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摘要 [目的]开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究。[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列，筛选设计了一对能够准确鉴定锈红果实蝇的种特异性引物XF29和XR29 选用锈红果实蝇作为阳性对照，颜带实蝇B.cilifer （Hendel）、瘤胫实蝇B.tuberculata （Bezzi）等19种实蝇作为阴性对照，进行PCR扩增和电泳检测。[结果]仅阳性种锈红果实蝇在约265 bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带，其余实蝇均未出现任何条带。[结论]采用SS-PCR技术，基于mtDNA COⅠ基因序列筛选设计的特异引物种特异性和稳定性强，可为进出境果蔬检疫、疫情早期预警和有效监测防治提供快速鉴定的依据。
关键词 锈红果实蝇;SS-PCR技术; COⅠ基因;种特异性引物;分子鉴定
中图分类号 S 433 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）21-0164-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.040
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Rapid Identification of Bactrocera rubigina by Species-specific Primers （SS-COI）
HUANG Zhen GUO Qiong-xia3，HOU You-ming1
（1.College of Plant Protection，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002;2.Fuzhou Changle Airport Customs，Fuzhou，Fujian 350209;3.Fuzhou Customs Technology Center，Fuzhou，Fujian 350001）
Abstract
[Objective]To study the rapid identification technology of Bactrocera rubigina.[Method]Based on mtDNA COⅠ gene sequence， a pair of species-specific primers XF29 and XR293 were screened and designed， which could accurately identify Bactrocera rubigina.Bactrocera rubigina was selected as positive control， and 19 fruit flies such as B. cilifer and B. tuberculata were selected as negative control for PCR amplification and electrophoresis detection.[Result]Only the positive fruit fly rust red fruit fly amplified a clear and single band at about 265 bp， and none of the other fruit flies showed any band.[Conclusion]Using SS-PCR technology， the specific primers designed based on mtDNA COⅠ gene sequence screening have strong species specificity and stability， which can provide rapid identification basis for entry and exit fruit and vegetable quarantine， early warning of epidemic situation and effective monitoring and control.
Key words Bactrocera rubigina;SS-PCR;COI;Species specific primers;Molecular identification
基金項目 福建省自然科学基金项目 （2011J01066，2012JO1061）。
作者简介 黄振（1985—），男，福建莆田人，农艺师，博士，从事农业昆虫与害虫防治研究。*通信作者：郭琼霞，研究员，从事杂草分类和植物检疫研究;侯有明，研究员，博士，从事昆虫生态研究。
收稿日期 2021-03-14
锈红果实蝇（Bactrocera rubigina （Wang & Zhao））是一种重要的检疫性害虫，属双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae）果实蝇属（Bactrocera）。我国于1999年在深圳罗湖口岸首次被截获[1]，目前主要分布在老挝[2]、不丹[3]、越南[4]、孟加拉[5]以及中国的海南[6-7]、广东[6]、广西[6，8]、云南[9]等地。锈红果实蝇是具有重要经济意义的果蔬害虫，寄主多，危害大，主要危害辣椒、轮叶木姜子[10]等果蔬。其幼虫在果内取食危害，且随寄主果实或包装物等进行远距离传播，而传统单靠成虫鉴定实蝇的方法，难以适应现有口岸高通量、快进快出的检疫鉴定需求，故此开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究，对适应和提升口岸对实蝇的快速鉴定具有现实的重要意义，也是快速通关、早期预警和防止传入传播的基本要求和重要手段。 随着现代分子生物学技术的发展，采用分子鉴定昆虫种类的方法可以解决不受虫态限制的种类鉴定问题[11-12]。mtDNA COI——线粒体细胞色素 c氧化酶亚基 I基因序列结构相对保守，而种间的变异较大，序列的差异程度可以将特定种类区分开，所以线粒体基因序列被应用于实蝇近缘种系统发育研究也越来越多[13-14]。笔者应用mtDNA COI基因序列，筛选设计种特异性引物、快速鉴定锈红果实蝇的方法，为解决口岸进境果蔬检疫截获的、疫情调查监测中发现的疑似锈红果实蝇不同虫态的鉴定提供依据[15]。
1 材料与方法
1.1 供试虫源 供试实蝇种类有锈红果实蝇B.rubigina （Wang & Zhao）、桔小实蝇B.dorsalis （Hendel）、番石榴实蝇B.correcta （Bezzi）、杨桃实蝇B.carambolae Drew & Hancock、辣椒实蝇B.latifrons （Hendel）、瓜实蝇B.cucurbitae （Coquillett）、南瓜实蝇B.tau （Walker）、颜带实蝇B.cilifer （Hendel）、瘤胫实蝇B.tuberculata （Bezzi）、瑞丽果实蝇B.ruiliensis Wang，Long et Zhang，sp.nov.、滇寡鬃实蝇B.modica （Hardy）、黑膝实蝇B.scutellaris （Bezzi）、近黑颜实蝇B.parater （Zhao & Lin）、黑颜实蝇B.diaphora Coquillett、具条实蝇B.scutellata （Hendel）、腿端黑实蝇B.atrifemur Drew & Hancock、枣实蝇Carpomya vesuviana Costa、何氏华实蝇B.hochii （Zia）、五指山实蝇B.wuzhishana Lin et Yang，sp.nov、瓜棍腹实蝇Dacus longicornis Wiedemann 20种实蝇。虫样来自口岸进境果蔬检疫截获、中国边境监测调查的检疫性实蝇种类。其中包括Bactrocera、Carpomya、Dacus 3个实蝇属Bactrocera、Zeugodacus、Sinodacus、Asiadacus 4个果实蝇亚属。用于分子生物学鉴定试验的实蝇标本，采用乙醇浸泡并放置冰箱保存。
1.2 DNA的提取和DNA质量检测
1.2.1 DNA的提取。
选用OMEGA E.Z.N.A.TM Insect DNA Kit试剂盒法，取整只实蝇或实蝇幼虫、蛹或成虫的翅膀、腿的部分组织，放置于2 mL离心管中，加入适量液氮后进行充分研磨，并按照试剂盒的操作步骤进行基因组DNA的提取。
1.2.2 DNA质量检测。
设置反应体系和反应条件，采用上游引物LCO1490 （碱基序列为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198 （碱基序列为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′） 的1對通用引物对20种供试实蝇虫样提取的基因组DNA进行质量检测，在定量梯度PCR仪上进行PCR反应，凝胶成像，查看目标片段，拍摄记录质量检测结果。
1.2.3 引物的设计。
利用通用引物LCO1490 和HCO2198对提取的锈红果实蝇的DNA进行扩增并测序，测序由上海英潍捷基贸易有限公司进行，扩增锈红果实蝇的核酸序列：
5′-TTTTATTTTCGGAGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTC-
GCTTAGAATTTTAGTTCGAGCTGAACTAGGACACCCTGGAG-
CACTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTAACTGTAACA-
GCTCATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATCA-
TAATTGGTGGATTCGGAAATTGACTTGTTCCCCTAATATTAG-
GGGCCCCCGACATAGCATTTCCACGAATAAATAATATAAGA-
TTTTGACTATTGCCTCCTTCTCTCACGCTTCTATTAGTAAGAA-
GTCTAGTAGAAAATGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTAT-
CCTCCGCTATCATCTGTTATTGCTCACGGAGGAGCTTCAGT-
TGACCTAGCAATTTTCTCTCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTC-
AATTTTAGGAGCGGTTAATTTTATTACAACAGTAATTAATAT-
ACGATCAACAGGAATTTCATTCGATCGAATACCTTTATTCGT-
TTGAGCAGTTGTATTAACAGCTCTTTTACTTTTATTATCATTA-
CCAGTTTTAGCAGGAGCTATTACTATATTATTAACAGATCGA-
AACTTAAACACTTCCTTTTTTGACCCTG-3′。
通过数据库（NCBI）查找锈红果实蝇在NCBI数据库已登录公布的序列，并进行比较分析，下载选定登录号KF659744的FASTA格式，利用Primer-Premier 5.0人工设计引物和利用Oligo 6.44对引物进行比较分析和评价，再利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列，筛选目标实蝇的种特异性引物。
1.2.4 引物的种特异性测试。
选用锈红果实蝇为阳性对照，其余19种实蝇为阴性对照，验证试验所设计引物的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1.0 μL，取DNA模板各2.0 μL，加ddH2O至总体积25.0 μL;反应条件为94 ℃/5 min，94 ℃/40 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min，30个循环，最后延伸7 min;分别提取5 μL PCR产物在含DNA染色剂的1.5%琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30 min（120 V），利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。 1.2.5 引物的灵敏度测试。采用核酸蛋白分析仪测试提取的锈红果实蝇DNA模板的浓度。将锈红果实蝇DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀釋，然后使用种特异性引物XF29和XR293进行PCR扩增，来验证该检测方法的灵敏度。
1.2.6 应用与验证。
利用口岸截获和我国边境监测的锈红果实蝇（已饲养到成虫并经过形态鉴定）的卵、幼虫、蛹和成虫的部分组织提取的DNA为模板，使用种特异性引物XF29和XR293进行PCR扩增，采用SS-PCR快速鉴定锈红果实蝇的方法来进行检测试验，应用与验证该方法的稳定性与准确性。
2 结果与分析
2.1 DNA 质量检测结果
利用通用引物LCO1490和HC02198对提取的20种实蝇DNA模板进行PCR扩增，结果表明，该20种实蝇DNA均能扩增出一条单一且清晰长度约700 bp的目标条带（图1）。
2.2 引物的选择
通过筛选最终选择的种特异性引物XF29和XR29 引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，引物XF29序列为5′-GTAGGAACTTCGCTTAGAATTTTAG-3′;XR293 序列为 5′-GACTTCTTACTAATAGAAGCGTGA-3′。
2.3 引物的种特异性
通过引物的种特异性测试，结果显示仅锈红果实蝇约在265 bp扩增出有一条清晰且单一的条带，其他试蝇种类均未出现任何条带。该引物的种特异性试验重复3次，结果均一致，表明该试验筛选设计的种特异性引物XF29和XR293鉴定锈红果实蝇具有较强的特异性及稳定性（图2）。
将试验所得到的PCR产物送到英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，将所得到的序列提交NCBI数据库进行BLAST，结果表明该段序列与数据库中的锈红果实蝇序列具100%的一致性。
2.4 引物的灵敏度
采用核酸蛋白分析仪测试提取的锈红果实蝇DNA模板的浓度为9.419 ng/μL。通过取3种不同浓度的DNA模板进行测定，结果表明，随着DNA模板浓度的降低，扩增出的条带逐渐减弱，在浓度稀释至10-2倍后仍可见明显的条带，说明引物XF29和XR293具有较高的灵敏度（图3）。
2.5 应用与验证
通过对19种锈红果实蝇卵、幼虫、蛹和成虫的部分组织虫样的DNA模板进行种特异性测试验证，均显示出目标条带，结果表明分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果一致，该方法具有较好的稳定性，可以应用于锈红果实蝇的实际鉴定工作（图4）。
3 结论与讨论
实蝇科昆虫的种类多，分布广，危害大[16]，部分种属对果蔬生产具有重要的经济意义，尤其是在果蔬的进出境贸易中，疫情复杂，截获实蝇的种类多，且均为不同虫态的卵、幼虫和蛹，由于实蝇科的卵、幼虫和蛹形态极其相似，难以鉴别，若饲养到成虫后，根据成虫的形态特征进行分类鉴定，周期长，饲养条件受限，费时耗力，难以满足进口果蔬的快速通关和果蔬的早期预警，所以获得更多实蝇科昆虫物种的线粒体基因组序列，开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究，显得极为迫切。
该研究基于 mtDNA COI基因序列，并结合 NCBI中已公开的部分实蝇的 COI基因序列设计种特异性引物，以20种具有重要经济意义的实蝇作对照，测试并建立了锈红果实蝇的种特异性引物快速鉴定方法，以满足口岸进出境高通量、及时、快速、准确检疫鉴定实蝇物种的需求[17-18]。该方法也为有效防止锈红果实蝇的入侵和局部发生以及物种的进一步传播扩散、保护果蔬的农业生产安全、维护国家对外贸易信誉等提供了技术支撑[19]。
该试验所建立的SS-PCR快速鉴定锈红果实蝇的方法，可以在8 h之内完成锈红果实蝇的物种鉴定，该方法具有快速简便、可操作性强、特异性和灵敏度高等优点，能够满足口岸快速通关、早期预警等检疫的要求。
参考文献
[1]
王伍，麦梅妹，何天亮，等.罗湖口岸在旅检中截获锈红果实蝇[J].植物检疫，1999，13（5）：280.
[2] 邓裕亮，李志红，白永华，等.老挝中北部地区果实蝇属 （Bactuocera）害虫种类初步调查[J].植物检疫，2010，24（1）：52-53.
[3] DREW R A I，ROMIG M C，DORJI C.Records of Dacine fruit flies and new species of Dacus （Diptera： Tephritidae） in Bhutan[J].The raffles bulletin of zoology，2007，55（1）：1-21.
[4] THUY N N，DUC H T，VU N H.Preliminary results on a fruit fly investigation in the South of Vietnam[R].Preface 11 Opening Address 1 2000：153-157.
[5] LEBLANC L，HOSSAIN M A，KHAN S A，et al.Additions to the fruit fly fauna （Diptera： Tephritidae： Dacinae） of Bangladesh，with a key to the species[J].Proceedings of the Hawaiian entomological society，2014，46： 31-40.
[6] LIANG G Q，HANCOCK D L，XU W，et al.Notes on the Dacinae of southern China （Diptera： Tephritidae）[J].Australian journal of entomology，1993，32（2）： 137-140. [7] LIN M G，YANG Z J，WANG X J，et al.A taxonomic study of the subfamily Dacinae （Diptera： Tephritidae） from Hainan，China[J].Acta entomologica sinica，2006，49（2）： 310-314.
[8] 姚衛民.河池市瓜、果实蝇监测情况初报[J].广西植保，2006，19（1）： 9-11.
[9] 陈旭，刘晓飞，叶辉.云南主要有害实蝇种类及区划[J].生态学报，2010，30（3）： 717-725.
[10] 梁广勤，杨国海，梁帆，等.亚太地区寡毛实蝇[M].广州：广东科技出版社，1996：1-479.
[11] 陈韶萍，黄振，郭琼霞，等.实蝇类害虫分子鉴定研究进展[J].生物安全学报，201 23（3）：151-155.
[12] 黄可辉，郭琼霞，虞赟，等.分子标记法在昆虫学研究中的应用[J].华东昆虫学报，2005，14（2）： 109-114.
[13] JAMNONGLUK W，BAIMAI V，KITTAYAPONG P.Molecular evolution of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica，2003，119：19-25.
[14] JAMNONGLUK W，BAIMAI V，KITTAYAPONG P.Molecular phylogeny of tephritid fruit flies in the Bactrocera tau complex using the mitochondrial COI sequences[J].Genome，2003，46（1）：112-118.
[15] 黄振，陈韶萍，谢婧，等.应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇[J].昆虫学报，2015，58（4）：460-466.
[16] 黄振，郭琼霞，陈韶萍.基于mt DNA Co I设计种特异性引物快速鉴定具条实蝇[J].福建林业科技，2020，47（2）：20-25.
[17] 黄振，郭琼霞，陈韶萍.应用SS-PCR 技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇[J].安徽农业科学，2020，48（6）：83-86，96.
[18] 黄振.果实蝇属重要种的鉴定、人工饲料筛选、适生性预测和风险分析[D].海口：海南大学，2010.
[19] 殷玉生，张帆，安榆林.基于线粒体 COI基因鉴定大小蠹属昆虫[J].福建林业科技，2014，41（1）：63-67，120.
关键词 锈红果实蝇;SS-PCR技术; COⅠ基因;种特异性引物;分子鉴定
中图分类号 S 433 文献标识码 A
文章编号 0517-6611（2021）21-0164-03
doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.21.040
开放科学（资源服务）标识码（OSID）：
Rapid Identification of Bactrocera rubigina by Species-specific Primers （SS-COI）
HUANG Zhen GUO Qiong-xia3，HOU You-ming1
（1.College of Plant Protection，Fujian Agriculture and Forestry University，Fuzhou，Fujian 350002;2.Fuzhou Changle Airport Customs，Fuzhou，Fujian 350209;3.Fuzhou Customs Technology Center，Fuzhou，Fujian 350001）
Abstract
[Objective]To study the rapid identification technology of Bactrocera rubigina.[Method]Based on mtDNA COⅠ gene sequence， a pair of species-specific primers XF29 and XR293 were screened and designed， which could accurately identify Bactrocera rubigina.Bactrocera rubigina was selected as positive control， and 19 fruit flies such as B. cilifer and B. tuberculata were selected as negative control for PCR amplification and electrophoresis detection.[Result]Only the positive fruit fly rust red fruit fly amplified a clear and single band at about 265 bp， and none of the other fruit flies showed any band.[Conclusion]Using SS-PCR technology， the specific primers designed based on mtDNA COⅠ gene sequence screening have strong species specificity and stability， which can provide rapid identification basis for entry and exit fruit and vegetable quarantine， early warning of epidemic situation and effective monitoring and control.
Key words Bactrocera rubigina;SS-PCR;COI;Species specific primers;Molecular identification
基金項目 福建省自然科学基金项目 （2011J01066，2012JO1061）。
作者简介 黄振（1985—），男，福建莆田人，农艺师，博士，从事农业昆虫与害虫防治研究。*通信作者：郭琼霞，研究员，从事杂草分类和植物检疫研究;侯有明，研究员，博士，从事昆虫生态研究。
收稿日期 2021-03-14
锈红果实蝇（Bactrocera rubigina （Wang & Zhao））是一种重要的检疫性害虫，属双翅目（Diptera）实蝇科（Tephritidae）果实蝇属（Bactrocera）。我国于1999年在深圳罗湖口岸首次被截获[1]，目前主要分布在老挝[2]、不丹[3]、越南[4]、孟加拉[5]以及中国的海南[6-7]、广东[6]、广西[6，8]、云南[9]等地。锈红果实蝇是具有重要经济意义的果蔬害虫，寄主多，危害大，主要危害辣椒、轮叶木姜子[10]等果蔬。其幼虫在果内取食危害，且随寄主果实或包装物等进行远距离传播，而传统单靠成虫鉴定实蝇的方法，难以适应现有口岸高通量、快进快出的检疫鉴定需求，故此开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究，对适应和提升口岸对实蝇的快速鉴定具有现实的重要意义，也是快速通关、早期预警和防止传入传播的基本要求和重要手段。 随着现代分子生物学技术的发展，采用分子鉴定昆虫种类的方法可以解决不受虫态限制的种类鉴定问题[11-12]。mtDNA COI——线粒体细胞色素 c氧化酶亚基 I基因序列结构相对保守，而种间的变异较大，序列的差异程度可以将特定种类区分开，所以线粒体基因序列被应用于实蝇近缘种系统发育研究也越来越多[13-14]。笔者应用mtDNA COI基因序列，筛选设计种特异性引物、快速鉴定锈红果实蝇的方法，为解决口岸进境果蔬检疫截获的、疫情调查监测中发现的疑似锈红果实蝇不同虫态的鉴定提供依据[15]。
1 材料与方法
1.1 供试虫源 供试实蝇种类有锈红果实蝇B.rubigina （Wang & Zhao）、桔小实蝇B.dorsalis （Hendel）、番石榴实蝇B.correcta （Bezzi）、杨桃实蝇B.carambolae Drew & Hancock、辣椒实蝇B.latifrons （Hendel）、瓜实蝇B.cucurbitae （Coquillett）、南瓜实蝇B.tau （Walker）、颜带实蝇B.cilifer （Hendel）、瘤胫实蝇B.tuberculata （Bezzi）、瑞丽果实蝇B.ruiliensis Wang，Long et Zhang，sp.nov.、滇寡鬃实蝇B.modica （Hardy）、黑膝实蝇B.scutellaris （Bezzi）、近黑颜实蝇B.parater （Zhao & Lin）、黑颜实蝇B.diaphora Coquillett、具条实蝇B.scutellata （Hendel）、腿端黑实蝇B.atrifemur Drew & Hancock、枣实蝇Carpomya vesuviana Costa、何氏华实蝇B.hochii （Zia）、五指山实蝇B.wuzhishana Lin et Yang，sp.nov、瓜棍腹实蝇Dacus longicornis Wiedemann 20种实蝇。虫样来自口岸进境果蔬检疫截获、中国边境监测调查的检疫性实蝇种类。其中包括Bactrocera、Carpomya、Dacus 3个实蝇属Bactrocera、Zeugodacus、Sinodacus、Asiadacus 4个果实蝇亚属。用于分子生物学鉴定试验的实蝇标本，采用乙醇浸泡并放置冰箱保存。
1.2 DNA的提取和DNA质量检测
1.2.1 DNA的提取。
选用OMEGA E.Z.N.A.TM Insect DNA Kit试剂盒法，取整只实蝇或实蝇幼虫、蛹或成虫的翅膀、腿的部分组织，放置于2 mL离心管中，加入适量液氮后进行充分研磨，并按照试剂盒的操作步骤进行基因组DNA的提取。
1.2.2 DNA质量检测。
设置反应体系和反应条件，采用上游引物LCO1490 （碱基序列为5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）和下游引物HCO2198 （碱基序列为5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′） 的1對通用引物对20种供试实蝇虫样提取的基因组DNA进行质量检测，在定量梯度PCR仪上进行PCR反应，凝胶成像，查看目标片段，拍摄记录质量检测结果。
1.2.3 引物的设计。
利用通用引物LCO1490 和HCO2198对提取的锈红果实蝇的DNA进行扩增并测序，测序由上海英潍捷基贸易有限公司进行，扩增锈红果实蝇的核酸序列：
5′-TTTTATTTTCGGAGCCTGAGCAGGAATAGTAGGAACTTC-
GCTTAGAATTTTAGTTCGAGCTGAACTAGGACACCCTGGAG-
CACTAATTGGAGATGATCAAATTTATAATGTAACTGTAACA-
GCTCATGCCTTTGTAATAATTTTCTTTATAGTAATACCTATCA-
TAATTGGTGGATTCGGAAATTGACTTGTTCCCCTAATATTAG-
GGGCCCCCGACATAGCATTTCCACGAATAAATAATATAAGA-
TTTTGACTATTGCCTCCTTCTCTCACGCTTCTATTAGTAAGAA-
GTCTAGTAGAAAATGGAGCTGGTACAGGTTGAACAGTTTAT-
CCTCCGCTATCATCTGTTATTGCTCACGGAGGAGCTTCAGT-
TGACCTAGCAATTTTCTCTCTTCACTTAGCAGGTATTTCCTC-
AATTTTAGGAGCGGTTAATTTTATTACAACAGTAATTAATAT-
ACGATCAACAGGAATTTCATTCGATCGAATACCTTTATTCGT-
TTGAGCAGTTGTATTAACAGCTCTTTTACTTTTATTATCATTA-
CCAGTTTTAGCAGGAGCTATTACTATATTATTAACAGATCGA-
AACTTAAACACTTCCTTTTTTGACCCTG-3′。
通过数据库（NCBI）查找锈红果实蝇在NCBI数据库已登录公布的序列，并进行比较分析，下载选定登录号KF659744的FASTA格式，利用Primer-Premier 5.0人工设计引物和利用Oligo 6.44对引物进行比较分析和评价，再利用NCBI数据库中提供的Primer-BLAST程序检查同源序列，筛选目标实蝇的种特异性引物。
1.2.4 引物的种特异性测试。
选用锈红果实蝇为阳性对照，其余19种实蝇为阴性对照，验证试验所设计引物的种特异性。SS-PCR在定量梯度PCR仪上进行，反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL，引物各1.0 μL，取DNA模板各2.0 μL，加ddH2O至总体积25.0 μL;反应条件为94 ℃/5 min，94 ℃/40 s，52 ℃/30 s，72 ℃/1 min，30个循环，最后延伸7 min;分别提取5 μL PCR产物在含DNA染色剂的1.5%琼脂糖凝胶多功能电泳仪上电泳30 min（120 V），利用凝胶成像分析仪检测是否扩增出预期大小的目标片段，拍摄并记录结果。 1.2.5 引物的灵敏度测试。采用核酸蛋白分析仪测试提取的锈红果实蝇DNA模板的浓度。将锈红果实蝇DNA模板按10-1、10-2、10-3倍梯度稀釋，然后使用种特异性引物XF29和XR293进行PCR扩增，来验证该检测方法的灵敏度。
1.2.6 应用与验证。
利用口岸截获和我国边境监测的锈红果实蝇（已饲养到成虫并经过形态鉴定）的卵、幼虫、蛹和成虫的部分组织提取的DNA为模板，使用种特异性引物XF29和XR293进行PCR扩增，采用SS-PCR快速鉴定锈红果实蝇的方法来进行检测试验，应用与验证该方法的稳定性与准确性。
2 结果与分析
2.1 DNA 质量检测结果
利用通用引物LCO1490和HC02198对提取的20种实蝇DNA模板进行PCR扩增，结果表明，该20种实蝇DNA均能扩增出一条单一且清晰长度约700 bp的目标条带（图1）。
2.2 引物的选择
通过筛选最终选择的种特异性引物XF29和XR29 引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，引物XF29序列为5′-GTAGGAACTTCGCTTAGAATTTTAG-3′;XR293 序列为 5′-GACTTCTTACTAATAGAAGCGTGA-3′。
2.3 引物的种特异性
通过引物的种特异性测试，结果显示仅锈红果实蝇约在265 bp扩增出有一条清晰且单一的条带，其他试蝇种类均未出现任何条带。该引物的种特异性试验重复3次，结果均一致，表明该试验筛选设计的种特异性引物XF29和XR293鉴定锈红果实蝇具有较强的特异性及稳定性（图2）。
将试验所得到的PCR产物送到英潍捷基（上海）贸易有限公司进行测序，将所得到的序列提交NCBI数据库进行BLAST，结果表明该段序列与数据库中的锈红果实蝇序列具100%的一致性。
2.4 引物的灵敏度
采用核酸蛋白分析仪测试提取的锈红果实蝇DNA模板的浓度为9.419 ng/μL。通过取3种不同浓度的DNA模板进行测定，结果表明，随着DNA模板浓度的降低，扩增出的条带逐渐减弱，在浓度稀释至10-2倍后仍可见明显的条带，说明引物XF29和XR293具有较高的灵敏度（图3）。
2.5 应用与验证
通过对19种锈红果实蝇卵、幼虫、蛹和成虫的部分组织虫样的DNA模板进行种特异性测试验证，均显示出目标条带，结果表明分子生物学鉴定结果与形态学鉴定结果一致，该方法具有较好的稳定性，可以应用于锈红果实蝇的实际鉴定工作（图4）。
3 结论与讨论
实蝇科昆虫的种类多，分布广，危害大[16]，部分种属对果蔬生产具有重要的经济意义，尤其是在果蔬的进出境贸易中，疫情复杂，截获实蝇的种类多，且均为不同虫态的卵、幼虫和蛹，由于实蝇科的卵、幼虫和蛹形态极其相似，难以鉴别，若饲养到成虫后，根据成虫的形态特征进行分类鉴定，周期长，饲养条件受限，费时耗力，难以满足进口果蔬的快速通关和果蔬的早期预警，所以获得更多实蝇科昆虫物种的线粒体基因组序列，开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究，显得极为迫切。
该研究基于 mtDNA COI基因序列，并结合 NCBI中已公开的部分实蝇的 COI基因序列设计种特异性引物，以20种具有重要经济意义的实蝇作对照，测试并建立了锈红果实蝇的种特异性引物快速鉴定方法，以满足口岸进出境高通量、及时、快速、准确检疫鉴定实蝇物种的需求[17-18]。该方法也为有效防止锈红果实蝇的入侵和局部发生以及物种的进一步传播扩散、保护果蔬的农业生产安全、维护国家对外贸易信誉等提供了技术支撑[19]。
该试验所建立的SS-PCR快速鉴定锈红果实蝇的方法，可以在8 h之内完成锈红果实蝇的物种鉴定，该方法具有快速简便、可操作性强、特异性和灵敏度高等优点，能够满足口岸快速通关、早期预警等检疫的要求。
参考文献
[1]
王伍，麦梅妹，何天亮，等.罗湖口岸在旅检中截获锈红果实蝇[J].植物检疫，1999，13（5）：280.
[2] 邓裕亮，李志红，白永华，等.老挝中北部地区果实蝇属 （Bactuocera）害虫种类初步调查[J].植物检疫，2010，24（1）：52-53.
[3] DREW R A I，ROMIG M C，DORJI C.Records of Dacine fruit flies and new species of Dacus （Diptera： Tephritidae） in Bhutan[J].The raffles bulletin of zoology，2007，55（1）：1-21.
[4] THUY N N，DUC H T，VU N H.Preliminary results on a fruit fly investigation in the South of Vietnam[R].Preface 11 Opening Address 1 2000：153-157.
[5] LEBLANC L，HOSSAIN M A，KHAN S A，et al.Additions to the fruit fly fauna （Diptera： Tephritidae： Dacinae） of Bangladesh，with a key to the species[J].Proceedings of the Hawaiian entomological society，2014，46： 31-40.
[6] LIANG G Q，HANCOCK D L，XU W，et al.Notes on the Dacinae of southern China （Diptera： Tephritidae）[J].Australian journal of entomology，1993，32（2）： 137-140. [7] LIN M G，YANG Z J，WANG X J，et al.A taxonomic study of the subfamily Dacinae （Diptera： Tephritidae） from Hainan，China[J].Acta entomologica sinica，2006，49（2）： 310-314.
[8] 姚衛民.河池市瓜、果实蝇监测情况初报[J].广西植保，2006，19（1）： 9-11.
[9] 陈旭，刘晓飞，叶辉.云南主要有害实蝇种类及区划[J].生态学报，2010，30（3）： 717-725.
[10] 梁广勤，杨国海，梁帆，等.亚太地区寡毛实蝇[M].广州：广东科技出版社，1996：1-479.
[11] 陈韶萍，黄振，郭琼霞，等.实蝇类害虫分子鉴定研究进展[J].生物安全学报，201 23（3）：151-155.
[12] 黄可辉，郭琼霞，虞赟，等.分子标记法在昆虫学研究中的应用[J].华东昆虫学报，2005，14（2）： 109-114.
[13] JAMNONGLUK W，BAIMAI V，KITTAYAPONG P.Molecular evolution of tephritid fruit flies in the genus Bactrocera based on the cytochrome oxidase I gene[J].Genetica，2003，119：19-25.
[14] JAMNONGLUK W，BAIMAI V，KITTAYAPONG P.Molecular phylogeny of tephritid fruit flies in the Bactrocera tau complex using the mitochondrial COI sequences[J].Genome，2003，46（1）：112-118.
[15] 黄振，陈韶萍，谢婧，等.应用种特异性PCR技术快速鉴定辣椒实蝇[J].昆虫学报，2015，58（4）：460-466.
[16] 黄振，郭琼霞，陈韶萍.基于mt DNA Co I设计种特异性引物快速鉴定具条实蝇[J].福建林业科技，2020，47（2）：20-25.
[17] 黄振，郭琼霞，陈韶萍.应用SS-PCR 技术设计种特异性引物快速鉴定瓜实蝇[J].安徽农业科学，2020，48（6）：83-86，96.
[18] 黄振.果实蝇属重要种的鉴定、人工饲料筛选、适生性预测和风险分析[D].海口：海南大学，2010.
[19] 殷玉生，张帆，安榆林.基于线粒体 COI基因鉴定大小蠹属昆虫[J].福建林业科技，2014，41（1）：63-67，120.