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摘 要 前期的研究发现MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究在此基础上，发现MaGAD1表达的有效抑制剂氨氧乙酸（AOAA）能够延缓香蕉采后成熟。生理学分析表明，外施AOAA能够延长香蕉果实发生生理跃变的时间。实时荧光定量PCR分析表明，外施AOAA能够抑制MaGAD1和MaACS1基因的表达。所以，AOAA通过抑制MaGAD1和MaACS1基因的表达和延缓香蕉果实生理跃变，推迟香蕉果实采后成熟。本研究从理论上证明AOAA能够延缓香蕉果实成熟，揭示AOAA延缓香蕉果实成熟生理机制，并且从实际生产上提供一种可能应用于香蕉保鲜的新方法。
关键词 香蕉；采后成熟；乙烯；MaGAD1；AOAA
中图分类号 Q344.13 文献标识码 A
香蕉是典型的呼吸跃变型果实，香蕉采后成熟过程中有大量的乙烯产生，从而导致一系列生理生化变化，如淀粉转变为糖、多酚的降解、结构碳水化合物的酶解。这些生理变化最终会导致香蕉品质形成，如硬度、涩味、香味、颜色以及货架期，进而影响到香蕉的商品价值[1]。香蕉不易保鲜，不耐储运，运销中因腐烂造成的损失达总产量的20%以上[2]。因此，研究香蕉采后成熟机理，创新采后保鲜技术具有重要的理论意义和实际应用价值。
谷氨酸脱羧酶（GAD）能够与磷酸吡哆醛辅因子结合催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。GAD与植物pH调控、N储存、植物发育、果实成熟等生理过程密切相关[3-4]。先前的研究从番茄、柑橘等果树中分离出的GAD基因在果实成熟的不同阶段具有差异表达的特征[5-7]。最近，Liu等[8]研究表明，随着柑橘果实中可滴定酸含量的降低，CsGAD1基因的表达以及GAD活力显著增加。所以，GAD基因的表达与果实的品质也有一定的关系。氨氧乙酸（AOAA）和氨基脲被报道是GAD基因表达的抑制剂[9-12]。另外，AOAA被报道能够抑制乙烯的产生。Bulantseva等[13]研究表明外施AOAA能够导致香蕉果实乙烯生物合成降低30%。然而，也有报道指出，AOAA与乙烯生物合成没有关系，但与细胞内亚精胺的水平密切相关[14]。
但是，AOAA和氨基脲是否能够影响香蕉果实成熟尚不明确，AOAA和氨基脲影响果实成熟的生理机制尚不清楚。
笔者前期的研究利用抑制差减杂交及cDNA微阵列筛选香蕉采后乙烯跃变启始时差异表达的基因。结果表明，GAD基因的cDNA片段显著上调，并且是所获得的289个cDNA片段中表达量最高的[15-16]。随后，笔者克隆了该基因（MaGAD1），并测定了该基因在香蕉采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关[17]。本研究以MaGAD1为靶基因，筛选MaGAD1表达的抑制剂，探索MaGAD1表达的抑制剂对香蕉采后成熟的调控作用，揭示其作用的生理机制。这些研究结果不仅从理论上证明AOAA能够促进果实成熟及相关生理机制，并且从实际生产上提供一种能够应用于香蕉保鲜的新方法。
1 材料与方法
1.1 植物材料和处理
供试香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）果实采自中国热带农业科学院香蕉研究所澄迈香蕉种植基地。香蕉果实（断蕾110 d后，全绿期，成熟度1），用0.1%次氯酸钠消毒10 min，并用无菌水清洗3次。香蕉采后成熟过程划分为7个成熟度：全绿期（成熟度1，Ⅰ），黄色出现期（成熟度2，Ⅱ），绿色多于黄色期（成熟度3，Ⅲ），黄色多于绿色期（成熟度4，Ⅳ），绿色轻微存在期（成熟度5，Ⅴ），全黄期（成熟度6，Ⅵ），全黄并有黑色斑点期（成熟度7，Ⅶ）[18]。
香蕉果实采后成熟抑制剂筛选实验将香蕉果实分成3组（每组36个果指）：正常成熟、AOAA处理以及氨基脲处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，并统计达到成熟度7的时间。AOAA处理：将AOAA配成15、5、1 mmol/L 3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再分5、30、120、240 min 4个时间浸泡香蕉果实（每个处理时间处理3个果指），然后将其放于25 ℃培养室，记录每一组香蕉果实达到成熟度7的时间。氨基脲处理：将氨基脲配成10、2、0.2 g/kg 3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再分5、30、120、240 min（每个处理时间处理3个果指）4个时间浸泡香蕉果实，然后将其放于25 ℃培养室，记录每一组香蕉果实达到成熟度7的时间。每个样品做3次生物学重复。
AOAA处理实验将香蕉果实分成二组（每组21个果指）：正常成熟和AOAA处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，并记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间（每个样品测定3个果指）。AOAA处理：用5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min，将其放于25 ℃培养室，观察记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间（每个样品测定3个果指）。在正常成熟及AOAA处理下，取香蕉果肉测定相关生理指标并进行基因表达分析。每个样品做3次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 香蕉果实生理指标的测定 香蕉果实硬度测定：根据杭州托普仪器有限公司硬度测定仪说明书测定香蕉果实硬度。选取的测定部位为果实中间部位，每个果指测定3次，每个样品测3个果指。香蕉果实可溶性糖含量测定根据王学奎等[19]的方法。取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用蒸馏水研磨，于沸水中连续提取两次。提取液用苯酚和浓硫酸反应后，在485 nm波长下测定吸光度，每个样品测定3次。香蕉果实淀粉含量测定参照徐昌杰等[20]的方法。取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用乙醇研磨，用80% Ca（NO3）2溶液提取2次。提取液用I2-KI反应，于620 nm波长下测定光吸光度，每个样品测定3次。 1.2.2 基因表达分析 根据实时荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物。引物序列见表1。在Stratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR实验。在0.2 mL的PCR反应管中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA ） 0.5 μL、5 μmol/L的一对引物各0.75 μL，cDNA样品1 μL，然后用水补足至25 μL。每个样品同时用于扩增目的基因和内参基因MaActin1，并进行3次重复。按照94 ℃预变性3 min，94 ℃变性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环的反应程序进行扩增。反应结束后做94～55 ℃的融解曲线分析。采用2-ΔΔCt定量方法进行相对定量分析[21]，以0 d的cDNA模板为对照样品。每个样品做3次重复。
2 结果与分析
2.1 GAD基因抑制剂对香蕉采后成熟的影响
在正常成熟过程中，香蕉果实达到成熟度7的时间为8 d。在15 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为10、11、12 d。在5 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为10、12、13 d。在1 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为9、12、12 d。这些结果表明，与正常成熟相比较，AOAA处理能够推迟香蕉果实成熟，5 mmol/L AOAA处理240 min效果最为明显（图1-A）。而且，在5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min，放置 8 d 后，香蕉果实几乎没有黑色斑点，而正常成熟的香蕉果实有较多的黑色斑点（图1-C）。所以，外施AOAA能够显著推迟香蕉果实成熟。另外，10及0.2 g/kg氨基脲处理对香蕉果实成熟没有推迟效果，2 g/kg氨基脲处理能够轻微推迟香蕉果实成熟。这些结果表明，氨基脲处理对香蕉果实成熟的推迟效果不明显（图1-B）。
2.2 AOAA对香蕉采后成熟的影响
在5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min后，观察香蕉果实达到每一个成熟度的时间发现，除了成熟度1，AOAA处理后香蕉果实达到其它每一个成熟度的时间都比正常对照推迟（表2）。这些结果表明，外施AOAA能够显著推迟香蕉果实达到成熟度2～7的时间。
2.3 AOAA对香蕉采后生理的影响
在正常成熟条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉在8～9 d急剧下降（图2-A；2-B）；可溶性糖在采后8～9 d急剧上升（图2-C）。这些结果表明，在正常成熟条件下，香蕉果实在8～9 d出现生理跃变。在AOAA处理条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉在8～18 d急剧下降（图2-D；2-E）；可溶性糖在8～18 d急剧上升（图2-F）。这些结果表明，在AOAA处理条件下，香蕉果实在8～18 d出现生理跃变。所以，在正常成熟及AOAA处理条件下，香蕉果实都从第8天开始发生生理跃变；但是，与正常成熟相比较，AOAA处理下，香蕉果实发生生理跃变的时间显著被延长。
2.4 AOAA对香蕉采后乙烯生物合成相关基因表达的影响
在正常成熟及AOAA处理条件下，MaACO1 的表达没有明显的规律；但是，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后0～7 d都维持在较低的水平，在采后第8显著提高（图3）。这些结果表明，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后成熟过程中具有一致的趋势，并且在采后第8天显著提高。另外，与正常成熟相比较，AOAA处理下MaGAD1和MaACS1的表达都显著被抑制。
3 讨论与结论
笔者们前期的研究发现，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究希望通过体外调控MaGAD1的表达，从而调控香蕉采后成熟过程。根据文献报道，AOAA和氨基脲能够显著抑制GAD基因的表达[9-12]。所以，用AOAA和氨基脲处理香蕉果实，统计香蕉果实在不同处理下达到成熟度7的时间，从而确定AOAA和氨基脲对香蕉果实采后成熟的影响。结果表明，AOAA能够显著推迟香蕉果实成熟。为了进一步确证AOAA对采后香蕉果实成熟的延迟作用，笔者们统计了在AOAA处理下香蕉果实达到每一个成熟度的时间，结果表明AOAA能够显著推迟香蕉果实达到成熟度2～7的时间。这些结果充分的证明了AOAA能够推迟采后香蕉果实成熟。
香蕉采后成熟过程经历了一系列的呼吸跃变过程，从而导致香蕉果实发生了相关的生理变化，如果实软化[22]、淀粉降解和可溶性糖含量增加[23-24]。既然AOAA能够显著推迟香蕉果实采后成熟，那么是否AOAA能够影响香蕉果实的生理变化值得进一步探讨。所以，在正常成熟和AOAA处理下测定了香蕉果实的硬度、淀粉含量和可溶性糖含量。结果表明，在正常成熟及AOAA处理下，香蕉果实都在采后第8天开始生理跃变；但是，AOAA处理显著延长了香蕉果实发生生理跃变的时间。这些研究结果从生理学的角度支持了AOAA通过影响香蕉采后生理变化延缓香蕉果实成熟。
乙烯是香蕉采后成熟的重要调控因子。Liu等[25]研究表明，乙烯生物合成关键酶基因MaACO1和MaACS1在香蕉采后成熟过程中起着重要作用。笔者们推测AOAA延缓香蕉采后成熟及生理跃变可能与MaACO1和MaACS1的表达密切相关。所以，笔者们研究了正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaACO1和MaACS1基因的表达水平。结果表明，在正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaACS1的表达水平在采后第8天显著提高，与香蕉果实生理跃变发生时间一致。MaACS1被报道是香蕉采后成熟过程中跃变乙烯生物合成的关键酶基因[25-26]。综上，这些研究结果从分子生物学的角度进一步支持了AOAA通过影响MaACS1的表达延缓香蕉果实采后成熟。 本研究根据AOAA能够显著抑制GAD基因表达这一生理效应，进一步探讨AOAA对香蕉采后成熟的影响，那么是否AOAA能够抑制MaGAD1表达应该得到证实。所以，笔者们测定了在正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaGAD1基因的表达水平。结果表明，与正常成熟相比，AOAA能够显著抑制MaGAD1上调表达，同时也能抑制MaACS1上调表达（图3）。另外，在正常成熟及AOAA处理下，MaGAD1表达与MaACS1表达的趋势一致，并且都在采后第8天显著上调，与香蕉果实生理跃变发生的时间一致（图2、3）。综上，本研究的结论是，AOAA通过抑制MaGAD1和MaACS1上调表达和延缓香蕉果实生理跃变，推迟香蕉果实采后成熟。
参考文献
[1] Giovannoni J J. Genetic regulation of fruit development and ripening[J]. The Plant Cell， 2004， 16（suppl 1）： S170-S180.
[2] 莫磊兴， 邹 瑜， 李小泉， 等. 香蕉的采后生理与保鲜技术[J]. 广西农业科学， 1998， 5： 266-268.
[3] Bown A W， Shelp B J. The metabolism and functions of [gamma]-aminobutyric acid[J]. Plant Physiology， 1997， 115（1）： 1-5.
[4] Gallego P P， Whotton L， Picton S， et al. A role for glutamate decarboxylase during tomato ripening： the characterisation of a cDNA encoding a putative glutamate decarboxylase with a calmodulin-binding site[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 27（6）： 1 143-1 151.
[5] Trobacher C P， Zarei A， Liu J， et al. Calmodulin-dependent and calmodulin-independent glutamate decarboxylases in apple fruit[J]. BMC Plant Biology， 2013， 13： 144.
[6] Cercós M， Soler G， Iglesias D J， et al. Global analysis of gene expression during development and ripening of Citrus fruit flesh. A proposed mechanism for citric acid utilization[J]. Plant Molecular Biology， 2006， 62（4-5）： 513-527.
[7] Akihiro T， Koike S， Tani R， et al. Biochemical mechanism on GABA accumulation during fruit development in tomato[J]. Plant Cell Physiology， 2008， 49（9）： 1 378-1 389.
[8] Liu X， Hu X M， Jin L F， et al. Identification and transcript analysis of two glutamate decarboxylase genes， CsGAD1 and CsGAD2， reveal the strong relationship between CsGAD1 and citrate utilization in citrus fruit[J]. Molecular Biology Reports， 2014， 41（9）： 6 253-6 262.
[9] Golan H， Grossman Y. Block of glutamate decarboxylase decreases GABAergic inhibition at the crayfish synapses： possible role of presynaptic metabotropic mechanisms[J]. Journal of Neurophysiology， 1996， 75（5）： 2 089-2 098.
[10] Sonnewald U， Kortner T M， Qu H， et al. Demonstration of extensive GABA synthesis in the small population of GAD positive neurons in cerebellar cultures by the use of pharmacological tools[J]. Neurochemistry International， 2006， 48（6）： 572-578.
[11] Sawaki K， Ouchi K， Sato T， et al. Existence of gamma-aminobutyric acid and its biosynthetic and metabolic enzymes in rat salivary glands[J]. Japanese Journal of Pharmacology， 1995， 67（4）： 359-363. [12] Borelli K G， Ferreira-Netto C， Brandǎo M L. Distribution of Fos immunoreactivity in the rat brain after freezing or escape elicited by inhibition of glutamic acid decarboxylase or antagonism of GABA-A receptors in the inferior colliculus[J]. Behavioural Brain Research， 2006， 170（1）： 84-93.
[13] Bulantseva E A， Thang N T， Ruzhitskii A O， et al. The effect of ethylene biosynthesis regulators on metabolic processes in the banana fruits in various physiological states[J]. Applied Biochemistry and Microbiology， 2009， 45（1）： 104-108.
[14] Huang X L， Li X J， Li Y， et al. The effect of AOA on ethylene and polyamine metabolism during early phases of somatic embryogenesis in Medicago sativa[J]. Physiologia Plantarum， 2001， 113（3）： 424-429.
[15] Xu B Y， Su W， Liu J H， et al. Differentially expressed cDNAs at the early stage of banana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray[J]. Planta， 2007， 226（2）： 529-539.
[16] Jin Z Q， Xu B Y， Liu J H， et al. Identification of genes differentially expressed at the onset of the ethylene climacteric in banana[J]. Postharvest Biology and Technology， 2009， 52（3）： 307-309.
[17] 胡 伟， 杨晓颖， 李美英，等. 香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达[J]. 西北植物学报， 2009， 29（3）： 429-434.
[18] Pua E C， Chandramouli S， Han P， et al. Malate synthase gene expression during fruit ripening of Cavendish banana（Musa acuminata cv. Williams）[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（381）： 309-316.
[19] 王学奎. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2005， 204-206.
[20] 徐昌杰， 陈文峻， 陈昆松， 等. 淀粉含量测定的一种简便方法-碘显色法[J]. 生物技术， 1998， 8（2）： 41-43.
[21] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J]. Method， 2001， 25（4）： 402-408.
[22] Lohani S， Trivedi P K， Nath P. Changes in activities of cell wall hydrolases during ethylene-induced ripening in banana： effect of 1-MCP， ABA and IAA[J]. Postharvest Biology and Technology， 2004， 31（2）： 119-126.
[23] Hill S A， ap Rees T. The effect of glucose on the control of carbohydrate metabolism in ripening bananas[J]. Planta， 1995a， 196（2）： 335-343.
[24] Hill S A， ap Rees T. The effect of hypoxia on the control of carbohydrate metabolism in ripening bananas[J]. Planta， 1995b， 197（2）： 313-323.
[25] Liu X， Shiomi S， Nakatsuka A， et al. Characterization of ethylene biosynthesis associated with ripening in banana fruit[J]. Plant Physiology， 1999， 121（4）： 1 257-1 265.
[26] Huang F C， Do Y Y， Huang P L. Genomic organization of a diverse ACC synthase gene family in banana and expression characteristics of the gene member involved in ripening of banana fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（11）： 3 859-3 868.
关键词 香蕉；采后成熟；乙烯；MaGAD1；AOAA
中图分类号 Q344.13 文献标识码 A
香蕉是典型的呼吸跃变型果实，香蕉采后成熟过程中有大量的乙烯产生，从而导致一系列生理生化变化，如淀粉转变为糖、多酚的降解、结构碳水化合物的酶解。这些生理变化最终会导致香蕉品质形成，如硬度、涩味、香味、颜色以及货架期，进而影响到香蕉的商品价值[1]。香蕉不易保鲜，不耐储运，运销中因腐烂造成的损失达总产量的20%以上[2]。因此，研究香蕉采后成熟机理，创新采后保鲜技术具有重要的理论意义和实际应用价值。
谷氨酸脱羧酶（GAD）能够与磷酸吡哆醛辅因子结合催化谷氨酸转化为γ-氨基丁酸（GABA）和CO2。GAD与植物pH调控、N储存、植物发育、果实成熟等生理过程密切相关[3-4]。先前的研究从番茄、柑橘等果树中分离出的GAD基因在果实成熟的不同阶段具有差异表达的特征[5-7]。最近，Liu等[8]研究表明，随着柑橘果实中可滴定酸含量的降低，CsGAD1基因的表达以及GAD活力显著增加。所以，GAD基因的表达与果实的品质也有一定的关系。氨氧乙酸（AOAA）和氨基脲被报道是GAD基因表达的抑制剂[9-12]。另外，AOAA被报道能够抑制乙烯的产生。Bulantseva等[13]研究表明外施AOAA能够导致香蕉果实乙烯生物合成降低30%。然而，也有报道指出，AOAA与乙烯生物合成没有关系，但与细胞内亚精胺的水平密切相关[14]。
但是，AOAA和氨基脲是否能够影响香蕉果实成熟尚不明确，AOAA和氨基脲影响果实成熟的生理机制尚不清楚。
笔者前期的研究利用抑制差减杂交及cDNA微阵列筛选香蕉采后乙烯跃变启始时差异表达的基因。结果表明，GAD基因的cDNA片段显著上调，并且是所获得的289个cDNA片段中表达量最高的[15-16]。随后，笔者克隆了该基因（MaGAD1），并测定了该基因在香蕉采后不同成熟阶段的表达情况。结果表明，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关[17]。本研究以MaGAD1为靶基因，筛选MaGAD1表达的抑制剂，探索MaGAD1表达的抑制剂对香蕉采后成熟的调控作用，揭示其作用的生理机制。这些研究结果不仅从理论上证明AOAA能够促进果实成熟及相关生理机制，并且从实际生产上提供一种能够应用于香蕉保鲜的新方法。
1 材料与方法
1.1 植物材料和处理
供试香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazilian）果实采自中国热带农业科学院香蕉研究所澄迈香蕉种植基地。香蕉果实（断蕾110 d后，全绿期，成熟度1），用0.1%次氯酸钠消毒10 min，并用无菌水清洗3次。香蕉采后成熟过程划分为7个成熟度：全绿期（成熟度1，Ⅰ），黄色出现期（成熟度2，Ⅱ），绿色多于黄色期（成熟度3，Ⅲ），黄色多于绿色期（成熟度4，Ⅳ），绿色轻微存在期（成熟度5，Ⅴ），全黄期（成熟度6，Ⅵ），全黄并有黑色斑点期（成熟度7，Ⅶ）[18]。
香蕉果实采后成熟抑制剂筛选实验将香蕉果实分成3组（每组36个果指）：正常成熟、AOAA处理以及氨基脲处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，并统计达到成熟度7的时间。AOAA处理：将AOAA配成15、5、1 mmol/L 3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再分5、30、120、240 min 4个时间浸泡香蕉果实（每个处理时间处理3个果指），然后将其放于25 ℃培养室，记录每一组香蕉果实达到成熟度7的时间。氨基脲处理：将氨基脲配成10、2、0.2 g/kg 3个浓度梯度（每个浓度处理12个果指），每个浓度下再分5、30、120、240 min（每个处理时间处理3个果指）4个时间浸泡香蕉果实，然后将其放于25 ℃培养室，记录每一组香蕉果实达到成熟度7的时间。每个样品做3次生物学重复。
AOAA处理实验将香蕉果实分成二组（每组21个果指）：正常成熟和AOAA处理。正常成熟：将香蕉果实放于25 ℃培养室，并记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间（每个样品测定3个果指）。AOAA处理：用5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min，将其放于25 ℃培养室，观察记录香蕉果实达到每一个成熟度的时间（每个样品测定3个果指）。在正常成熟及AOAA处理下，取香蕉果肉测定相关生理指标并进行基因表达分析。每个样品做3次生物学重复。
1.2 方法
1.2.1 香蕉果实生理指标的测定 香蕉果实硬度测定：根据杭州托普仪器有限公司硬度测定仪说明书测定香蕉果实硬度。选取的测定部位为果实中间部位，每个果指测定3次，每个样品测3个果指。香蕉果实可溶性糖含量测定根据王学奎等[19]的方法。取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用蒸馏水研磨，于沸水中连续提取两次。提取液用苯酚和浓硫酸反应后，在485 nm波长下测定吸光度，每个样品测定3次。香蕉果实淀粉含量测定参照徐昌杰等[20]的方法。取3个香蕉果指，去除果皮，将果肉切成小块，用液氮冷冻后压碎混合。取0.5 g香蕉果肉，用乙醇研磨，用80% Ca（NO3）2溶液提取2次。提取液用I2-KI反应，于620 nm波长下测定光吸光度，每个样品测定3次。 1.2.2 基因表达分析 根据实时荧光定量PCR的引物设计原则，用primer premier 5设计引物。引物序列见表1。在Stratagene的Mx3000P仪器上进行荧光定量PCR实验。在0.2 mL的PCR反应管中加入SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA ） 0.5 μL、5 μmol/L的一对引物各0.75 μL，cDNA样品1 μL，然后用水补足至25 μL。每个样品同时用于扩增目的基因和内参基因MaActin1，并进行3次重复。按照94 ℃预变性3 min，94 ℃变性7 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环的反应程序进行扩增。反应结束后做94～55 ℃的融解曲线分析。采用2-ΔΔCt定量方法进行相对定量分析[21]，以0 d的cDNA模板为对照样品。每个样品做3次重复。
2 结果与分析
2.1 GAD基因抑制剂对香蕉采后成熟的影响
在正常成熟过程中，香蕉果实达到成熟度7的时间为8 d。在15 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为10、11、12 d。在5 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为10、12、13 d。在1 mmol/L AOAA处理下，处理30、120、240 min后，香蕉果实达到成熟度7的时间分别为9、12、12 d。这些结果表明，与正常成熟相比较，AOAA处理能够推迟香蕉果实成熟，5 mmol/L AOAA处理240 min效果最为明显（图1-A）。而且，在5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min，放置 8 d 后，香蕉果实几乎没有黑色斑点，而正常成熟的香蕉果实有较多的黑色斑点（图1-C）。所以，外施AOAA能够显著推迟香蕉果实成熟。另外，10及0.2 g/kg氨基脲处理对香蕉果实成熟没有推迟效果，2 g/kg氨基脲处理能够轻微推迟香蕉果实成熟。这些结果表明，氨基脲处理对香蕉果实成熟的推迟效果不明显（图1-B）。
2.2 AOAA对香蕉采后成熟的影响
在5 mmol/L AOAA处理香蕉果实240 min后，观察香蕉果实达到每一个成熟度的时间发现，除了成熟度1，AOAA处理后香蕉果实达到其它每一个成熟度的时间都比正常对照推迟（表2）。这些结果表明，外施AOAA能够显著推迟香蕉果实达到成熟度2～7的时间。
2.3 AOAA对香蕉采后生理的影响
在正常成熟条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉在8～9 d急剧下降（图2-A；2-B）；可溶性糖在采后8～9 d急剧上升（图2-C）。这些结果表明，在正常成熟条件下，香蕉果实在8～9 d出现生理跃变。在AOAA处理条件下，采后香蕉果实的硬度和淀粉在8～18 d急剧下降（图2-D；2-E）；可溶性糖在8～18 d急剧上升（图2-F）。这些结果表明，在AOAA处理条件下，香蕉果实在8～18 d出现生理跃变。所以，在正常成熟及AOAA处理条件下，香蕉果实都从第8天开始发生生理跃变；但是，与正常成熟相比较，AOAA处理下，香蕉果实发生生理跃变的时间显著被延长。
2.4 AOAA对香蕉采后乙烯生物合成相关基因表达的影响
在正常成熟及AOAA处理条件下，MaACO1 的表达没有明显的规律；但是，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后0～7 d都维持在较低的水平，在采后第8显著提高（图3）。这些结果表明，MaGAD1和MaACS1的表达在香蕉采后成熟过程中具有一致的趋势，并且在采后第8天显著提高。另外，与正常成熟相比较，AOAA处理下MaGAD1和MaACS1的表达都显著被抑制。
3 讨论与结论
笔者们前期的研究发现，MaGAD1基因的表达与香蕉采后乙烯生物合成及果实成熟密切相关。本研究希望通过体外调控MaGAD1的表达，从而调控香蕉采后成熟过程。根据文献报道，AOAA和氨基脲能够显著抑制GAD基因的表达[9-12]。所以，用AOAA和氨基脲处理香蕉果实，统计香蕉果实在不同处理下达到成熟度7的时间，从而确定AOAA和氨基脲对香蕉果实采后成熟的影响。结果表明，AOAA能够显著推迟香蕉果实成熟。为了进一步确证AOAA对采后香蕉果实成熟的延迟作用，笔者们统计了在AOAA处理下香蕉果实达到每一个成熟度的时间，结果表明AOAA能够显著推迟香蕉果实达到成熟度2～7的时间。这些结果充分的证明了AOAA能够推迟采后香蕉果实成熟。
香蕉采后成熟过程经历了一系列的呼吸跃变过程，从而导致香蕉果实发生了相关的生理变化，如果实软化[22]、淀粉降解和可溶性糖含量增加[23-24]。既然AOAA能够显著推迟香蕉果实采后成熟，那么是否AOAA能够影响香蕉果实的生理变化值得进一步探讨。所以，在正常成熟和AOAA处理下测定了香蕉果实的硬度、淀粉含量和可溶性糖含量。结果表明，在正常成熟及AOAA处理下，香蕉果实都在采后第8天开始生理跃变；但是，AOAA处理显著延长了香蕉果实发生生理跃变的时间。这些研究结果从生理学的角度支持了AOAA通过影响香蕉采后生理变化延缓香蕉果实成熟。
乙烯是香蕉采后成熟的重要调控因子。Liu等[25]研究表明，乙烯生物合成关键酶基因MaACO1和MaACS1在香蕉采后成熟过程中起着重要作用。笔者们推测AOAA延缓香蕉采后成熟及生理跃变可能与MaACO1和MaACS1的表达密切相关。所以，笔者们研究了正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaACO1和MaACS1基因的表达水平。结果表明，在正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaACS1的表达水平在采后第8天显著提高，与香蕉果实生理跃变发生时间一致。MaACS1被报道是香蕉采后成熟过程中跃变乙烯生物合成的关键酶基因[25-26]。综上，这些研究结果从分子生物学的角度进一步支持了AOAA通过影响MaACS1的表达延缓香蕉果实采后成熟。 本研究根据AOAA能够显著抑制GAD基因表达这一生理效应，进一步探讨AOAA对香蕉采后成熟的影响，那么是否AOAA能够抑制MaGAD1表达应该得到证实。所以，笔者们测定了在正常成熟及AOAA处理下香蕉果实MaGAD1基因的表达水平。结果表明，与正常成熟相比，AOAA能够显著抑制MaGAD1上调表达，同时也能抑制MaACS1上调表达（图3）。另外，在正常成熟及AOAA处理下，MaGAD1表达与MaACS1表达的趋势一致，并且都在采后第8天显著上调，与香蕉果实生理跃变发生的时间一致（图2、3）。综上，本研究的结论是，AOAA通过抑制MaGAD1和MaACS1上调表达和延缓香蕉果实生理跃变，推迟香蕉果实采后成熟。
参考文献
[1] Giovannoni J J. Genetic regulation of fruit development and ripening[J]. The Plant Cell， 2004， 16（suppl 1）： S170-S180.
[2] 莫磊兴， 邹 瑜， 李小泉， 等. 香蕉的采后生理与保鲜技术[J]. 广西农业科学， 1998， 5： 266-268.
[3] Bown A W， Shelp B J. The metabolism and functions of [gamma]-aminobutyric acid[J]. Plant Physiology， 1997， 115（1）： 1-5.
[4] Gallego P P， Whotton L， Picton S， et al. A role for glutamate decarboxylase during tomato ripening： the characterisation of a cDNA encoding a putative glutamate decarboxylase with a calmodulin-binding site[J]. Plant Molecular Biology， 1995， 27（6）： 1 143-1 151.
[5] Trobacher C P， Zarei A， Liu J， et al. Calmodulin-dependent and calmodulin-independent glutamate decarboxylases in apple fruit[J]. BMC Plant Biology， 2013， 13： 144.
[6] Cercós M， Soler G， Iglesias D J， et al. Global analysis of gene expression during development and ripening of Citrus fruit flesh. A proposed mechanism for citric acid utilization[J]. Plant Molecular Biology， 2006， 62（4-5）： 513-527.
[7] Akihiro T， Koike S， Tani R， et al. Biochemical mechanism on GABA accumulation during fruit development in tomato[J]. Plant Cell Physiology， 2008， 49（9）： 1 378-1 389.
[8] Liu X， Hu X M， Jin L F， et al. Identification and transcript analysis of two glutamate decarboxylase genes， CsGAD1 and CsGAD2， reveal the strong relationship between CsGAD1 and citrate utilization in citrus fruit[J]. Molecular Biology Reports， 2014， 41（9）： 6 253-6 262.
[9] Golan H， Grossman Y. Block of glutamate decarboxylase decreases GABAergic inhibition at the crayfish synapses： possible role of presynaptic metabotropic mechanisms[J]. Journal of Neurophysiology， 1996， 75（5）： 2 089-2 098.
[10] Sonnewald U， Kortner T M， Qu H， et al. Demonstration of extensive GABA synthesis in the small population of GAD positive neurons in cerebellar cultures by the use of pharmacological tools[J]. Neurochemistry International， 2006， 48（6）： 572-578.
[11] Sawaki K， Ouchi K， Sato T， et al. Existence of gamma-aminobutyric acid and its biosynthetic and metabolic enzymes in rat salivary glands[J]. Japanese Journal of Pharmacology， 1995， 67（4）： 359-363. [12] Borelli K G， Ferreira-Netto C， Brandǎo M L. Distribution of Fos immunoreactivity in the rat brain after freezing or escape elicited by inhibition of glutamic acid decarboxylase or antagonism of GABA-A receptors in the inferior colliculus[J]. Behavioural Brain Research， 2006， 170（1）： 84-93.
[13] Bulantseva E A， Thang N T， Ruzhitskii A O， et al. The effect of ethylene biosynthesis regulators on metabolic processes in the banana fruits in various physiological states[J]. Applied Biochemistry and Microbiology， 2009， 45（1）： 104-108.
[14] Huang X L， Li X J， Li Y， et al. The effect of AOA on ethylene and polyamine metabolism during early phases of somatic embryogenesis in Medicago sativa[J]. Physiologia Plantarum， 2001， 113（3）： 424-429.
[15] Xu B Y， Su W， Liu J H， et al. Differentially expressed cDNAs at the early stage of banana ripening identified by suppression subtractive hybridization and cDNA microarray[J]. Planta， 2007， 226（2）： 529-539.
[16] Jin Z Q， Xu B Y， Liu J H， et al. Identification of genes differentially expressed at the onset of the ethylene climacteric in banana[J]. Postharvest Biology and Technology， 2009， 52（3）： 307-309.
[17] 胡 伟， 杨晓颖， 李美英，等. 香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达[J]. 西北植物学报， 2009， 29（3）： 429-434.
[18] Pua E C， Chandramouli S， Han P， et al. Malate synthase gene expression during fruit ripening of Cavendish banana（Musa acuminata cv. Williams）[J]. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（381）： 309-316.
[19] 王学奎. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京：高等教育出版社，2005， 204-206.
[20] 徐昌杰， 陈文峻， 陈昆松， 等. 淀粉含量测定的一种简便方法-碘显色法[J]. 生物技术， 1998， 8（2）： 41-43.
[21] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method[J]. Method， 2001， 25（4）： 402-408.
[22] Lohani S， Trivedi P K， Nath P. Changes in activities of cell wall hydrolases during ethylene-induced ripening in banana： effect of 1-MCP， ABA and IAA[J]. Postharvest Biology and Technology， 2004， 31（2）： 119-126.
[23] Hill S A， ap Rees T. The effect of glucose on the control of carbohydrate metabolism in ripening bananas[J]. Planta， 1995a， 196（2）： 335-343.
[24] Hill S A， ap Rees T. The effect of hypoxia on the control of carbohydrate metabolism in ripening bananas[J]. Planta， 1995b， 197（2）： 313-323.
[25] Liu X， Shiomi S， Nakatsuka A， et al. Characterization of ethylene biosynthesis associated with ripening in banana fruit[J]. Plant Physiology， 1999， 121（4）： 1 257-1 265.
[26] Huang F C， Do Y Y， Huang P L. Genomic organization of a diverse ACC synthase gene family in banana and expression characteristics of the gene member involved in ripening of banana fruits[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2006， 54（11）： 3 859-3 868.