主要是由于呋喃唑酮的代谢物AOZ的分子量较小，不易被检测。而在37 ℃酸性条件下，加入衍生化试剂2-硝基苯甲醛后，形成衍生产物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了检测灵敏度。
2.2 标准曲线绘制和样品残留量测定
分别向微孔中添加浓度为0 μg/kg、0.025 μg/kg、0.075 μg/kg、0.225 μg/kg、0.675 μg/kg、2.025 μg/kg的标准品，以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2，制得标准曲线为y=-0.844 3 ln（x）-1.708 1，R2=0.998 3。 本实验选取四组、共12批水产鱼类样品，分别为鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼。经样品前处理后，采用酶联免疫法进行分析，测得其中AOZ的浓度，结果如表1所示。数据显示四组水产样品浓度均小于1 μg/kg，依据农业部公告第235号进行判定，结果呈阴性。其中第一组鲢鱼样品中测得的AOZ的浓度较小，均小于0.05 μg/kg。而第二组牙鲆样品中AOZ浓度均大于其他三组。这可能是由于牙鲆为海水鱼，其他三组均为淡水鱼。有研究表明，海水养殖场出水口附近的海水及底泥可能有硝基呋喃类代谢物残留[10]。这可能是导致牙鲆中AOZ含量稍高的原因之一。采用LC-MS-MS方法对这四组水产品进行确证检测，所得结果均为阴性。说明采用该试剂盒方法所检测的样品结果无假阴性。
2.3 回收率和相对标准偏差
分别向空白鱼肉中添加0.5、1、2 μg/kg的标准溶液，经计算回收率和相对标准偏差（RSD）结果如表2所示。结果显示，添加样品的回收率均控制在90%～110%之间，RSD值小于5%。说明采用该试剂的方法能够有效检测水产品中AOZ。
3 结论
通过样品衍生化和乙酸乙酯提取AOZ，采用酶联免疫试剂盒的检测方法，测得四组水产样品，所得结果均为阴性。与LC-MS-MS检测结果一致。说明该试剂盒的检测结果无假阴性。在空白样品中添加不同浓度水平的AOZ标准液，回收率在90%～110%之间。该试剂盒的方法能够有效检测水产品中AOZ的残留量。酶联免疫法操作简便，检测时间短，可以作为实验室样品的快速筛选方法。但是由于酶联免疫法的结果有可能出现假阳性，无法作为最后的确证结果，实验结果还需要液相色谱串联质谱方法进行确证。
参考文献：
[1] 王习达，陈辉，左建忠，等.水产品中硝基呋喃类药物残留的检测与控制[J].现代农业科技，2007（18）：152-155
[2] 张海琪，丁血燕，薛辉利，等.呋喃唑酮在泛纳宾对下组织中代谢动力学研究[J].宁波大学学报，2009，22（4）：472-746
[3] 杨琳，傅红，刘强.水产品苗种中硝基呋喃代谢物的高效液相色谱-串联质谱法测定[J].食品科学，2010，31（12）：206-211
[4] 邱建华，陈瑞清.呋喃唑酮在动物体内的代谢及代谢物残留检测研究进展[J].福建畜牧兽医，2006，28（6）：80-81
[5] 沈美芳，宋红波，丁涛，等.酶联免疫法与LC-MS/MS法测定水产品中呋喃唑酮代谢物[J].食品科学，2008，29（05）：363-366
[6] 解秋菊，徐仲.酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留[J].食品研究与开发，2010，31（8）：122-124
[7] 闵成军，罗晓琴，汪善良，等.酶联免疫法检测猪肉中呋喃唑酮代谢物残留量[J].肉类研究，2011，25（12）：29-32
[8] 刁石强，吴燕燕，李来好，等.高效液相色谱法测定水产养殖底泥中呋喃唑酮残留量的研究[J].南方水产，2010（6）2：53-58
[9] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.海产品中硝基呋喃类原药的超高效液相色谱串联质谱测定[J].分析测试学报，2010，29（4）：327-330
[10] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.UPLC MS /MS测定海水及沉积物中硝基呋喃类代谢物的研究[J].环境化学，2009，28（4）：606-607
关键词：酶联免疫法；水产品；呋喃唑酮代谢物；残留量
硝基呋喃类药物是一种广谱抗生素，常用于水产动物疾病的治疗。常见的硝基呋喃类药物主要指呋喃唑酮、呋喃它酮、呋喃妥因和呋喃西林，它们的代谢产物分别为AOZ、AMOZ、AHD和SEM[1]。硝基呋喃类药物在体内代谢分解迅速，很难直接检测。而其代谢产物大部分与蛋白质紧密结合，在体内残留时间较长且较为稳定[2]，采用普通的加工方法也很难使其大量降解。因此一般采用对硝基呋喃类代谢产物的检测[3-5]，以达到硝基呋喃类药物的管理和监控目的。
呋喃唑酮代谢物（AOZ）为硝基呋喃类药物中最具代表性的一种，目前各国对呋喃唑酮的使用都有严格的规定。欧盟规定动物源性食品中不得检出硝基呋喃（包括呋喃唑酮）。美国 1993年禁止呋喃唑酮作为兽药。我国农业部农牧发[2002]1号《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》中规定动物源性食品中呋喃唑酮不得检出。最常用的检测呋喃唑酮的方法主要有：酶联免疫法（ELISA）[6-7]、高效液相色谱法（HPLC）[8]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[9]。酶联免疫法测定呋喃唑酮代谢物具有精密度和灵敏度较高、检测时间短、且检测样本量大等特点。
1 材料与方法
1.1 材料及设备
1.1.1 实验材料 鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼，均来源于唐山市各县市区水产养殖场及水产公司。
1.1.2 试剂及主要设备 乙酸乙酯，正己烷，三水合磷酸氢二钾，浓盐酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。
酶标仪 Thermo MK3；氮气吹干仪（天津艾维欧科技发展有限公司）；恒温培养箱（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；均质机（天津市太斯特仪器有限公司）；涡旋仪（上海跃进医疗器械厂）；微量移液器 Thermo Electron；AOZ酶联免疫试剂盒（北京望尔生物技术有限公司生产，灵敏度：0.025 μg/kg，最低检测限：0.1 μg/kg）。
1.2 实验方法
1.2.1 样品前处理 选取鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼四类样品，剔去鱼皮、鱼骨和内脏，取鱼肉部分均质备用。称取1.00 g±0.05 g已均质样品于50 mL离心管中，分别加入4 mL 去离子水，0.5 mL 1 mol/L盐酸，100 μL衍生化试剂，充分振荡，置于37 ℃孵育16 h。分别加入5 mL 0.1 mol/L磷酸氢二钾、0.4 mL 1 mol/L氢氧化钠和5 mL乙酸乙酯，充分振荡， 4 000 r/min离心 10 min。取2.5 mL乙酸乙酯相于10 mL玻璃试管中，50 ℃ N2吹干。加入1 mL正己烷溶解，加入1 mL复溶液，振荡混合，4 000 r/min 离心10 min，除去上层有机相，取下层水相50 μL用于分析。
2.2.2 检测步骤 取出试验所需数量的微孔板条，插入框架。将样品和标准品对应微孔按序编号，并记录标准孔和样品孔所在位置。加入50 μL的标准液、样品到对应微孔中。然后加入抗体工作液50 μL，轻轻震荡混匀后于室温下避光环境中反应30 min。甩出孔中液体，每孔每次用250 μL洗涤液洗板3～5次，每次间隔10 s，用吸水纸拍干。加入酶标二抗溶液100 μL（将酶标二抗浓缩液用复溶工作液按照1∶10进行稀释），充分混匀，用盖板膜盖板后于避光环境中反应30 min。重复洗板。每个孔中加入底物A溶液50 μL，再加底物B溶液50 μL轻轻振荡混匀，室温环境下避光反应15 min。每孔加终止液50 μL，振荡混匀，酶标仪在波长450 nm/630 nm处读取OD值。
1.3 结果计算
1.3.1 百分吸光率的计算 样品或标准品的百分吸光率等于标准品或样品的吸光度的平均值（B）除以0 μg/kg标准的吸光度值（B0），再乘以100%。
1.3.2 标准曲线的绘制与计算 以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线图。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线中读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样品中AOZ的实际浓度。本实验采用试剂盒专业分析软件进行绘制标准曲线和样品浓度的计算。
1.3.3 回收率的计算 添加AOZ样品的计算浓度（x1）减去空白样品中AOZ的浓度（x0）除以实际添加AOZ的浓度（x），再乘以100%。
2 结果与讨论
2.1 样品衍生化与前处理
在AOZ的检测中，一般先加入衍生化试剂进行衍生。AOZ衍生过程反应如图1所示。这主要是由于呋喃唑酮的代谢物AOZ的分子量较小，不易被检测。而在37 ℃酸性条件下，加入衍生化试剂2-硝基苯甲醛后，形成衍生产物2-NP-AOZ，分子量增大，大大提高了检测灵敏度。
2.2 标准曲线绘制和样品残留量测定
分别向微孔中添加浓度为0 μg/kg、0.025 μg/kg、0.075 μg/kg、0.225 μg/kg、0.675 μg/kg、2.025 μg/kg的标准品，以标准品百分吸光率的对数为纵坐标，以AOZ标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线如图2，制得标准曲线为y=-0.844 3 ln（x）-1.708 1，R2=0.998 3。 本实验选取四组、共12批水产鱼类样品，分别为鲢鱼、牙鲆、鲤鱼和草鱼。经样品前处理后，采用酶联免疫法进行分析，测得其中AOZ的浓度，结果如表1所示。数据显示四组水产样品浓度均小于1 μg/kg，依据农业部公告第235号进行判定，结果呈阴性。其中第一组鲢鱼样品中测得的AOZ的浓度较小，均小于0.05 μg/kg。而第二组牙鲆样品中AOZ浓度均大于其他三组。这可能是由于牙鲆为海水鱼，其他三组均为淡水鱼。有研究表明，海水养殖场出水口附近的海水及底泥可能有硝基呋喃类代谢物残留[10]。这可能是导致牙鲆中AOZ含量稍高的原因之一。采用LC-MS-MS方法对这四组水产品进行确证检测，所得结果均为阴性。说明采用该试剂盒方法所检测的样品结果无假阴性。
2.3 回收率和相对标准偏差
分别向空白鱼肉中添加0.5、1、2 μg/kg的标准溶液，经计算回收率和相对标准偏差（RSD）结果如表2所示。结果显示，添加样品的回收率均控制在90%～110%之间，RSD值小于5%。说明采用该试剂的方法能够有效检测水产品中AOZ。
3 结论
通过样品衍生化和乙酸乙酯提取AOZ，采用酶联免疫试剂盒的检测方法，测得四组水产样品，所得结果均为阴性。与LC-MS-MS检测结果一致。说明该试剂盒的检测结果无假阴性。在空白样品中添加不同浓度水平的AOZ标准液，回收率在90%～110%之间。该试剂盒的方法能够有效检测水产品中AOZ的残留量。酶联免疫法操作简便，检测时间短，可以作为实验室样品的快速筛选方法。但是由于酶联免疫法的结果有可能出现假阳性，无法作为最后的确证结果，实验结果还需要液相色谱串联质谱方法进行确证。
参考文献：
[1] 王习达，陈辉，左建忠，等.水产品中硝基呋喃类药物残留的检测与控制[J].现代农业科技，2007（18）：152-155
[2] 张海琪，丁血燕，薛辉利，等.呋喃唑酮在泛纳宾对下组织中代谢动力学研究[J].宁波大学学报，2009，22（4）：472-746
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[4] 邱建华，陈瑞清.呋喃唑酮在动物体内的代谢及代谢物残留检测研究进展[J].福建畜牧兽医，2006，28（6）：80-81
[5] 沈美芳，宋红波，丁涛，等.酶联免疫法与LC-MS/MS法测定水产品中呋喃唑酮代谢物[J].食品科学，2008，29（05）：363-366
[6] 解秋菊，徐仲.酶联免疫法检测水产品中呋喃唑酮代谢物AOZ的残留[J].食品研究与开发，2010，31（8）：122-124
[7] 闵成军，罗晓琴，汪善良，等.酶联免疫法检测猪肉中呋喃唑酮代谢物残留量[J].肉类研究，2011，25（12）：29-32
[8] 刁石强，吴燕燕，李来好，等.高效液相色谱法测定水产养殖底泥中呋喃唑酮残留量的研究[J].南方水产，2010（6）2：53-58
[9] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.海产品中硝基呋喃类原药的超高效液相色谱串联质谱测定[J].分析测试学报，2010，29（4）：327-330
[10] 徐英江，宫向红，田秀慧，等.UPLC MS /MS测定海水及沉积物中硝基呋喃类代谢物的研究[J].环境化学，2009，28（4）：606-607