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【摘要】目的:探讨CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的昼夜节律性变化情况。方法:10名健康男性志愿者,年龄24～30岁,平均25岁。预先在昼夜节律模式条件(16h-light:8h-dark cycle,LD)下生活1周:室温25±1ºC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:00～6:00;睡眠时光照强度<0.1 Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,日常活动和饮食成分基本一致。随后在一昼夜内每隔4h抽取各受试者外周血3ml,用流式细胞仪测定CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞占CD4+T细胞的百分比,通过余弦法和Clock Lab软件获取节律参数,并经振幅检验分析是否存在昼夜节律。结果:在自然光制下,CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的相对数量均呈现昼高夜低的节律性振荡(P<0.05),但各细胞相对数量变化的峰谷时点略有不同。结论:人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞的变化均存在着昼夜节律性特征。
【关键词】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;昼夜节律;T细胞
【中图分类号】R331.1+44【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-074-2
昼夜节律生物钟是一种普遍的生物活动现象。哺乳类动物的生物钟已被定位于下丘脑前部的视交叉上核(suprachias
-matic nucleus,SCN)和松果体[1]。近年的研究发现,免疫系统的组成和功能,如免疫细胞数量、免疫球蛋白的浓度、免疫应答和免疫调节等都存在昼夜节律性变化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞是一类已活化的免疫细胞,在免疫应答中起着重要的作用[3]。对于这些活化的T淋巴细胞的昼夜节律性的表达,到目前为止,研究报道并不多。本实验在模拟自然光制条件下,测定不同昼夜时点外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞表达的变化,以确定其是否存在昼夜节律特征。
1材料和方法
1.1研究对象与造模
10名健康男性志愿者,年龄24～30岁,平均25岁;既往身体健康,无感染性和自身免疫性疾病,在过去6个月内未做过跨时区旅行和未接受过药物治疗。预先在实验室昼夜节律模式条件(自然光制,16h-light:8h-darkcycle,LD)下生活1周:室温25±1ºC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:00～6:00;睡眠时光照强度<0.1Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,日常活动和饮食成分基本一致。
1.2样品采样
将外界自然光照起点时间设定为昼夜0时点(自然时间凌晨5时),把24h自然时点转换成昼夜时点(zeitgeber time,ZT)。受试者在实验室生活1周后,在一昼夜内每隔4h按不同昼夜时点(ZT02、06、10、14、18、22,n=6)分别采集其外周静脉血,每份取样3ml,每组(每个时点)n=10,肝素抗凝后立即于流式细胞仪检测三种细胞的百分比。
1.3仪器与试剂
Epics XL•MCL流式细胞分析仪,美国Beckman Coulter公司;CD4单克隆抗体(FITC标记),CD25单克隆抗体(PE标记),CD69单克隆抗体(PC5标记),HLA-DR单克隆抗体(PE标记),美国Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde),美国Beckman Coulter公司;PBS缓冲液,自制。
1.4流式细胞分析
取两根试管,一管加CD4单克隆抗体10μl、CD69单克隆抗体4μl和CD25单克隆抗体10μl到小试管底部,第二管加CD4、HLA-DR单克隆抗体各10μl到小试管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小试管中,避免悬液沾到试管壁。充分混匀,室温下避光放置15min。加入2501μl溶血素,振荡混匀后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS缓冲液振荡混匀后置37℃水浴15min。加入1mlPBS缓冲液振荡混匀后1800r/min离心5min,弃上清液,用滤纸吸干管壁,加入250μlPBS缓冲液,振荡混匀备用。流式细胞仪进行光路质量调控和双色荧光补偿,以前向角FSLIN与侧向角SSLIN取淋巴细胞设门,用流式细胞仪分析50000个细胞应用配套分析软件获取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR双阳性细胞占淋巴细胞的百分比。每批测定时,以空白管调整零点。
1.5数据处理
用余弦分析软件和Clock Lab软件获取昼夜节律性参数,并经振幅F检验确定靶细胞昼夜节律性表达的变化。用于拟合的余弦函数方程为:F(t)=M+Acos(ωt+Φ),其中M(mesor)为中值,即涨落变化的中线;A(amplitude)为节律振荡的振幅,表示向上或向下波动的幅度;Φ(peak phase or acrophase)为峰值相位,是振荡达到峰值的时刻,可根据ω角速度(360°/24h)将其换算成各ZT时点。数据采用mean±SD表示,组内差异用SPSS17.0 for Windows统计软件包进行t检验;组间差异用相同软件包进行方差分析(ANOVA),P<0.05为差异具有显著性。
2结果
在LD(16:8)光制下的不同昼夜时点,以CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞百分比作为相对数量变化水平,各细胞的昼夜节律性变化反映于表1;对各昼夜时点变化的数据进行余弦函数分析,发现这三种细胞均具有明显的昼夜节律性变化(振幅F检验,P<0.05)。
表1 在 LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T细胞各昼夜时点表达的变化
LD(16:8)光制下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞变化的昼夜节律性参数反映于表2,CD4+CD25+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT19和ZT7,CD4+CD69+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1,CD4+HLA-DR+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1。
表2 在LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞表达的昼夜节律参数
LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图1。CD4+CD69+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图2。CD4+HLA-DR+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图3。
图1CD4+CD25+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
图2CD4+CD69+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
图3CD4+HLA-DR+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
3讨论
人们很早以来就知道生物体的活动具有节律性,这是生物体为了更好适应环境要求而发生的反应。其中昼夜节律是最为重要的一种生物节律。近年来时间免疫学[4]的研究表明,动物和人的免疫系统也具有多种显性节律。目前,研究人员对免疫系统的节律性研究较多的是针对免疫器官、免疫细胞和免疫分子的数量和功能。CD25、CD69和HLA-DR是免疫细胞活化时特有的表达分子。活化的淋巴细胞才是淋巴系统的功能细胞,因此,本研究着重从活化的T细胞的节律性变化着手研究,以探讨这些活化的T细胞是否同样具有昼夜节律性的变化。
本实验中对LD(16:8)光制(即自然光制)条件下,正常成人6个不同昼夜时点采集的外周血標本进行研究,发现自然光制条件下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞存在着昼夜节律性变化,三种细胞变化的节律振幅、中值和峰值相的水平并不相同,而其节律相位也略有不同。CD4+CD25+T淋巴细胞峰值时间点位于昼夜时点的ZT19,谷值时间点位于ZT7。CD4+CD69+T淋巴细胞和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞峰值时间点均位于昼夜时点的ZT13,谷值时间点均位于ZT1。三种细胞中后两者峰值时间点均早于前者,这可能是由于三种活化分子(CD25,CD69,HLA-DR)在T淋巴细胞活化时表达的早晚差异造成。
由于外周血淋巴细胞的数量本身存在着节律性的变化[5],因此本实验对三种细胞的相对数量进行了研究,避免了因淋巴细胞数量的变化而引起三种细胞绝对数量的改变。虽然研究人员很早就知道中枢核心昼夜节律调控组织主要定位于下丘脑前部的视交叉上核、松果体和视网膜。它通过神经内分泌网络调控着人体的昼夜节律变化,但随着对免疫系统昼夜节律研究的深入,我们已经知道,免疫细胞中也存在着一些昼夜节律相关的基因,而且这些基因本身存在着节律性的变化,那么本实验研究的结果到底是中枢核心昼夜节律调控组织发挥作用还是免疫系统中这些节律性基因在发挥调控作用却有待于进一步的探讨。
参考文献
[1] Stehle JH,Von Gall C,Korf HW. Melatonin:a clock–output,a clock–input[J]. J Neuroendocrin,2003,15(4):383-389.
[2] 童建.免疫系统的生物节律[J].国外医学免疫学分册,1999,22(1):30-33.
[3] Rea IM,Mcnerlan SE,Alexander HD. CD69,CD25 and HLA-DR activation antigen expression on CD3+ lymphocvtes and relationship to serum IFN-alpha,IFN-gamma and SIL-2R levels in aging. Exp Geronto,l999,34:79-93.
[4] Fernandes G,Biological rhythm in clinical and laboratory medicine. springer-Verlang,1992,493.
[5] Smaaland R,Sothern RB,Laerum OD,Abrahamsen JF. Rhythms in human bone marrow and blood cells. Chronobiol Int. 2002 Jan,19(1):101-27.
【关键词】CD4;CD25;CD69;HLA-DR;昼夜节律;T细胞
【中图分类号】R331.1+44【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)16-074-2
昼夜节律生物钟是一种普遍的生物活动现象。哺乳类动物的生物钟已被定位于下丘脑前部的视交叉上核(suprachias
-matic nucleus,SCN)和松果体[1]。近年的研究发现,免疫系统的组成和功能,如免疫细胞数量、免疫球蛋白的浓度、免疫应答和免疫调节等都存在昼夜节律性变化[2]。CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞是一类已活化的免疫细胞,在免疫应答中起着重要的作用[3]。对于这些活化的T淋巴细胞的昼夜节律性的表达,到目前为止,研究报道并不多。本实验在模拟自然光制条件下,测定不同昼夜时点外周血中CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞表达的变化,以确定其是否存在昼夜节律特征。
1材料和方法
1.1研究对象与造模
10名健康男性志愿者,年龄24～30岁,平均25岁;既往身体健康,无感染性和自身免疫性疾病,在过去6个月内未做过跨时区旅行和未接受过药物治疗。预先在实验室昼夜节律模式条件(自然光制,16h-light:8h-darkcycle,LD)下生活1周:室温25±1ºC,起床时间:7:00,睡眠时间(无光照期):23:00～7:00,早餐时间:7:30～8:00,午餐时间:11:30～12:00,晚餐时间:5:00～6:00;睡眠时光照强度<0.1Lux;受试者自由饮水,无烟酒嗜好,日常活动和饮食成分基本一致。
1.2样品采样
将外界自然光照起点时间设定为昼夜0时点(自然时间凌晨5时),把24h自然时点转换成昼夜时点(zeitgeber time,ZT)。受试者在实验室生活1周后,在一昼夜内每隔4h按不同昼夜时点(ZT02、06、10、14、18、22,n=6)分别采集其外周静脉血,每份取样3ml,每组(每个时点)n=10,肝素抗凝后立即于流式细胞仪检测三种细胞的百分比。
1.3仪器与试剂
Epics XL•MCL流式细胞分析仪,美国Beckman Coulter公司;CD4单克隆抗体(FITC标记),CD25单克隆抗体(PE标记),CD69单克隆抗体(PC5标记),HLA-DR单克隆抗体(PE标记),美国Beckman Coulter公司;溶血素(1.5% Formaldehyde),美国Beckman Coulter公司;PBS缓冲液,自制。
1.4流式细胞分析
取两根试管,一管加CD4单克隆抗体10μl、CD69单克隆抗体4μl和CD25单克隆抗体10μl到小试管底部,第二管加CD4、HLA-DR单克隆抗体各10μl到小试管底部(不要沾壁)。各吸取50μl肝素抗凝的外周血到小试管中,避免悬液沾到试管壁。充分混匀,室温下避光放置15min。加入2501μl溶血素,振荡混匀后置37℃水浴15min。加入2501μlPBS缓冲液振荡混匀后置37℃水浴15min。加入1mlPBS缓冲液振荡混匀后1800r/min离心5min,弃上清液,用滤纸吸干管壁,加入250μlPBS缓冲液,振荡混匀备用。流式细胞仪进行光路质量调控和双色荧光补偿,以前向角FSLIN与侧向角SSLIN取淋巴细胞设门,用流式细胞仪分析50000个细胞应用配套分析软件获取CD4/CD25、CD4/CD69、CD4/HLA-DR双阳性细胞占淋巴细胞的百分比。每批测定时,以空白管调整零点。
1.5数据处理
用余弦分析软件和Clock Lab软件获取昼夜节律性参数,并经振幅F检验确定靶细胞昼夜节律性表达的变化。用于拟合的余弦函数方程为:F(t)=M+Acos(ωt+Φ),其中M(mesor)为中值,即涨落变化的中线;A(amplitude)为节律振荡的振幅,表示向上或向下波动的幅度;Φ(peak phase or acrophase)为峰值相位,是振荡达到峰值的时刻,可根据ω角速度(360°/24h)将其换算成各ZT时点。数据采用mean±SD表示,组内差异用SPSS17.0 for Windows统计软件包进行t检验;组间差异用相同软件包进行方差分析(ANOVA),P<0.05为差异具有显著性。
2结果
在LD(16:8)光制下的不同昼夜时点,以CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞百分比作为相对数量变化水平,各细胞的昼夜节律性变化反映于表1;对各昼夜时点变化的数据进行余弦函数分析,发现这三种细胞均具有明显的昼夜节律性变化(振幅F检验,P<0.05)。
表1 在 LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T细胞各昼夜时点表达的变化
LD(16:8)光制下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞变化的昼夜节律性参数反映于表2,CD4+CD25+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT19和ZT7,CD4+CD69+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1,CD4+HLA-DR+T细胞百分比的峰值和谷值时间分别位于ZT13和ZT1。
表2 在LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+、CD4+HLA-DR+T細胞表达的昼夜节律参数
LD(16:8)光制下,人外周血CD4+CD25+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图1。CD4+CD69+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图2。CD4+HLA-DR+T淋巴细胞昼夜节律性变化的时间外观趋势和经余弦函数分析拟合后的余弦曲线呈现于图3。
图1CD4+CD25+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
图2CD4+CD69+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
图3CD4+HLA-DR+ T细胞变化的时间外观趋势图(左),经余弦函数分析拟合后的余弦曲线(右)。
3讨论
人们很早以来就知道生物体的活动具有节律性,这是生物体为了更好适应环境要求而发生的反应。其中昼夜节律是最为重要的一种生物节律。近年来时间免疫学[4]的研究表明,动物和人的免疫系统也具有多种显性节律。目前,研究人员对免疫系统的节律性研究较多的是针对免疫器官、免疫细胞和免疫分子的数量和功能。CD25、CD69和HLA-DR是免疫细胞活化时特有的表达分子。活化的淋巴细胞才是淋巴系统的功能细胞,因此,本研究着重从活化的T细胞的节律性变化着手研究,以探讨这些活化的T细胞是否同样具有昼夜节律性的变化。
本实验中对LD(16:8)光制(即自然光制)条件下,正常成人6个不同昼夜时点采集的外周血標本进行研究,发现自然光制条件下人外周血CD4+CD25+、CD4+CD69+和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞存在着昼夜节律性变化,三种细胞变化的节律振幅、中值和峰值相的水平并不相同,而其节律相位也略有不同。CD4+CD25+T淋巴细胞峰值时间点位于昼夜时点的ZT19,谷值时间点位于ZT7。CD4+CD69+T淋巴细胞和CD4+HLA-DR+T淋巴细胞峰值时间点均位于昼夜时点的ZT13,谷值时间点均位于ZT1。三种细胞中后两者峰值时间点均早于前者,这可能是由于三种活化分子(CD25,CD69,HLA-DR)在T淋巴细胞活化时表达的早晚差异造成。
由于外周血淋巴细胞的数量本身存在着节律性的变化[5],因此本实验对三种细胞的相对数量进行了研究,避免了因淋巴细胞数量的变化而引起三种细胞绝对数量的改变。虽然研究人员很早就知道中枢核心昼夜节律调控组织主要定位于下丘脑前部的视交叉上核、松果体和视网膜。它通过神经内分泌网络调控着人体的昼夜节律变化,但随着对免疫系统昼夜节律研究的深入,我们已经知道,免疫细胞中也存在着一些昼夜节律相关的基因,而且这些基因本身存在着节律性的变化,那么本实验研究的结果到底是中枢核心昼夜节律调控组织发挥作用还是免疫系统中这些节律性基因在发挥调控作用却有待于进一步的探讨。
参考文献
[1] Stehle JH,Von Gall C,Korf HW. Melatonin:a clock–output,a clock–input[J]. J Neuroendocrin,2003,15(4):383-389.
[2] 童建.免疫系统的生物节律[J].国外医学免疫学分册,1999,22(1):30-33.
[3] Rea IM,Mcnerlan SE,Alexander HD. CD69,CD25 and HLA-DR activation antigen expression on CD3+ lymphocvtes and relationship to serum IFN-alpha,IFN-gamma and SIL-2R levels in aging. Exp Geronto,l999,34:79-93.
[4] Fernandes G,Biological rhythm in clinical and laboratory medicine. springer-Verlang,1992,493.
[5] Smaaland R,Sothern RB,Laerum OD,Abrahamsen JF. Rhythms in human bone marrow and blood cells. Chronobiol Int. 2002 Jan,19(1):101-27.