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[摘要] 目的 分离鉴定CD133 肿瘤干细胞，初步分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 胶质瘤干细胞多药耐药性中的作用。 方法 采用胶质瘤U251细胞系，磁珠分离、培养CD133 胶质瘤干细胞，RT-PCR技术分析MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 胶质瘤干细胞中的表达。 结果 培养的胶质母细胞瘤干细胞表达干细胞标记物Nestin，分化后细胞表达GFAP、β-tubulin；MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 胶质瘤干细胞中呈高表达，与CD133-胶质瘤干细胞比较差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 培养、鉴定胶质母细胞瘤肿瘤干细胞，MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 胶质瘤干细胞中呈高表达，为下一步研究奠定基础。
[关键词] 胶质母细胞瘤；肿瘤干细胞；CD133；耐药
[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0012-03
脑胶质瘤是常见的原发中枢神经系统肿瘤，约占中枢神经系统恶性肿瘤的78%，占成人中枢神经系统肿瘤的50%，是恶性程度最高也是最具侵袭性的肿瘤之一[1，2]。目前脑胶质瘤治疗主要以最大限度切除实体肿瘤，术后辅以替莫唑胺化疗。化疗是目前治疗胶质瘤及改善预后的重要手段，但目前的治疗效果仍达不到满意，其中主要原因是肿瘤细胞的耐药性[3]。CD133是肿瘤干细胞和神经干细胞的特异性标志物，相关研究显示CD133 细胞具有较强的致瘤能力，CD133 细胞的多药耐药性明显增强[4]。而MRP-1、MDR1在异质性胶质瘤的脑肿瘤干细胞中的高表达是临床内在性耐药和个体耐药的主要原因之一[5]。而GST-π作为肿瘤转化的标志物之一，能够催化谷胱甘肽与亲电性的抗癌药物结合，通过活性将抗癌药物排出细胞，增强肿瘤的耐药性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133 肿瘤干细胞中的表达，为进一步研究确切的耐药机制及逆转耐药提供前期基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
U251细胞系（广州赛业生物科技公司，货号：HCGUI-30001），DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133 ）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪购自Miltenyi Biotec公司，CO2恒温培养箱、-80℃超低温冰箱。
1.2 U251细胞复苏及培养
将保存人脑 U251 细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒温水浴中，轻轻摇动冻存管使管内冻存液快速融化；将含U251细胞的冻存液移入15 mL无菌离心管中，加入约 5 mL含血清培养基，1000 r/min 离心5 min，弃掉上清液；加入约 3 mL含血清培养基重悬细胞，无菌透气培养瓶中，置于37℃、体积分数 5% CO2饱和湿度的培养箱中培养；观察细胞的生长情况，每3日更换一次培養液；将U251细胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM 完全培养基中进行单层培养，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中连续培养传代。隔日换液1次，每次添加 4 mL培养基，每隔3 d进行细胞传代。
1.3 CD133 胶质瘤干细胞分选
收集培养基中连续培养的球样U251细胞，胰酶消化、离心后制备单细胞悬液，200 μm滤网过滤并计数。参照免疫磁珠（CD133 ）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪操作说明进行。
1.4 CD133 胶质瘤干细胞培养及鉴定
将对数生长期的U251细胞用0.25%胰蛋白酶消化、离心后吹打成单细胞悬液，分别用无菌PBS液和DMEM/F12重悬细胞漂洗1遍，接种到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12无血清培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。细胞鉴定：取胶质瘤干细胞植入包被有多聚赖氨酸的玻片上，晾干，用PBS冲洗除去残留培养基；经4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封闭；分别加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃过夜，加入FITC标记二抗，荧光显微镜镜检。
1.5 RT-PCR检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
采用Primer Premier v5软件设计MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正义链：5’-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3’，反义链：5’-TCATCGCCATCACAGCATTG-3’；MDR1：正义链：5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’，反义链：5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’；GST-π：正义链：5’-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3’，反义链：5’-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3’。后收集细胞，参照相应试剂盒说明书提取总RNA，逆转录提取cDNA，配制PCR 反应体系（20 μL）进行PCR反应。以相同来源的β-actin为内部参照，相对基因表达量=2-△△CT（△Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，△△Ct=△Ct试验组-△Ct 对照组），每个检测重复3次，计算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表达量。
1.6统计学分析
应用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组样本均数比较先进行正态分布及方差齐性检验，呈正态分布及方差齐性组间比较采用独立样本t检验，呈正态分布但方差不齐组间比较采用近似t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1胶质瘤干细胞的鉴定 胶质瘤U251干细胞经过Nestin、β-tubulin和GFAP荧光染色进行鉴定，结果U251干细胞球显示绿色荧光，呈强阳性表达。经过行GFAP和β-tubulin检测结果胶质瘤干细胞球未显示绿色荧光，呈阴性表达，经过培养基中诱导分化7 d后，胶质瘤U251干细胞GFAP、β-tubulin染色则细胞均显示绿色荧光，呈强阳性表达，见封三图6。
2.2 RT-PCR 检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
RT-PCR研究结果显示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 肿瘤干细胞中呈高度表达，而在CD133-细胞中表达显著低于CD133 细胞，差异有统计学意义（P<0.05）.
3 讨论
胶质母细胞瘤是中枢系统常见原发性肿瘤，患者虽及时接受完整的放疗和化疗联合治疗，预后仍较差，生存期僅为12～18个月。尽管手术器械和手术方法已经得到极大改进，术后放疗和化疗等综合治疗措施也有明显改善，胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仍无明显延长[7，8]。因此对胶质母细胞瘤的研究将具有持续的挑战性。鉴于胶质母细胞瘤是高度血管化的肿瘤，肿瘤的血管在肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用，因此，对胶质母细胞瘤的血管及其内皮细胞进行研究显得非常有意义。
以往研究认为，恶性肿瘤的生长依赖于肿瘤的血管生成。据此，有学者提出研发抗肿瘤血管生成药物达到治疗肿瘤的目的。但是，临床实践证明，这些药物的抗肿瘤效果非常有限并且容易获得耐药性[9-11]。因此，为研发更有效的抗肿瘤血管药物，我们需要对肿瘤的内皮细胞进行更深入的研究。研究证实在多种实体瘤中均含有极少数干细胞样的细胞，它们具有无限增殖、自我更新、多向分化的潜能及高致瘤性，这种干细胞样细胞被称为肿瘤干细胞。通过体外培养胶质瘤干细胞研究发现，胶质瘤干细胞具有自我增殖、多元分化的潜能。国外研究人员将胶质瘤干细胞与神经干细胞比较，胶质瘤干细胞的自我更新能力以及增殖能力均明显强于神经干细胞[12，13]。CD133 细胞在干细胞培养基中培养具有不断增殖、自我更新和分化的能力。我们在U251细胞系中分选CD133 细胞，实验显示其在无血清干细胞培养基中可以自我更新、无限增殖。经鉴定，分选获取的 CD133 细胞为胶质瘤干细胞。
MRP基因位于16p13.1染色体上，相关研究显示MRP能够通过改变胞浆和细胞器的pH值，降低药物到达作用部位的浓度，并且能够逆浓度梯度减少胞内药物浓度进而导致细胞耐药的发生，它同时也是一种ATP依赖泵，可以通过促进谷胱甘肽结合药物排出细胞外而减少细胞内药物的浓度，最终导致肿瘤耐药的发生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在胶质瘤干细胞中的表达明显增多，与肿瘤耐药之间的关系相对肯定，已经成为研究和解决肿瘤耐药现象的重要靶位[14-16]。MDR1作为ABC超家族中的转运体多药耐药蛋白1能够逃脱药物的杀伤作用，从而导致化疗后肿瘤的复发和转移[17]。GST是一组与机体解毒作用有关的酶类，其中以GST-π与恶性肿瘤关系最为密切。GST-π以催化方式降解药物，以降低抗肿瘤药物的细胞毒作用而产生耐药性[18-20]。本研究结果证实MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 细胞中呈现高表达，提示CD133 细胞的耐药机制可能与MRP-1、MDR1、GST-π表达增强有一定的关系，有可能成为胶质瘤干细胞治疗的新靶点，为进一步研究肿瘤的耐药机制以及肿瘤靶向治疗药物提供支持。
[参考文献]
[1] Wang XQ，Wei F，Yan S，et al.Innovative fluorescent magnetic albumin microbead-assisted cell labeling and intracellular imaging of glioblastoma cells[J].Biosensors
[关键词] 胶质母细胞瘤；肿瘤干细胞；CD133；耐药
[中图分类号] R739.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）05-0012-03
脑胶质瘤是常见的原发中枢神经系统肿瘤，约占中枢神经系统恶性肿瘤的78%，占成人中枢神经系统肿瘤的50%，是恶性程度最高也是最具侵袭性的肿瘤之一[1，2]。目前脑胶质瘤治疗主要以最大限度切除实体肿瘤，术后辅以替莫唑胺化疗。化疗是目前治疗胶质瘤及改善预后的重要手段，但目前的治疗效果仍达不到满意，其中主要原因是肿瘤细胞的耐药性[3]。CD133是肿瘤干细胞和神经干细胞的特异性标志物，相关研究显示CD133 细胞具有较强的致瘤能力，CD133 细胞的多药耐药性明显增强[4]。而MRP-1、MDR1在异质性胶质瘤的脑肿瘤干细胞中的高表达是临床内在性耐药和个体耐药的主要原因之一[5]。而GST-π作为肿瘤转化的标志物之一，能够催化谷胱甘肽与亲电性的抗癌药物结合，通过活性将抗癌药物排出细胞，增强肿瘤的耐药性[6]。本研究初步分析MRP-1、MDR1及GST-π在CD133 肿瘤干细胞中的表达，为进一步研究确切的耐药机制及逆转耐药提供前期基础。
1 材料与方法
1.1材料与试剂
U251细胞系（广州赛业生物科技公司，货号：HCGUI-30001），DMEM/F12培养基、胎牛血清（FBS）购自Hyclone公司，胰蛋白酶（Gibco公司）、免疫磁珠（CD133 ）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪购自Miltenyi Biotec公司，CO2恒温培养箱、-80℃超低温冰箱。
1.2 U251细胞复苏及培养
将保存人脑 U251 细胞的冻存管从-80℃冰箱中取出，立即置于37℃恒温水浴中，轻轻摇动冻存管使管内冻存液快速融化；将含U251细胞的冻存液移入15 mL无菌离心管中，加入约 5 mL含血清培养基，1000 r/min 离心5 min，弃掉上清液；加入约 3 mL含血清培养基重悬细胞，无菌透气培养瓶中，置于37℃、体积分数 5% CO2饱和湿度的培养箱中培养；观察细胞的生长情况，每3日更换一次培養液；将U251细胞在含10%的胎牛血清、青霉素 100 U/mL和链霉素100 μg/mL的DMEM 完全培养基中进行单层培养，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱中连续培养传代。隔日换液1次，每次添加 4 mL培养基，每隔3 d进行细胞传代。
1.3 CD133 胶质瘤干细胞分选
收集培养基中连续培养的球样U251细胞，胰酶消化、离心后制备单细胞悬液，200 μm滤网过滤并计数。参照免疫磁珠（CD133 ）细胞分选试剂盒、免疫磁珠分选仪操作说明进行。
1.4 CD133 胶质瘤干细胞培养及鉴定
将对数生长期的U251细胞用0.25%胰蛋白酶消化、离心后吹打成单细胞悬液，分别用无菌PBS液和DMEM/F12重悬细胞漂洗1遍，接种到含有EGF （20 ng/mL）、bFGF（20 ng/mL）、LIF（10 ng/mL）、B27（1×）的 DMEM/F12无血清培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。细胞鉴定：取胶质瘤干细胞植入包被有多聚赖氨酸的玻片上，晾干，用PBS冲洗除去残留培养基；经4%多聚甲醛固定，5%山羊血清封闭；分别加入Nestin、β-tubulin 和 GFAP一抗，4℃过夜，加入FITC标记二抗，荧光显微镜镜检。
1.5 RT-PCR检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
采用Primer Premier v5软件设计MRP-1、MDR1、GST-π引物序列。MRP1 正义链：5’-GCAGGGCTACTTCTACACCG-3’，反义链：5’-TCATCGCCATCACAGCATTG-3’；MDR1：正义链：5’-CCCATCATTGCAATAGCAGG-3’，反义链：5’-GTTCAAACTTCTGCTCCTGA-3’；GST-π：正义链：5’-CCAATACCATCCTGCGTCAC-3’，反义链：5’-TCACTGTTTCCCGTTGCCCAT-3’。后收集细胞，参照相应试剂盒说明书提取总RNA，逆转录提取cDNA，配制PCR 反应体系（20 μL）进行PCR反应。以相同来源的β-actin为内部参照，相对基因表达量=2-△△CT（△Ct=Ct 靶基因-Ct β-actin，△△Ct=△Ct试验组-△Ct 对照组），每个检测重复3次，计算 MRP-1、MDR1、GST-π mRNA表达量。
1.6统计学分析
应用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组样本均数比较先进行正态分布及方差齐性检验，呈正态分布及方差齐性组间比较采用独立样本t检验，呈正态分布但方差不齐组间比较采用近似t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1胶质瘤干细胞的鉴定 胶质瘤U251干细胞经过Nestin、β-tubulin和GFAP荧光染色进行鉴定，结果U251干细胞球显示绿色荧光，呈强阳性表达。经过行GFAP和β-tubulin检测结果胶质瘤干细胞球未显示绿色荧光，呈阴性表达，经过培养基中诱导分化7 d后，胶质瘤U251干细胞GFAP、β-tubulin染色则细胞均显示绿色荧光，呈强阳性表达，见封三图6。
2.2 RT-PCR 检测MRP-1、MDR1、GST-π mRNA的表达分析
RT-PCR研究结果显示MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 肿瘤干细胞中呈高度表达，而在CD133-细胞中表达显著低于CD133 细胞，差异有统计学意义（P<0.05）.
3 讨论
胶质母细胞瘤是中枢系统常见原发性肿瘤，患者虽及时接受完整的放疗和化疗联合治疗，预后仍较差，生存期僅为12～18个月。尽管手术器械和手术方法已经得到极大改进，术后放疗和化疗等综合治疗措施也有明显改善，胶质母细胞瘤患者的中位生存时间仍无明显延长[7，8]。因此对胶质母细胞瘤的研究将具有持续的挑战性。鉴于胶质母细胞瘤是高度血管化的肿瘤，肿瘤的血管在肿瘤的侵袭和转移中起着重要的作用，因此，对胶质母细胞瘤的血管及其内皮细胞进行研究显得非常有意义。
以往研究认为，恶性肿瘤的生长依赖于肿瘤的血管生成。据此，有学者提出研发抗肿瘤血管生成药物达到治疗肿瘤的目的。但是，临床实践证明，这些药物的抗肿瘤效果非常有限并且容易获得耐药性[9-11]。因此，为研发更有效的抗肿瘤血管药物，我们需要对肿瘤的内皮细胞进行更深入的研究。研究证实在多种实体瘤中均含有极少数干细胞样的细胞，它们具有无限增殖、自我更新、多向分化的潜能及高致瘤性，这种干细胞样细胞被称为肿瘤干细胞。通过体外培养胶质瘤干细胞研究发现，胶质瘤干细胞具有自我增殖、多元分化的潜能。国外研究人员将胶质瘤干细胞与神经干细胞比较，胶质瘤干细胞的自我更新能力以及增殖能力均明显强于神经干细胞[12，13]。CD133 细胞在干细胞培养基中培养具有不断增殖、自我更新和分化的能力。我们在U251细胞系中分选CD133 细胞，实验显示其在无血清干细胞培养基中可以自我更新、无限增殖。经鉴定，分选获取的 CD133 细胞为胶质瘤干细胞。
MRP基因位于16p13.1染色体上，相关研究显示MRP能够通过改变胞浆和细胞器的pH值，降低药物到达作用部位的浓度，并且能够逆浓度梯度减少胞内药物浓度进而导致细胞耐药的发生，它同时也是一种ATP依赖泵，可以通过促进谷胱甘肽结合药物排出细胞外而减少细胞内药物的浓度，最终导致肿瘤耐药的发生[11]。而MRP-1、MRP-3基因在胶质瘤干细胞中的表达明显增多，与肿瘤耐药之间的关系相对肯定，已经成为研究和解决肿瘤耐药现象的重要靶位[14-16]。MDR1作为ABC超家族中的转运体多药耐药蛋白1能够逃脱药物的杀伤作用，从而导致化疗后肿瘤的复发和转移[17]。GST是一组与机体解毒作用有关的酶类，其中以GST-π与恶性肿瘤关系最为密切。GST-π以催化方式降解药物，以降低抗肿瘤药物的细胞毒作用而产生耐药性[18-20]。本研究结果证实MRP-1、MDR1、GST-π在CD133 细胞中呈现高表达，提示CD133 细胞的耐药机制可能与MRP-1、MDR1、GST-π表达增强有一定的关系，有可能成为胶质瘤干细胞治疗的新靶点，为进一步研究肿瘤的耐药机制以及肿瘤靶向治疗药物提供支持。
[参考文献]
[1] Wang XQ，Wei F，Yan S，et al.Innovative fluorescent magnetic albumin microbead-assisted cell labeling and intracellular imaging of glioblastoma cells[J].Biosensors