论文部分内容阅读
摘要：以海南临高和皇桐2地采集的3个品种（系）健康和已感染枯萎病的香蕉植株为样品，采用组织匀浆法进行内生放线菌的分离，共获得内生放线菌142株，并以尖孢镰刀菌4号生理小种为靶标菌株，通过平板对峙试验，筛选出6株抗性菌株，其中分离得到的NJQG-3A1菌株对尖孢镰刀菌菌丝生长抑制作用最强，抑制率可达83.21%。对菌株NJQG-3A1进行形态与生理生化特征、16S rRNA基因序列测定及系统发育树比对分析，结果表明，菌株NJQG-3A1为Streptomyces phaeoluteichromatogennes，其发酵液对温室盆栽香蕉枯萎病的相对防效可达82.46%，具有良好的开发应用前景。
关键词：香蕉枯萎病；内生放线菌；分离鉴定；拮抗；菌株NJQG-3A1
中图分类号： S436.68 1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0127-05
收稿日期：2013-12-10
基金项目：现代农业产业技术体系专项（编号：CARS-32）。
作者简介：胡一凤（1984—），女，硕士，从事香蕉枯萎病防控研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：黄绵佳，教授，从事植物生理研究，E-mail：[email protected]；张锡炎，研究员，从事香蕉枯萎病防治研究，E-mail：[email protected]。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC ）侵染维管束而引起坏死的一种毁灭性真菌性病害，近年来我国香蕉产业深受其害，华南地区尤其严重[1-2]。目前，生产上还未见对香蕉枯萎病有效的化学药剂[3-4]，且农药残留还会带来一系列环境污染问题[5-6]，运用生物防治方法对香蕉枯萎病进行综合防控已成为国内外的研究热点[7]。放线菌在病害防治、促进作物生长、提高作物产量等方面起到重要作用，正在被人们越来越多地开发和应用[8-9]。国内外已经报道多种香蕉枯萎病的拮抗微生物，但这些微生物大部分都是从植株体外的环境中分离筛选得到的[10-11]，在香蕉体内定殖能力较弱，严重影响防控效果[12]。从植物内生菌中筛选生防菌，可以防治植物病害、克服定殖障碍，使生物防治保持长期的效果[13]。本研究以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，对香蕉植株进行放线菌分离筛选，并通过盆栽试验检测拮抗菌株对香蕉枯萎病的防控效果，以期筛选出对防控香蕉枯萎病具有应用前景的内生放线菌。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病原菌尖孢镰刀菌4号生理小种，由中国热带农业科学院生物技术研究所曾会才实验室提供。1.1.2主要培养基内生放线菌分离培养基采用改良高氏（Gauses）1号培养基（GS）、1/10 ATCC 合成培养基、葡萄糖天门冬酸培养基（GA）、腐殖酸培养基（HV）、改良高氏2号培养基（GPT）和改良淀粉酪素培养基（SIM）[14-18]，为抑制杂菌生长，在各分离培养基中均加入终浓度为75 mg/L的重铬酸钾、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸[18]；放线菌纯化培养保存采用YE培养基[15]；抑菌试验采用马铃薯琼脂培养基（PDA）；液体发酵采用淀粉-大豆粉液体培养基[17]；形态特征观察采用国际链霉菌计划（ISP）推荐的培养基，参考Shirling等的方法[19-20 ]进行配制。
1.1.3样品采集与处理2012年11月3日从海南省临高南宝蕉园（ 19°47′1″N， 109°51′17″E）和皇桐蕉园（ 19°49′58″N， 109°50″E）采集香蕉植株样品（表1）。每个品种随机采集香蕉植株10株，混匀。
表1样品采集信息
采集地点根部土壤
pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美台蕉园4.35农科健康植株（NK）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17南天健康植株（NJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54南天感病植株（NB）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17巴西健康植株（BJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54巴西感病植株（BB）根、球茎、假茎、叶
1.2方法
1.2.1内生放线菌的分离参考阮继生分离弗兰克氏菌的方法[21]对样品进行表面消毒，采用组织块匀浆法[22]进行内生放线菌分离。
1.2.2香蕉枯萎病内生拮抗放线菌筛选以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，采用平板对峙法进行初筛；对初筛有活性的菌株用平板对峙法进行复筛，计算抑菌率，公式为：抑菌率=[（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径]×100%。采用SPSS 20.0进行单因素方差分析和Duncans多重比较。
1.2.3拮抗菌株发酵液对FOC4的抑菌活性拮抗菌株接种于大豆粉液体发酵培养基，28 ℃、200 r/min振荡培养7 d；取发酵液50 mL，离心，用微孔滤膜过滤上清液除菌；采用含药介质法，将1 mL活性菌株滤液与9 mL熔融态的PDA培养基混合均匀倒平板；冷却，接种直径为6 mm的 FOC4靶标菌于平板中央。以等量大豆粉液体发酵培养基直接发酵培养的上清液倒平板、接种FOC4靶标菌为对照。每处理重复3次，28 ℃倒置培养5 d，计算抑菌率。
以无菌水冲洗、收集FOC4孢子，并稀释成浓度为1×106 CFU/mL的孢子悬浮液；把活性菌株发酵滤液与FOC4孢子悬浮液等体积混合均匀，置于无菌滤纸片保湿的凹玻片内，28 ℃、相对湿度80%的人工气候箱中光照培养24 h；取出玻片，以孢子萌发的芽管长度达到或超过孢子半径定为萌发[23]，在显微镜下观察孢子萌发情况，计算各处理孢子萌发抑制率，公式为：孢子萌发抑制率=[（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率]×100%。以大豆粉液体培养基为对照，每处理重复3次。 1.2.4拮抗菌株对香蕉枯萎病的防效采用盆栽试验，共设3个处理：处理1：不接种FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌，使用等量的清水；处理2：接种FOC4病原菌，不接种 NJQG-3A1 拮抗菌；处理3：接种FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌株。接种用的病原菌27 ℃、120 g/min PDA培养液上摇瓶培养6 d，匀浆，稀释成106 CFU/mL量级的病原菌孢子悬浮液；除去香蕉杯苗根部的营养土，处理2和处理3伤根，浸泡在病原菌孢子悬浮液中30 min；蕉苗移栽到盆中，处理3用拮抗菌发酵液进行灌根处理，处理1、处理2灌入等量清水，每次浇灌200 mL，每隔7 d 澆灌1次，共计7次；香蕉杯苗移栽后48 d，观察记录香蕉植株叶片及根茎部枯萎病发病情况，病情分级标准参照方中达等的方法[24]，进行病情指数统计。在整个盆栽期间，各处理其他管理措施一致。
1.2.5活性菌株鉴定形态特征观察采用平板插片法[14]。将菌株接种在改良高氏1 号固体培养基上做插片，扫描电镜观察其形态特征；培养特征观察参照《放线菌的分类和鉴定》和《链霉菌鉴定手册》的方法[23，25]；生理生化特征参照 Shirling 等的方法[19-20]进行鉴定。
采用16S rRNA基因序列分析活性菌株。用溶液型细菌基因组DNA提取试剂盒法提取活性菌株基因组DNA，试剂盒购买于北京百泰克生物技术有限公司。根据放线菌的16S rRNA基因的结构特点和保守区，采用通用引物进行16S rRNA基因扩增，通用引物27F、1492R购于上海生物工程公司，扩增片段长度约1 400 bp，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系为25 μL：模板1 μL、引物1492R 1 μL、引物27F 1 μL、PCR Mix 12 μL、ddH2O 10 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃终延伸 10 min，4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列通过EzTaxon 在线比对服务（http：//www. eztaxon.org/）进行相关有效种的相似性搜索，下载相似性较高的放线菌16S rRNA基因序列用Clustal X 1.8软件进行序列比对，用Mega 6.0软件构建系统发育树。
2结果与分析
2.1内生放线菌的分离
将印迹平板于28 ℃下培养14 d，观察到无菌生长，证实从香蕉样品中共分离得到的142株代表菌株均为内生放线菌。由图1可见，在抗病品种南天健康植株中分离得到的内生放线菌最多，共计51株，其次是巴西健康植株，为49株，最少是巴西感病植株，为7株；不同品种香蕉植株内生放线菌分离呈现南天健康植株（NJ）>巴西健康植株（BJ）>农科健康植株（NK）>南天感病植株（NB）>巴西感病植株（BB）的规律，健康株内生放线菌远远多于感病植株。
由图2可见，各组织中内生放线菌分离数量，呈现根>球茎>假茎>叶的规律；根分离的内生放线菌最多，为68株，其次是球茎，为58株，叶中最少，仅6株；香蕉植株根与球茎共分离126株内生放线菌，假茎与叶共分离16株，地下部位组织分离内生放线菌的菌株数大于地上部组织。由图3可见，巴西健康植株各组织均有内生放线菌的分布，而巴西感病植株体内内生放线菌分布比较单一。
由图4可见，腐殖酸培养基分离的内生放线菌最多，为62株；改良高氏2号培养基分离的内生放线菌最少，为4株；6种选择培养基分离内生放线菌菌株数量由多到少的次序为：腐殖酸培养基（HV）﹥葡萄糖天门冬酸培养基（GA）﹥改良高氏1号培养基（GS）﹥改良高氏2号培养基（GPT）﹥1/10 ATCC合成培养基﹥改良淀粉酪素培养基（SIM）。
2.2内生拮抗放线菌的筛选
以FOC4为检测菌，经初筛和复筛，共筛选出6株拮抗效果较好的放线菌，占分离株数的4.23%，其中，菌株 NJQG-3A1 活性最强，对FOC4抑菌率可达83.21%（表2）。
2.3活性菌株NJQG-3A1发酵液对FOC4的抑菌效果
经含药介质法检测，结果显示，菌株NJQG-3A1发酵液
表2复筛菌株对FOC4的抑菌效果
菌株菌落半径
（cm）抑菌率
（%）NJQG-3A10.47±0.03383.21ABJQG-A31.00±0.11564.29BBJQG-1211.13±0.03359.64BNJGg-A41.23±0.06756.07BCBJQG-12 1.13±0.03359.64BNBGH-F1.63±0.18641.79CCK2.80±0.1000 D注：同列数据后不同大写字母表示数据间有极显著性差异（P<0.01）。
对FOC4菌丝生长的抑制率为90.74%（图5）。由图6可见，对照组的FOC4孢子完全萌发，NJQG-3A1发酵液对FOC4孢子萌发的抑制率达到100%。
2.4活性菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病的防控效果
由表3可见，接种病原菌和NJQG-3A1发酵液（处理3）的香蕉植株，其病情指数为15.00，对香蕉枯萎病相对防效为82.46%，菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病具有良好的防控作用，与仅接种病原菌（处理2）相比，差异极为显著。
表3菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病病盆栽防治效果
不同处理发病率
（%）病情指数相对防效
（%）处理1（清水）5.005.0094.15处理2（病原菌）100.0085.500处理3（病原菌 发酵液）15.0015.0082.46 2.5活性菌株NJQG-3A1的鉴定结果
从形态特征上看，菌株NJQG-3A1在高氏培养基上生长缓慢，菌落呈圆饼粉状，气生菌丝为白色，基内菌丝不发达，白色细丝状。电镜下扫描可以看到，紧密排列的孢子丝有较少分叉，孢子链螺旋状排列，单个成熟的孢子呈棒杆状，表面微绒（图7）。
由表4可见，菌株NJQG-3A1在7种鉴定培养基上均能生长；在酵母膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、胨酵母膏铁琼脂培养基上较其他培养基上生长快，产孢多，且有可溶性色素产生；在甘油天门冬酰胺琼脂培养基上无基内菌丝；在不同培养基上，基内菌丝呈现出白色、黄褐色、棕色等，气生菌丝主要為白色至棕色、黄褐色等。
生理生化特征分析结果表明，菌株NJQG-3A1明胶液化，不产黑色素，淀粉水解，不产H2S；在吲哚试验、脲酶试验、脂酶试验与硝酸还原试验中均显阳性；可以利用的碳源有核糖、可溶性淀粉、水杨苷、葡萄糖、蔗糖、肌醇等，可以利用的氮源有缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸等；最适生长pH值为7.0～8.0，最适生长温度28～30 ℃；NaCl受耐性为3%。表4菌株NJQG-3A1在不同培养基上的生长特征
培养基生长情况气生菌丝基内菌丝可溶性色素高氏1号培养基生长慢，产孢少适中、白色白色无酵母膏麦芽汁琼脂生长快，产孢多丰富、白色至灰棕色黄褐色黄褐色无机盐淀粉琼脂生长慢，产孢少适中、白色至棕褐色棕色无燕麦片琼脂生长快，产孢多丰富，白色至灰棕色黄褐色淡黄色甘油天门冬酰胺琼脂生长慢，产孢少少，黄棕色无无胨酵母膏铁琼脂生长快，产孢多丰富，灰白色至黄褐色黄褐色黄褐色酪氨酸琼脂生长慢，产孢少少，白色至黄褐色灰白色无
以菌株NJQG-3A1基因组DNA为模板进行PCR扩增，测得菌株NJQG-3A1 16S rRNA基因核苷酸序列长度为 1 421 bp，序列提交GenBank，获得登录号为KF703553，在EzTaxon数据库中经有效种的序列相似性搜索，发现与菌株NJQG-3A1相似性较高的都是链霉菌属成员，其中，与Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL 5799T相似性最高，达到99.221%。采用BioEdit、Mega 6.0等软件对菌株进行系统发育分析，并用邻接法（Neighbour-Joining，NJ法）构建系统发育树（图8）。综合菌株NJQG-3A1的培养特征和生理生化特征，将其鉴定为Streptomyces phaeoluteichromatogenne。
3结论与讨论
本研究在6种分离培养基上，采用组织匀浆法从5种香蕉植株体内共分离到142株内生放线菌，经平板对峙试验，筛选出6株对FOC4具有抑制作用的活性菌株，其中，活性菌株NJQG-3A1对FOC4的抑制作用最强，抑菌率达83.21%，盆栽防效达82.46%。
从植物组织内分离到的内生菌数量和种类受很多因素的影响，如分离材料的来源、分离的组织部位、分离方法、分离培养基的成分、表面消毒程度及培养条件等，目前还没有一种完全适用的方法可以分离植物组织内的所有微生物，通过选择适宜的分离方法，可以尽可能多地获得内生菌。研究结果表明：（1）香蕉植株各个组织中都存在大量的内生放线菌，内生放线菌数量在香蕉组织内呈现根>球茎>假茎>叶的趋势，这与曹理想等的结果[26]相同。这一方面是由于内生微生物主要是通过根进入植株体内[27]，从而在根部分离得到的内生放线菌相对较多；另一方面可能是在植物内生菌分离的实际操作中，次氯酸钠、乙醇等常用消毒剂对内生菌有很大的杀伤作用[28]，且消毒时间和消毒方式也会影响分离结果[26]，香蕉叶片组织表皮较薄，消毒时间过长，一部分内生菌可能会被杀死，从而导致在叶中分离到的内生放线菌数量少。（2）从健康植株分离得到的内生放线菌远远多于病株，这与林时迟等的研究结论[29]相符，植物体内微生物种群越丰富，数量越多，植物生态系的功能与结构越稳定，越不易感病。（3）从南宝蕉园南天植株内分离得到63株内生放线菌，而从黄桐美台蕉园农科植株体内分离到23株，这可能是受土壤环境差异影响，南宝蕉园土壤的pH值明显高于黄桐美台蕉园，土壤相对偏碱性，碱性条件适合于放线菌的生存[30]。（4）HV和GA培养基上分离得到的内生放线菌数量分别为62株和40株，远远大于从GS、SIM、1/10ATCC、GPT培养基上得到的内生放线菌数量，这说明前2种培养基比较适合香蕉内生放线菌的分离。（5）通过平板对峙、含药介质法及孢子萌发试验，发现活性菌株NJQG-3A1对FOC4具有明显的抑制作用，为香蕉内生放线菌抗菌活性物质的开发利用提供了一定的理论与应用基础。
本试验由于受到分离手段的局限性，有些内生菌不能在人工培养基上生长，有些内生菌因为生长缓慢而被生长相对较快的菌株所掩盖，没有获得稀有的放线菌，在一定程度上减少了活性菌株的发现概率。此外，本研究主要在室内离体条件下进行，若要更准确地探究拮抗菌株NJQG-3A1的生防潜能，需要对该菌株抑菌活性进行更深层次的综合评价。
参考文献：
[1]陈琼武. 乐东县香蕉枯萎病发生状况及防治措施[J]. 安徽农学通报，2008，14（12）：73，78.
[2]胡莉莉，窦美安，谢江辉，等. 香蕉枯萎病抗病性研究进展[J]. 广西热带农业，2006，102（1）：16-18.
[3]Hwang S C，Ko W H. Cavendish banana cultivars resistant to fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan[J]. Plant Disease，2004，88（6）：580-588.
[4]舒肇甦. 台湾香蕉病害的防治[J]. 柑桔与亚热带果树信息，2000，16（2）：43-44. [5]林兰稳，奚伟鹏，黄赛花. 香蕉镰刀菌枯萎病防治药剂的筛选[J]. 生态环境，2003，12（2）：182-183.
[6]卓国豪，黄有宝，吴运新，等. 香蕉枯萎病的综合防治技术[J]. 植物检疫，2003，17（5）：279-280.
[7]王清红，李培征.香蕉枯萎病生物防治研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（20）：10747-10748.
[8]付洁，侯军，谢芳芹，等. 植物内生菌农药活性研究进展[J]. 陕西农业科学，2006（3）：66-68.
[9]姜钰，董怀玉，徐秀德，等. 放线菌在植病生防中的研究进展[J]. 杂粮作物，2005，25（5）：329-331.
[10]秦涵淳，杨腊英，李松伟，等. 香蕉镰刀菌枯萎病拮抗放线菌的分离筛选及其抑制效果的初步评价[J]. 中国生物防治，2010，26（2）：174-180.
[11]Chen C Y，Wang Y H，Huang C J. Enhancement of the antifungal activity of Bacillus subtilis F29-3 by the chitinase encoded by Bacillus circulans chiA gene[J]. Canadian Journal of Microbiology，2004，50（6）：451-454.
[12]Cao L X，Qiu Z Q，Dai X，et al. Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of banana （Musa acuminata） plants and their activities against Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，20（5）：501-504.
[13]Tjamos E C，Tsitsigiannis D I，Tjamos S E，et al. Selection and screening of endorhizosphere bacteria from solarized soils as biocontrol agents against verticillium dahliae of solanaceous hosts[J]. European Journal of Plant Pathology，2004，110（1）：35-44.
[14]沈萍，范秀容，李光武.微生物学实验[M]. 北京：人民教育出版社，1980：72-73.
[15]彭云霞，姜怡，段淑蓉，等. 稀有放线菌的选择性分离方法[J]. 云南大学学报：自然科学版，2007，29（1）：86-89.
[16]Takahashi Y，Matsumoto A，Seino A，et al. Rare actinomycetes isolated from desert soils[J]. Actinomycetologica，1996，10（2）：91-97.
[17]黄小龙，曹树威，周双清，等. 一株淮山炭疽病拮抗放线菌的分离及初步鉴定[J]. 安徽农业科学，2011，39（19）：11474-11476.
[18]姜怡，段淑蓉，唐蜀昆，等. 稀有放线菌分离方法[J]. 微生物学通报，2006，33（1）：181-183.
[19]Shirling E B，Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1966，16（3）：313-340.
[20]Williams S T，Goodfellow M，Alderson G，et al. Numerical classification of Streptomyces and related genera[J]. Journal of General Microbiology，1983，129（6）：1743-1813.
[21]洪葵，谢晴宜. 药用微生物资源研究技术[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006：10-13.
[22]孔亚男，陈文强，邓百万，等. 虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2012，41（6）：616-621.
[23]阎逊初.放线菌的分类和鉴定[M]. 北京：科学出版社，1992：296-1048.
[24]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：农业出版社，1979：8-154.
[25]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975：13-15.
[26]曹理想，田新莉，周世宁. 香蕉内生真菌、放线菌类群分析[J]. 中山大学学报：自然科学版，2003，42（2）：70-73.
[27]Gough C，Galera C，Vasse J，et al. Specific flavonoids promote intercellular root colonization of Arabidopsis thaliana by Azorhizobium caulinodans ORS571[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1997，10（5）：560-570.
[28]付业勤，蔡吉苗，刘先宝，等. 香蕉内生细菌分离、活性评价及数量分布[J]. 热带作物学报，2007，28（4）：78-83.
[29]林时迟，张绍升，周乐峰，等. 福建省香蕉枯萎病鉴定[J]. 福建农业大学学报，2000，29（4）：465-469.
[30]田新莉，曹理想，杨国武，等. 水稻内生放线菌类群及其对宿主病原菌的抗性研究[J]. 微生物学报，2004，44（5）：641-646.张猛. 植物源杀菌剂20%丁香酚水乳剂对草莓灰霉病的田间防治效果[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：132-133.
关键词：香蕉枯萎病；内生放线菌；分离鉴定；拮抗；菌株NJQG-3A1
中图分类号： S436.68 1文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0127-05
收稿日期：2013-12-10
基金项目：现代农业产业技术体系专项（编号：CARS-32）。
作者简介：胡一凤（1984—），女，硕士，从事香蕉枯萎病防控研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：黄绵佳，教授，从事植物生理研究，E-mail：[email protected]；张锡炎，研究员，从事香蕉枯萎病防治研究，E-mail：[email protected]。香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense，FOC ）侵染维管束而引起坏死的一种毁灭性真菌性病害，近年来我国香蕉产业深受其害，华南地区尤其严重[1-2]。目前，生产上还未见对香蕉枯萎病有效的化学药剂[3-4]，且农药残留还会带来一系列环境污染问题[5-6]，运用生物防治方法对香蕉枯萎病进行综合防控已成为国内外的研究热点[7]。放线菌在病害防治、促进作物生长、提高作物产量等方面起到重要作用，正在被人们越来越多地开发和应用[8-9]。国内外已经报道多种香蕉枯萎病的拮抗微生物，但这些微生物大部分都是从植株体外的环境中分离筛选得到的[10-11]，在香蕉体内定殖能力较弱，严重影响防控效果[12]。从植物内生菌中筛选生防菌，可以防治植物病害、克服定殖障碍，使生物防治保持长期的效果[13]。本研究以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，对香蕉植株进行放线菌分离筛选，并通过盆栽试验检测拮抗菌株对香蕉枯萎病的防控效果，以期筛选出对防控香蕉枯萎病具有应用前景的内生放线菌。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病原菌尖孢镰刀菌4号生理小种，由中国热带农业科学院生物技术研究所曾会才实验室提供。1.1.2主要培养基内生放线菌分离培养基采用改良高氏（Gauses）1号培养基（GS）、1/10 ATCC 合成培养基、葡萄糖天门冬酸培养基（GA）、腐殖酸培养基（HV）、改良高氏2号培养基（GPT）和改良淀粉酪素培养基（SIM）[14-18]，为抑制杂菌生长，在各分离培养基中均加入终浓度为75 mg/L的重铬酸钾、100 mg/L的制霉菌素和20 mg/L的萘啶酮酸[18]；放线菌纯化培养保存采用YE培养基[15]；抑菌试验采用马铃薯琼脂培养基（PDA）；液体发酵采用淀粉-大豆粉液体培养基[17]；形态特征观察采用国际链霉菌计划（ISP）推荐的培养基，参考Shirling等的方法[19-20 ]进行配制。
1.1.3样品采集与处理2012年11月3日从海南省临高南宝蕉园（ 19°47′1″N， 109°51′17″E）和皇桐蕉园（ 19°49′58″N， 109°50″E）采集香蕉植株样品（表1）。每个品种随机采集香蕉植株10株，混匀。
表1样品采集信息
采集地点根部土壤
pH值香蕉植株采集植株部位皇桐美台蕉园4.35农科健康植株（NK）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17南天健康植株（NJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54南天感病植株（NB）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园4.17巴西健康植株（BJ）根、球茎、假茎、叶临高南宝蕉园5.54巴西感病植株（BB）根、球茎、假茎、叶
1.2方法
1.2.1内生放线菌的分离参考阮继生分离弗兰克氏菌的方法[21]对样品进行表面消毒，采用组织块匀浆法[22]进行内生放线菌分离。
1.2.2香蕉枯萎病内生拮抗放线菌筛选以尖孢镰刀菌4号生理小种（FOC4）为靶标菌，采用平板对峙法进行初筛；对初筛有活性的菌株用平板对峙法进行复筛，计算抑菌率，公式为：抑菌率=[（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径]×100%。采用SPSS 20.0进行单因素方差分析和Duncans多重比较。
1.2.3拮抗菌株发酵液对FOC4的抑菌活性拮抗菌株接种于大豆粉液体发酵培养基，28 ℃、200 r/min振荡培养7 d；取发酵液50 mL，离心，用微孔滤膜过滤上清液除菌；采用含药介质法，将1 mL活性菌株滤液与9 mL熔融态的PDA培养基混合均匀倒平板；冷却，接种直径为6 mm的 FOC4靶标菌于平板中央。以等量大豆粉液体发酵培养基直接发酵培养的上清液倒平板、接种FOC4靶标菌为对照。每处理重复3次，28 ℃倒置培养5 d，计算抑菌率。
以无菌水冲洗、收集FOC4孢子，并稀释成浓度为1×106 CFU/mL的孢子悬浮液；把活性菌株发酵滤液与FOC4孢子悬浮液等体积混合均匀，置于无菌滤纸片保湿的凹玻片内，28 ℃、相对湿度80%的人工气候箱中光照培养24 h；取出玻片，以孢子萌发的芽管长度达到或超过孢子半径定为萌发[23]，在显微镜下观察孢子萌发情况，计算各处理孢子萌发抑制率，公式为：孢子萌发抑制率=[（对照孢子萌发率-处理孢子萌发率）/对照孢子萌发率]×100%。以大豆粉液体培养基为对照，每处理重复3次。 1.2.4拮抗菌株对香蕉枯萎病的防效采用盆栽试验，共设3个处理：处理1：不接种FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌，使用等量的清水；处理2：接种FOC4病原菌，不接种 NJQG-3A1 拮抗菌；处理3：接种FOC4病原菌和NJQG-3A1拮抗菌株。接种用的病原菌27 ℃、120 g/min PDA培养液上摇瓶培养6 d，匀浆，稀释成106 CFU/mL量级的病原菌孢子悬浮液；除去香蕉杯苗根部的营养土，处理2和处理3伤根，浸泡在病原菌孢子悬浮液中30 min；蕉苗移栽到盆中，处理3用拮抗菌发酵液进行灌根处理，处理1、处理2灌入等量清水，每次浇灌200 mL，每隔7 d 澆灌1次，共计7次；香蕉杯苗移栽后48 d，观察记录香蕉植株叶片及根茎部枯萎病发病情况，病情分级标准参照方中达等的方法[24]，进行病情指数统计。在整个盆栽期间，各处理其他管理措施一致。
1.2.5活性菌株鉴定形态特征观察采用平板插片法[14]。将菌株接种在改良高氏1 号固体培养基上做插片，扫描电镜观察其形态特征；培养特征观察参照《放线菌的分类和鉴定》和《链霉菌鉴定手册》的方法[23，25]；生理生化特征参照 Shirling 等的方法[19-20]进行鉴定。
采用16S rRNA基因序列分析活性菌株。用溶液型细菌基因组DNA提取试剂盒法提取活性菌株基因组DNA，试剂盒购买于北京百泰克生物技术有限公司。根据放线菌的16S rRNA基因的结构特点和保守区，采用通用引物进行16S rRNA基因扩增，通用引物27F、1492R购于上海生物工程公司，扩增片段长度约1 400 bp，正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。反应体系为25 μL：模板1 μL、引物1492R 1 μL、引物27F 1 μL、PCR Mix 12 μL、ddH2O 10 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃终延伸 10 min，4 ℃保存。PCR产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，序列通过EzTaxon 在线比对服务（http：//www. eztaxon.org/）进行相关有效种的相似性搜索，下载相似性较高的放线菌16S rRNA基因序列用Clustal X 1.8软件进行序列比对，用Mega 6.0软件构建系统发育树。
2结果与分析
2.1内生放线菌的分离
将印迹平板于28 ℃下培养14 d，观察到无菌生长，证实从香蕉样品中共分离得到的142株代表菌株均为内生放线菌。由图1可见，在抗病品种南天健康植株中分离得到的内生放线菌最多，共计51株，其次是巴西健康植株，为49株，最少是巴西感病植株，为7株；不同品种香蕉植株内生放线菌分离呈现南天健康植株（NJ）>巴西健康植株（BJ）>农科健康植株（NK）>南天感病植株（NB）>巴西感病植株（BB）的规律，健康株内生放线菌远远多于感病植株。
由图2可见，各组织中内生放线菌分离数量，呈现根>球茎>假茎>叶的规律；根分离的内生放线菌最多，为68株，其次是球茎，为58株，叶中最少，仅6株；香蕉植株根与球茎共分离126株内生放线菌，假茎与叶共分离16株，地下部位组织分离内生放线菌的菌株数大于地上部组织。由图3可见，巴西健康植株各组织均有内生放线菌的分布，而巴西感病植株体内内生放线菌分布比较单一。
由图4可见，腐殖酸培养基分离的内生放线菌最多，为62株；改良高氏2号培养基分离的内生放线菌最少，为4株；6种选择培养基分离内生放线菌菌株数量由多到少的次序为：腐殖酸培养基（HV）﹥葡萄糖天门冬酸培养基（GA）﹥改良高氏1号培养基（GS）﹥改良高氏2号培养基（GPT）﹥1/10 ATCC合成培养基﹥改良淀粉酪素培养基（SIM）。
2.2内生拮抗放线菌的筛选
以FOC4为检测菌，经初筛和复筛，共筛选出6株拮抗效果较好的放线菌，占分离株数的4.23%，其中，菌株 NJQG-3A1 活性最强，对FOC4抑菌率可达83.21%（表2）。
2.3活性菌株NJQG-3A1发酵液对FOC4的抑菌效果
经含药介质法检测，结果显示，菌株NJQG-3A1发酵液
表2复筛菌株对FOC4的抑菌效果
菌株菌落半径
（cm）抑菌率
（%）NJQG-3A10.47±0.03383.21ABJQG-A31.00±0.11564.29BBJQG-1211.13±0.03359.64BNJGg-A41.23±0.06756.07BCBJQG-12 1.13±0.03359.64BNBGH-F1.63±0.18641.79CCK2.80±0.1000 D注：同列数据后不同大写字母表示数据间有极显著性差异（P<0.01）。
对FOC4菌丝生长的抑制率为90.74%（图5）。由图6可见，对照组的FOC4孢子完全萌发，NJQG-3A1发酵液对FOC4孢子萌发的抑制率达到100%。
2.4活性菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病的防控效果
由表3可见，接种病原菌和NJQG-3A1发酵液（处理3）的香蕉植株，其病情指数为15.00，对香蕉枯萎病相对防效为82.46%，菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病具有良好的防控作用，与仅接种病原菌（处理2）相比，差异极为显著。
表3菌株NJQG-3A1对香蕉枯萎病病盆栽防治效果
不同处理发病率
（%）病情指数相对防效
（%）处理1（清水）5.005.0094.15处理2（病原菌）100.0085.500处理3（病原菌 发酵液）15.0015.0082.46 2.5活性菌株NJQG-3A1的鉴定结果
从形态特征上看，菌株NJQG-3A1在高氏培养基上生长缓慢，菌落呈圆饼粉状，气生菌丝为白色，基内菌丝不发达，白色细丝状。电镜下扫描可以看到，紧密排列的孢子丝有较少分叉，孢子链螺旋状排列，单个成熟的孢子呈棒杆状，表面微绒（图7）。
由表4可见，菌株NJQG-3A1在7种鉴定培养基上均能生长；在酵母膏麦芽汁琼脂、燕麦片琼脂、胨酵母膏铁琼脂培养基上较其他培养基上生长快，产孢多，且有可溶性色素产生；在甘油天门冬酰胺琼脂培养基上无基内菌丝；在不同培养基上，基内菌丝呈现出白色、黄褐色、棕色等，气生菌丝主要為白色至棕色、黄褐色等。
生理生化特征分析结果表明，菌株NJQG-3A1明胶液化，不产黑色素，淀粉水解，不产H2S；在吲哚试验、脲酶试验、脂酶试验与硝酸还原试验中均显阳性；可以利用的碳源有核糖、可溶性淀粉、水杨苷、葡萄糖、蔗糖、肌醇等，可以利用的氮源有缬氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、精氨酸、组氨酸、丝氨酸等；最适生长pH值为7.0～8.0，最适生长温度28～30 ℃；NaCl受耐性为3%。表4菌株NJQG-3A1在不同培养基上的生长特征
培养基生长情况气生菌丝基内菌丝可溶性色素高氏1号培养基生长慢，产孢少适中、白色白色无酵母膏麦芽汁琼脂生长快，产孢多丰富、白色至灰棕色黄褐色黄褐色无机盐淀粉琼脂生长慢，产孢少适中、白色至棕褐色棕色无燕麦片琼脂生长快，产孢多丰富，白色至灰棕色黄褐色淡黄色甘油天门冬酰胺琼脂生长慢，产孢少少，黄棕色无无胨酵母膏铁琼脂生长快，产孢多丰富，灰白色至黄褐色黄褐色黄褐色酪氨酸琼脂生长慢，产孢少少，白色至黄褐色灰白色无
以菌株NJQG-3A1基因组DNA为模板进行PCR扩增，测得菌株NJQG-3A1 16S rRNA基因核苷酸序列长度为 1 421 bp，序列提交GenBank，获得登录号为KF703553，在EzTaxon数据库中经有效种的序列相似性搜索，发现与菌株NJQG-3A1相似性较高的都是链霉菌属成员，其中，与Streptomyces phaeoluteichromatogenes NRRL 5799T相似性最高，达到99.221%。采用BioEdit、Mega 6.0等软件对菌株进行系统发育分析，并用邻接法（Neighbour-Joining，NJ法）构建系统发育树（图8）。综合菌株NJQG-3A1的培养特征和生理生化特征，将其鉴定为Streptomyces phaeoluteichromatogenne。
3结论与讨论
本研究在6种分离培养基上，采用组织匀浆法从5种香蕉植株体内共分离到142株内生放线菌，经平板对峙试验，筛选出6株对FOC4具有抑制作用的活性菌株，其中，活性菌株NJQG-3A1对FOC4的抑制作用最强，抑菌率达83.21%，盆栽防效达82.46%。
从植物组织内分离到的内生菌数量和种类受很多因素的影响，如分离材料的来源、分离的组织部位、分离方法、分离培养基的成分、表面消毒程度及培养条件等，目前还没有一种完全适用的方法可以分离植物组织内的所有微生物，通过选择适宜的分离方法，可以尽可能多地获得内生菌。研究结果表明：（1）香蕉植株各个组织中都存在大量的内生放线菌，内生放线菌数量在香蕉组织内呈现根>球茎>假茎>叶的趋势，这与曹理想等的结果[26]相同。这一方面是由于内生微生物主要是通过根进入植株体内[27]，从而在根部分离得到的内生放线菌相对较多；另一方面可能是在植物内生菌分离的实际操作中，次氯酸钠、乙醇等常用消毒剂对内生菌有很大的杀伤作用[28]，且消毒时间和消毒方式也会影响分离结果[26]，香蕉叶片组织表皮较薄，消毒时间过长，一部分内生菌可能会被杀死，从而导致在叶中分离到的内生放线菌数量少。（2）从健康植株分离得到的内生放线菌远远多于病株，这与林时迟等的研究结论[29]相符，植物体内微生物种群越丰富，数量越多，植物生态系的功能与结构越稳定，越不易感病。（3）从南宝蕉园南天植株内分离得到63株内生放线菌，而从黄桐美台蕉园农科植株体内分离到23株，这可能是受土壤环境差异影响，南宝蕉园土壤的pH值明显高于黄桐美台蕉园，土壤相对偏碱性，碱性条件适合于放线菌的生存[30]。（4）HV和GA培养基上分离得到的内生放线菌数量分别为62株和40株，远远大于从GS、SIM、1/10ATCC、GPT培养基上得到的内生放线菌数量，这说明前2种培养基比较适合香蕉内生放线菌的分离。（5）通过平板对峙、含药介质法及孢子萌发试验，发现活性菌株NJQG-3A1对FOC4具有明显的抑制作用，为香蕉内生放线菌抗菌活性物质的开发利用提供了一定的理论与应用基础。
本试验由于受到分离手段的局限性，有些内生菌不能在人工培养基上生长，有些内生菌因为生长缓慢而被生长相对较快的菌株所掩盖，没有获得稀有的放线菌，在一定程度上减少了活性菌株的发现概率。此外，本研究主要在室内离体条件下进行，若要更准确地探究拮抗菌株NJQG-3A1的生防潜能，需要对该菌株抑菌活性进行更深层次的综合评价。
参考文献：
[1]陈琼武. 乐东县香蕉枯萎病发生状况及防治措施[J]. 安徽农学通报，2008，14（12）：73，78.
[2]胡莉莉，窦美安，谢江辉，等. 香蕉枯萎病抗病性研究进展[J]. 广西热带农业，2006，102（1）：16-18.
[3]Hwang S C，Ko W H. Cavendish banana cultivars resistant to fusarium wilt acquired through somaclonal variation in Taiwan[J]. Plant Disease，2004，88（6）：580-588.
[4]舒肇甦. 台湾香蕉病害的防治[J]. 柑桔与亚热带果树信息，2000，16（2）：43-44. [5]林兰稳，奚伟鹏，黄赛花. 香蕉镰刀菌枯萎病防治药剂的筛选[J]. 生态环境，2003，12（2）：182-183.
[6]卓国豪，黄有宝，吴运新，等. 香蕉枯萎病的综合防治技术[J]. 植物检疫，2003，17（5）：279-280.
[7]王清红，李培征.香蕉枯萎病生物防治研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（20）：10747-10748.
[8]付洁，侯军，谢芳芹，等. 植物内生菌农药活性研究进展[J]. 陕西农业科学，2006（3）：66-68.
[9]姜钰，董怀玉，徐秀德，等. 放线菌在植病生防中的研究进展[J]. 杂粮作物，2005，25（5）：329-331.
[10]秦涵淳，杨腊英，李松伟，等. 香蕉镰刀菌枯萎病拮抗放线菌的分离筛选及其抑制效果的初步评价[J]. 中国生物防治，2010，26（2）：174-180.
[11]Chen C Y，Wang Y H，Huang C J. Enhancement of the antifungal activity of Bacillus subtilis F29-3 by the chitinase encoded by Bacillus circulans chiA gene[J]. Canadian Journal of Microbiology，2004，50（6）：451-454.
[12]Cao L X，Qiu Z Q，Dai X，et al. Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of banana （Musa acuminata） plants and their activities against Fusarium oxysporum f. sp. cubense[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2004，20（5）：501-504.
[13]Tjamos E C，Tsitsigiannis D I，Tjamos S E，et al. Selection and screening of endorhizosphere bacteria from solarized soils as biocontrol agents against verticillium dahliae of solanaceous hosts[J]. European Journal of Plant Pathology，2004，110（1）：35-44.
[14]沈萍，范秀容，李光武.微生物学实验[M]. 北京：人民教育出版社，1980：72-73.
[15]彭云霞，姜怡，段淑蓉，等. 稀有放线菌的选择性分离方法[J]. 云南大学学报：自然科学版，2007，29（1）：86-89.
[16]Takahashi Y，Matsumoto A，Seino A，et al. Rare actinomycetes isolated from desert soils[J]. Actinomycetologica，1996，10（2）：91-97.
[17]黄小龙，曹树威，周双清，等. 一株淮山炭疽病拮抗放线菌的分离及初步鉴定[J]. 安徽农业科学，2011，39（19）：11474-11476.
[18]姜怡，段淑蓉，唐蜀昆，等. 稀有放线菌分离方法[J]. 微生物学通报，2006，33（1）：181-183.
[19]Shirling E B，Gottlieb D. Methods for characterization of Streptomyces species[J]. International Journal of Systematic Bacteriology，1966，16（3）：313-340.
[20]Williams S T，Goodfellow M，Alderson G，et al. Numerical classification of Streptomyces and related genera[J]. Journal of General Microbiology，1983，129（6）：1743-1813.
[21]洪葵，谢晴宜. 药用微生物资源研究技术[M]. 北京：中国农业大学出版社，2006：10-13.
[22]孔亚男，陈文强，邓百万，等. 虎杖内生放线菌的分离鉴定及抗菌活性[J]. 福建农林大学学报：自然科学版，2012，41（6）：616-621.
[23]阎逊初.放线菌的分类和鉴定[M]. 北京：科学出版社，1992：296-1048.
[24]方中达. 植病研究方法[M]. 北京：农业出版社，1979：8-154.
[25]中国科学院微生物研究所放线菌分类组. 链霉菌鉴定手册[M]. 北京：科学出版社，1975：13-15.
[26]曹理想，田新莉，周世宁. 香蕉内生真菌、放线菌类群分析[J]. 中山大学学报：自然科学版，2003，42（2）：70-73.
[27]Gough C，Galera C，Vasse J，et al. Specific flavonoids promote intercellular root colonization of Arabidopsis thaliana by Azorhizobium caulinodans ORS571[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，1997，10（5）：560-570.
[28]付业勤，蔡吉苗，刘先宝，等. 香蕉内生细菌分离、活性评价及数量分布[J]. 热带作物学报，2007，28（4）：78-83.
[29]林时迟，张绍升，周乐峰，等. 福建省香蕉枯萎病鉴定[J]. 福建农业大学学报，2000，29（4）：465-469.
[30]田新莉，曹理想，杨国武，等. 水稻内生放线菌类群及其对宿主病原菌的抗性研究[J]. 微生物学报，2004，44（5）：641-646.张猛. 植物源杀菌剂20%丁香酚水乳剂对草莓灰霉病的田间防治效果[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：132-133.