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摘要[目的]明确菌株Ha1降解阿特拉津（AT）的最适环境因素。[方法]采用液相色谱法测定降解体系中阿特拉津的残留量。[结果]K+和Mg2+对菌株Ha1降解阿特拉津有促进作用，Cu2+、Cd2+等离子则抑制其降解功能的发挥；溶液的缓冲性、pH、温度、供氧方式、反应体系、菌株的浓度和氰尿酸（CA）对菌株 Ha1降解阿特拉津有影响。[结论]该研究结果为生物修复被阿特拉津污染的水环境奠定了理论基础。
关键词阿特拉津；Arthrobacteria sp.Ha1；降解速率
中图分类号S451.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）36-13062-04
Abstract[Objective] It was cleared that the optimum environmental factors of strain Arthrobacter sp.Ha1 biodegradating atrazine.[Method] The atrazine residue in the system was determined with liquid chromatography.[Result] Atrazine biodegradation was significantly promoted by the addition of K+ or Mg2+and significantly restrained by the addition of positive ion such as Cu2+ and Cd2+.The atrazine degraded by strains Ha1 was affected by metal ion， pH， temperature， oxygen， cell concentrations and cyanuric acid.[Conclusion] The results laid the theoretical foundation for bioremediation of atrazine contamination in the water environment.
Key wordsAtrazine； Arthrobacter sp.Ha1；Degradation rate
阿特拉津（C8H14ClN5，Atrazine，简称AT），又名莠去津，化学名称为2氯4乙胺基6异丙胺基1，3，5三嗪，是一种半衰期长的三嗪类除草剂[1]。因其可移动性强，在河流、地下水、地表水中常常可以检测出阿特拉津的存在[2]。每年有2百万～3百万人在饮用被阿特拉津污染的水[3]。欧洲委员会在有关饮用水的规定中明确指出[4]：任何农药在饮用水中的含量不可超过0.1 μg/L。1998年我国规定Ⅰ、Ⅱ类地表水中阿特拉津的标准为3.0 μg/L[5-7]，而实际上我国淮河的4个监测点的阿特拉津含量都在81.3 μg/L 以上[8]。因阿特拉津对人畜危害大，所以控制和治理阿特拉津的污染是世界各国期待解决的问题。可以通过化学方法修复阿特拉津的污染，而生物降解的方法因对环境的二次污染小而受到人们的广泛关注[9-10]。为此，笔者研究了从土壤中获得的阿特拉津高效降解菌Arthrobacter sp.Ha1在低营养条件下的降解特性及与环境因素的关系，旨在为利用Ha1菌株修复被阿特拉津污染的水体提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.Ha1（简称Ha1），由东北林业大学森林病虫害生物学国家林业局重点实验室分离及鉴定。
1.1.2试剂与药剂。阿特拉津原药由辽宁省营口市三征农药厂惠赠；除氰尿酸和阿特拉津标准样品购自西格玛公司外，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3培养基。LB培养基 （LB）：1 L去离子水中含NaCl 10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨 10.0 g。微量元素：MnSO·H2O 1.00 g、FeSO4·7H2O 1.00 g、H3BO4 0.10 g、NaMoO4·2H2O 0.25 g、ZnCl2 0.25 g、CuCl2·2H2O 0.25 g、Co（NO3）2·6H2O 0.25 g、NH4NO3 0.10 g、NiSO4·6H2O 0.10 g、浓H2SO4 5 ml，定容至1 000 ml。基础盐培养基（BSM）：KH2PO4 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NaCl 0.40 g、K2HPO4 179 g、微量元素1 ml、pH7.5，定容至1 000 ml。
1.1.4仪器。Ultrospec 4200 pro型分光光度计；ER52A型旋转蒸发仪；Waters 2695型液相色谱仪。
1.2方法
1.2.1残留阿特拉津的检测。
萃取反应体系中的阿特拉津（培养液与三氯甲烷的比例为10∶1，V/V），旋转蒸发仪蒸干提取液，色谱甲醇溶解稀释残留物后用HPLC检测。检测条件：Waters 2996紫外检测波长为216 nm；柱温25 ℃；流动相为水-甲醇（20∶80，V/V）；进样量5 μl ；流速为1 ml/min； 250 mm×416 mm C18不锈钢色谱柱。阿特拉津保留时间为1.68 min。以已知浓度的阿特拉津标准样品的吸收值做标准曲线，求待测阿特拉津的浓度。
1.2.2菌液的制备及Ha1对阿特拉津的降解条件。
1.2.2.1菌液的制备。LB培养基中接种菌株Ha1，150 r/min、30 ℃下摇培48 h，5 000 r/min离心10 min，用灭菌的生理盐水洗涤2次，悬浮于磷酸钾缓冲液（50 mmol/L，pH70）中，保存于4 ℃冰箱，备用。 1.2.2.2Hal对阿特拉津的降解条件。阿特拉津降解体系： 0.5 g/L阿特拉津的MgCl2溶液，接种浓度1.0×107个/ml，150 r/min、28 ℃下摇床振荡培养，设不加菌液的处理为空白对照，每4～6 h检测其降解情况（如无特殊说明，试验皆采用该反应体系）。环境条件对阿特拉津降解速率的影响：①金属离子。以0.5 g/L阿特拉津的去离子水为降解体系，加入Mg2+、Fe2+等14种不同的金属离子，加入菌液使终浓度为1.0×107个/ml。②pH的影响。配制不同pH的50 mmol/L磷酸缓冲液和非缓冲液（NaOHHCl溶液）（pH为6.0到110），加菌液和阿特拉津。③反应体系的影响。用含0.5 g/L阿特拉津 MgCl2和BSM 2种体系，加入菌液使终浓度为1×106、1×107、1×108 个/ml，定期检测Ha1降解情况。④初始Ha1菌液浓度的影响。在MgCl2溶液中分别加入菌液，使终浓度为0、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个/ml，定期测定阿特拉津的含量。⑤氧气的影响。设置摇床振荡（150 r/min）、静置、充氮静置和充氧静置4种供氧培养方式，分别加入菌液使终浓度为1.0×107个/ml，5 d后测定降解率。⑥温度的影响。在含0.5 g/L阿特拉津的MgCl2和BSM液体中加入菌液，使终浓度为1.0×107个/ml，分别置于4、20、25、30、37、45 ℃摇床中摇培，72 h后测定阿特拉津的降解率。⑦氰尿酸的影响。MgCl2溶液中含有1 g/L阿特拉津、氰尿酸和阿特拉津+氰尿酸的混合液，定期检测阿特拉津的含量。
2结果与分析
2.1金属离子对降解的影响
许多金属离子作为辅基、促进因子、抑制因子等参与酶的催化活动[11]，微生物降解有机污染物的能力与金属离子密切相关[12-13]。由表1可知，在降解过程中，菌体自身或者由菌体产生的阿特拉津降解酶可能对某些金属离子格外“敏感”， Cu2+、 Cd2+、Co2+等离子对菌株Ha1降解阿特拉津有抑制作用。其中Cu2+离子的抑制作用最明显，在0.1 μmol/L时，降解速率仅为1.940 mg/（L·h），而对照为3.780 mg/（L·h）。K+、Mg2+等离子对菌株Ha1降解阿特拉津具有明显的促进作用，其中Mg2+离子促进作用最显著，1.0 mmol/L浓度时降解速率达11.310 mg/（L·h），是对照的3倍。对比分析K+、Mg2+离子在0.1、1.0、10.0 mmol/L时Ha1降解阿特拉津的效果，1 000.0 μmol/L是促进菌株Ha1降解阿特拉津的最佳浓度。
2.2pH和温度对降解的影响
以非缓冲液及磷酸盐缓冲液为反应体系，测定了pH与降解速率的关系及缓冲体系对降解的影响（图1）。在非缓冲液和磷酸盐缓冲液2种溶液中菌株Ha1对阿特拉津的降解速率均表现出随着pH的增加而先增加后减小的趋势，分别在pH7.5和7.0时达到最大值，但在缓冲溶液中的最大降解速率仅为1.380 mg/（L·h），而在非缓冲溶液中的最大降解速率为6.30 mg/（L·h），两者相差3.44倍，表明缓冲溶液对菌株Ha1降解阿特拉津具有一定的抑制作用。余冰宾报道[14]磷酸盐缓冲液会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制。该研究的结论与其一致。在磷酸盐缓冲溶液中菌株Ha1的最适降解pH为8.0，而在非缓冲溶液中的最适降解pH为9.0。温度对菌株Ha1的降解率具有显著影响。菌株Ha1在BSM反应体系中，最适降解温度范围为25～37 ℃，72 h的降解率可达到99.55%；而在MgCl2反应体系中最适降解温度为25 ℃，72 h的降解率为72.73%。37 ℃时，MgCl2反应体系抑制菌株Ha1对阿特拉津的降解，但BSM反应体系中由于营养成分利于细胞的生长繁殖，新生细胞产生的大量水解酶弥补了高温抑制菌体降解能力的下降，使其降解率仍达99.92%（图2）。
2.3反应体系及Ha1菌液浓度对降解的影响
为探索反应体系对降解的影响，分别在BSM培养液和MgCl2溶液中加入1×106、1×107、1×108 个/ml 3种浓度的菌悬液，结果表明，BSM降解体系在相同条件下优于MgCl2体系。MgCl2溶液中96 h的Ha1降解率为20%～100%，且Ha1菌体数量基本未增加；而BSM培养液中3种浓度的阿特拉津降解率均达100%仅需72 h，且随着菌液浓度的增大降解时间缩短（图3）。
一般来说，微生物对有机污染物的降解效果与自身的密度和活性有关[13]。Ha1在细胞灭活和6种浓度下对阿特拉津的降解表明，Ha1菌体在0～5×108 个/ml浓度范围内，对阿特拉津的降解速率随浓度的升高而加快，浓度为5×108个/ml时降解1 g/L的阿特拉津仅需要36 h，表明Ha1对阿特拉津具有很强的降解能力，而灭活细胞几乎没有降解能力（图4）。进一步研究表明，当细胞浓度大于5×108个/ml时，随细胞浓度的增加降解速率并不增加。
2.4氧气及氰尿酸对降解率的影响
为探索氧气与Ha1降解率的关系，测定了不同供氧条件下的Ha1降解率。由图5可知，当反应体系中充满氮气时，由于缺乏氧气阿特拉津几乎未被降解，说明Ha1对阿特拉津的降解过程需要氧气的参与。Ha1静息细胞在加氧静止和空气供氧条件下对阿特拉津的降解率无显著差异，表明自然供氧完全能够保障Ha1降解力的发挥。在摇床自然供氧过程中，可能由于培养液的摇动增加了酶与底物的接触机率，使Ha1对阿特拉津的降解达到较高的水平。氰尿酸是阿特拉津降解过程中的中间产物[11]，在降解过程中氰尿酸的累积必然会影响菌株Ha1对阿特拉津的降解。结果表明，菌株Ha1既可以降解阿特拉津，也可以降解氰尿酸，降解氰尿酸的速度快于阿特拉津，同样是1 g/L，降解氰尿酸仅为36 h，而降解阿特拉津则需要72 h。菌株Ha1在外源氰尿酸存在的条件下，降解1 g/L的阿特拉津需84 h，表明外源氰尿酸抑制了阿特拉津的降解（图6）。 3讨论
生物对阿特拉津降解的实质是其合成酶对阿特拉津的降解，酶作为生物产生的催化剂能催化各种生物化学反应，其反应速度不仅受到酶和底物浓度的影响，同时也和温度、pH、激活剂和抑制剂有关。蔡宝立等报道在阿特拉津降解过程中有3种关键酶：①阿特拉津水解酶（简称AtzA），该酶催化阿特拉津水解脱氯反应产生羟基阿特拉津，是一种功能性的金属酶[11]；②羟基阿特拉津乙胺基水解酶（简称AtzB），具有催化羟基阿特拉津脱酰胺基反应而产生N异丙基氰尿酰胺；③N异丙基氰尿酰胺异丙基水解酶（简称AtzC），是一种具有转化N异丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和异丙胺功能的酶。该研究对金属离子的测定结果表明，K+和Mg2+对Ha1降解阿特拉津具有促进作用，而Cu2+、Cd2+等具有抑制降解的作用，据此推测AtzA在Mg2+和K+的存在下其活性得到提高，但Cu2+、Cd2+等离子对Ha1降解阿特拉津的抑制机制尚不清楚，具体影响哪种酶的活性有待于进一步研究。另外，在未加任何金属离子的情况下，对照降解速率仍可达3.780 mg/（L·h），其结果与AtzA的特点看似不符。但由于Ha1悬浮于磷酸钾缓冲溶液中，K+离子的存在可能使降解酶活性得以充分发挥。Ha1对阿特拉津的降解需要氧的参与，在厌氧的条件下，酶的活性几乎完全受到抑制，这一点符合单加氧酶的特性。
胡江等[15]报道阿特拉津降解菌Exiguobacterium sp.在基础盐培养基中的最适降解温度范围为25～30 ℃；代先祝等[15]报道了Pseudomonas sp.在基础盐培养基中的最适降解温度区间在37～42 ℃，该研究中所使用的降解菌Arthrobacter sp.Ha1无论是在BSM中还是在营养贫瘠的MgCl2体系中，20～45 ℃都具有良好的降解效果。在营养贫瘠的MgCl2体系中45 ℃、72 h的降解率仍可达到40%，表明该菌株在修复营养贫瘠的地下水污染方面将具有良好的应用前景。
Strong等[17]把来自假单胞菌ADP菌株的atzA基因转入大肠杆菌，构建了工程菌株后用灭活细胞进行了土壤修复，56 d内土壤中阿特拉津降解率为52%。胡江等[18]利用微小杆菌属（Exiguobacterium sp，BTAH1）和节杆菌属（Arthrobacter sp，AG）降解菌生长细胞修复被阿特拉津污染的土壤，8 d后土壤中阿特拉津的降解率分别达96.9%和96.4%。该研究中Arthrobacter sp.Ha1在细胞浓度达到1×108个/ml 时仅48 h BSM体系中的阿特拉津降解率就可达100%， 而营养贫瘠的MgCl2溶液中降解0.5 g/L的阿特拉津也只需84 h，说明该菌株具有更强的降解能力。
在该试验选择的细胞浓度和MgCl2溶液降解体系未观察到生物量增加，细胞基本上处于静息状态。菌株Ha1静息细胞能降解阿特拉津和氰尿酸的混合物，但氰尿酸在一定程度上抑制Ha1对阿特拉津的降解。氰尿酸作为阿特拉津降解的中间产物，氰尿酸的降解是由AtzD酶来完成的[11]。Ha1静息细胞成功降解阿特拉津为固定化细胞大规模降解阿特拉津奠定了基础。
参考文献
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[18] 胡江，代先祝，李顺鹏.阿特拉津及其降解菌的使用对土壤微生物群落的影响[J].应用生态学报，2005，16（8）：1518-1522.
关键词阿特拉津；Arthrobacteria sp.Ha1；降解速率
中图分类号S451.2文献标识码
A文章编号0517-6611（2014）36-13062-04
Abstract[Objective] It was cleared that the optimum environmental factors of strain Arthrobacter sp.Ha1 biodegradating atrazine.[Method] The atrazine residue in the system was determined with liquid chromatography.[Result] Atrazine biodegradation was significantly promoted by the addition of K+ or Mg2+and significantly restrained by the addition of positive ion such as Cu2+ and Cd2+.The atrazine degraded by strains Ha1 was affected by metal ion， pH， temperature， oxygen， cell concentrations and cyanuric acid.[Conclusion] The results laid the theoretical foundation for bioremediation of atrazine contamination in the water environment.
Key wordsAtrazine； Arthrobacter sp.Ha1；Degradation rate
阿特拉津（C8H14ClN5，Atrazine，简称AT），又名莠去津，化学名称为2氯4乙胺基6异丙胺基1，3，5三嗪，是一种半衰期长的三嗪类除草剂[1]。因其可移动性强，在河流、地下水、地表水中常常可以检测出阿特拉津的存在[2]。每年有2百万～3百万人在饮用被阿特拉津污染的水[3]。欧洲委员会在有关饮用水的规定中明确指出[4]：任何农药在饮用水中的含量不可超过0.1 μg/L。1998年我国规定Ⅰ、Ⅱ类地表水中阿特拉津的标准为3.0 μg/L[5-7]，而实际上我国淮河的4个监测点的阿特拉津含量都在81.3 μg/L 以上[8]。因阿特拉津对人畜危害大，所以控制和治理阿特拉津的污染是世界各国期待解决的问题。可以通过化学方法修复阿特拉津的污染，而生物降解的方法因对环境的二次污染小而受到人们的广泛关注[9-10]。为此，笔者研究了从土壤中获得的阿特拉津高效降解菌Arthrobacter sp.Ha1在低营养条件下的降解特性及与环境因素的关系，旨在为利用Ha1菌株修复被阿特拉津污染的水体提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种。阿特拉津降解菌Arthrobacter sp.Ha1（简称Ha1），由东北林业大学森林病虫害生物学国家林业局重点实验室分离及鉴定。
1.1.2试剂与药剂。阿特拉津原药由辽宁省营口市三征农药厂惠赠；除氰尿酸和阿特拉津标准样品购自西格玛公司外，其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.3培养基。LB培养基 （LB）：1 L去离子水中含NaCl 10.0 g、酵母提取物5.0 g、胰蛋白胨 10.0 g。微量元素：MnSO·H2O 1.00 g、FeSO4·7H2O 1.00 g、H3BO4 0.10 g、NaMoO4·2H2O 0.25 g、ZnCl2 0.25 g、CuCl2·2H2O 0.25 g、Co（NO3）2·6H2O 0.25 g、NH4NO3 0.10 g、NiSO4·6H2O 0.10 g、浓H2SO4 5 ml，定容至1 000 ml。基础盐培养基（BSM）：KH2PO4 0.45 g、MgSO4·7H2O 0.20 g、NaCl 0.40 g、K2HPO4 179 g、微量元素1 ml、pH7.5，定容至1 000 ml。
1.1.4仪器。Ultrospec 4200 pro型分光光度计；ER52A型旋转蒸发仪；Waters 2695型液相色谱仪。
1.2方法
1.2.1残留阿特拉津的检测。
萃取反应体系中的阿特拉津（培养液与三氯甲烷的比例为10∶1，V/V），旋转蒸发仪蒸干提取液，色谱甲醇溶解稀释残留物后用HPLC检测。检测条件：Waters 2996紫外检测波长为216 nm；柱温25 ℃；流动相为水-甲醇（20∶80，V/V）；进样量5 μl ；流速为1 ml/min； 250 mm×416 mm C18不锈钢色谱柱。阿特拉津保留时间为1.68 min。以已知浓度的阿特拉津标准样品的吸收值做标准曲线，求待测阿特拉津的浓度。
1.2.2菌液的制备及Ha1对阿特拉津的降解条件。
1.2.2.1菌液的制备。LB培养基中接种菌株Ha1，150 r/min、30 ℃下摇培48 h，5 000 r/min离心10 min，用灭菌的生理盐水洗涤2次，悬浮于磷酸钾缓冲液（50 mmol/L，pH70）中，保存于4 ℃冰箱，备用。 1.2.2.2Hal对阿特拉津的降解条件。阿特拉津降解体系： 0.5 g/L阿特拉津的MgCl2溶液，接种浓度1.0×107个/ml，150 r/min、28 ℃下摇床振荡培养，设不加菌液的处理为空白对照，每4～6 h检测其降解情况（如无特殊说明，试验皆采用该反应体系）。环境条件对阿特拉津降解速率的影响：①金属离子。以0.5 g/L阿特拉津的去离子水为降解体系，加入Mg2+、Fe2+等14种不同的金属离子，加入菌液使终浓度为1.0×107个/ml。②pH的影响。配制不同pH的50 mmol/L磷酸缓冲液和非缓冲液（NaOHHCl溶液）（pH为6.0到110），加菌液和阿特拉津。③反应体系的影响。用含0.5 g/L阿特拉津 MgCl2和BSM 2种体系，加入菌液使终浓度为1×106、1×107、1×108 个/ml，定期检测Ha1降解情况。④初始Ha1菌液浓度的影响。在MgCl2溶液中分别加入菌液，使终浓度为0、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108个/ml，定期测定阿特拉津的含量。⑤氧气的影响。设置摇床振荡（150 r/min）、静置、充氮静置和充氧静置4种供氧培养方式，分别加入菌液使终浓度为1.0×107个/ml，5 d后测定降解率。⑥温度的影响。在含0.5 g/L阿特拉津的MgCl2和BSM液体中加入菌液，使终浓度为1.0×107个/ml，分别置于4、20、25、30、37、45 ℃摇床中摇培，72 h后测定阿特拉津的降解率。⑦氰尿酸的影响。MgCl2溶液中含有1 g/L阿特拉津、氰尿酸和阿特拉津+氰尿酸的混合液，定期检测阿特拉津的含量。
2结果与分析
2.1金属离子对降解的影响
许多金属离子作为辅基、促进因子、抑制因子等参与酶的催化活动[11]，微生物降解有机污染物的能力与金属离子密切相关[12-13]。由表1可知，在降解过程中，菌体自身或者由菌体产生的阿特拉津降解酶可能对某些金属离子格外“敏感”， Cu2+、 Cd2+、Co2+等离子对菌株Ha1降解阿特拉津有抑制作用。其中Cu2+离子的抑制作用最明显，在0.1 μmol/L时，降解速率仅为1.940 mg/（L·h），而对照为3.780 mg/（L·h）。K+、Mg2+等离子对菌株Ha1降解阿特拉津具有明显的促进作用，其中Mg2+离子促进作用最显著，1.0 mmol/L浓度时降解速率达11.310 mg/（L·h），是对照的3倍。对比分析K+、Mg2+离子在0.1、1.0、10.0 mmol/L时Ha1降解阿特拉津的效果，1 000.0 μmol/L是促进菌株Ha1降解阿特拉津的最佳浓度。
2.2pH和温度对降解的影响
以非缓冲液及磷酸盐缓冲液为反应体系，测定了pH与降解速率的关系及缓冲体系对降解的影响（图1）。在非缓冲液和磷酸盐缓冲液2种溶液中菌株Ha1对阿特拉津的降解速率均表现出随着pH的增加而先增加后减小的趋势，分别在pH7.5和7.0时达到最大值，但在缓冲溶液中的最大降解速率仅为1.380 mg/（L·h），而在非缓冲溶液中的最大降解速率为6.30 mg/（L·h），两者相差3.44倍，表明缓冲溶液对菌株Ha1降解阿特拉津具有一定的抑制作用。余冰宾报道[14]磷酸盐缓冲液会抑制某些生物化学过程，如对某些酶的催化作用会产生某种程度的抑制。该研究的结论与其一致。在磷酸盐缓冲溶液中菌株Ha1的最适降解pH为8.0，而在非缓冲溶液中的最适降解pH为9.0。温度对菌株Ha1的降解率具有显著影响。菌株Ha1在BSM反应体系中，最适降解温度范围为25～37 ℃，72 h的降解率可达到99.55%；而在MgCl2反应体系中最适降解温度为25 ℃，72 h的降解率为72.73%。37 ℃时，MgCl2反应体系抑制菌株Ha1对阿特拉津的降解，但BSM反应体系中由于营养成分利于细胞的生长繁殖，新生细胞产生的大量水解酶弥补了高温抑制菌体降解能力的下降，使其降解率仍达99.92%（图2）。
2.3反应体系及Ha1菌液浓度对降解的影响
为探索反应体系对降解的影响，分别在BSM培养液和MgCl2溶液中加入1×106、1×107、1×108 个/ml 3种浓度的菌悬液，结果表明，BSM降解体系在相同条件下优于MgCl2体系。MgCl2溶液中96 h的Ha1降解率为20%～100%，且Ha1菌体数量基本未增加；而BSM培养液中3种浓度的阿特拉津降解率均达100%仅需72 h，且随着菌液浓度的增大降解时间缩短（图3）。
一般来说，微生物对有机污染物的降解效果与自身的密度和活性有关[13]。Ha1在细胞灭活和6种浓度下对阿特拉津的降解表明，Ha1菌体在0～5×108 个/ml浓度范围内，对阿特拉津的降解速率随浓度的升高而加快，浓度为5×108个/ml时降解1 g/L的阿特拉津仅需要36 h，表明Ha1对阿特拉津具有很强的降解能力，而灭活细胞几乎没有降解能力（图4）。进一步研究表明，当细胞浓度大于5×108个/ml时，随细胞浓度的增加降解速率并不增加。
2.4氧气及氰尿酸对降解率的影响
为探索氧气与Ha1降解率的关系，测定了不同供氧条件下的Ha1降解率。由图5可知，当反应体系中充满氮气时，由于缺乏氧气阿特拉津几乎未被降解，说明Ha1对阿特拉津的降解过程需要氧气的参与。Ha1静息细胞在加氧静止和空气供氧条件下对阿特拉津的降解率无显著差异，表明自然供氧完全能够保障Ha1降解力的发挥。在摇床自然供氧过程中，可能由于培养液的摇动增加了酶与底物的接触机率，使Ha1对阿特拉津的降解达到较高的水平。氰尿酸是阿特拉津降解过程中的中间产物[11]，在降解过程中氰尿酸的累积必然会影响菌株Ha1对阿特拉津的降解。结果表明，菌株Ha1既可以降解阿特拉津，也可以降解氰尿酸，降解氰尿酸的速度快于阿特拉津，同样是1 g/L，降解氰尿酸仅为36 h，而降解阿特拉津则需要72 h。菌株Ha1在外源氰尿酸存在的条件下，降解1 g/L的阿特拉津需84 h，表明外源氰尿酸抑制了阿特拉津的降解（图6）。 3讨论
生物对阿特拉津降解的实质是其合成酶对阿特拉津的降解，酶作为生物产生的催化剂能催化各种生物化学反应，其反应速度不仅受到酶和底物浓度的影响，同时也和温度、pH、激活剂和抑制剂有关。蔡宝立等报道在阿特拉津降解过程中有3种关键酶：①阿特拉津水解酶（简称AtzA），该酶催化阿特拉津水解脱氯反应产生羟基阿特拉津，是一种功能性的金属酶[11]；②羟基阿特拉津乙胺基水解酶（简称AtzB），具有催化羟基阿特拉津脱酰胺基反应而产生N异丙基氰尿酰胺；③N异丙基氰尿酰胺异丙基水解酶（简称AtzC），是一种具有转化N异丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和异丙胺功能的酶。该研究对金属离子的测定结果表明，K+和Mg2+对Ha1降解阿特拉津具有促进作用，而Cu2+、Cd2+等具有抑制降解的作用，据此推测AtzA在Mg2+和K+的存在下其活性得到提高，但Cu2+、Cd2+等离子对Ha1降解阿特拉津的抑制机制尚不清楚，具体影响哪种酶的活性有待于进一步研究。另外，在未加任何金属离子的情况下，对照降解速率仍可达3.780 mg/（L·h），其结果与AtzA的特点看似不符。但由于Ha1悬浮于磷酸钾缓冲溶液中，K+离子的存在可能使降解酶活性得以充分发挥。Ha1对阿特拉津的降解需要氧的参与，在厌氧的条件下，酶的活性几乎完全受到抑制，这一点符合单加氧酶的特性。
胡江等[15]报道阿特拉津降解菌Exiguobacterium sp.在基础盐培养基中的最适降解温度范围为25～30 ℃；代先祝等[15]报道了Pseudomonas sp.在基础盐培养基中的最适降解温度区间在37～42 ℃，该研究中所使用的降解菌Arthrobacter sp.Ha1无论是在BSM中还是在营养贫瘠的MgCl2体系中，20～45 ℃都具有良好的降解效果。在营养贫瘠的MgCl2体系中45 ℃、72 h的降解率仍可达到40%，表明该菌株在修复营养贫瘠的地下水污染方面将具有良好的应用前景。
Strong等[17]把来自假单胞菌ADP菌株的atzA基因转入大肠杆菌，构建了工程菌株后用灭活细胞进行了土壤修复，56 d内土壤中阿特拉津降解率为52%。胡江等[18]利用微小杆菌属（Exiguobacterium sp，BTAH1）和节杆菌属（Arthrobacter sp，AG）降解菌生长细胞修复被阿特拉津污染的土壤，8 d后土壤中阿特拉津的降解率分别达96.9%和96.4%。该研究中Arthrobacter sp.Ha1在细胞浓度达到1×108个/ml 时仅48 h BSM体系中的阿特拉津降解率就可达100%， 而营养贫瘠的MgCl2溶液中降解0.5 g/L的阿特拉津也只需84 h，说明该菌株具有更强的降解能力。
在该试验选择的细胞浓度和MgCl2溶液降解体系未观察到生物量增加，细胞基本上处于静息状态。菌株Ha1静息细胞能降解阿特拉津和氰尿酸的混合物，但氰尿酸在一定程度上抑制Ha1对阿特拉津的降解。氰尿酸作为阿特拉津降解的中间产物，氰尿酸的降解是由AtzD酶来完成的[11]。Ha1静息细胞成功降解阿特拉津为固定化细胞大规模降解阿特拉津奠定了基础。
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