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摘要：[目的]研究脱酰胺处理对小麦面筋蛋白多菌种发酵的影响。[方法]使用米曲霉和乳酸菌发酵脱酰胺度为37%、50%和65%的小麦面筋蛋白，研究了脱酰胺处理对发酵液总酸、还原糖、肽氮、游离氨基酸组成以及呈味特性的影响。[结果]试验表明，脱酰胺处理可以提高发酵液中肽氮、总酸和还原糖含量，其中，脱酰胺度50%的面筋蛋白发酵液中的肽氮含量达0.77 g/ml，相较于空白提高了11.93%，脱酰胺度37%的面筋蛋白发酵液中总酸含量为1.35 g/ml，比空白提高了16%，脱酰胺度50%的面筋蛋白发酵液中还原糖含量相对空白提高25%；同时脱酰胺处理降低了发酵液中疏水氨基酸的比例，脱酰胺度50%和65%的面筋蛋白发酵液中的游离谷氨酸的含量显著提高。[结论]研究可为使用小麦面筋蛋白制备呈味基料提供参考依据。
关键词：小麦面筋蛋白；脱酰胺；发酵；感官评价
中图分类号：S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-257-02
小麦面筋蛋白，又称活性小麦面筋，是生产小麦淀粉时的一种副产物[1]。小麦面筋蛋白中富含谷氨酰胺和天冬酰胺等疏水性氨基酸，导致其在水中分散性差，限制其在食品工业等领域的应用[2-3]。脱酰胺改性将面筋蛋白中的谷氨酰胺和天冬酰胺转化为谷氨酸和天冬氨酸，增大蛋白质侧链的静电斥力，提高水溶特性，改善酶解敏感性[4]。有研究发现，在发酵前对面筋蛋白进行一定的改性可改善其发酵品质[5-6]。米曲霉是我国传统酿造酱油时常使用的菌株，富含多种酶类，发酵工业常采用米曲霉固体制取产生的复合酶系。利用多菌种混合发酵具有成本低、风味独特、酶解效率高等优点，适宜工业化生产[7]。
笔者选取了以3种不同浓度的盐酸处理得到的不同脱酰胺程度的小麦面筋蛋白作为原料进行发酵，研究了经过脱酰胺处理得到的不同脱酰胺度的小麦面筋蛋白经发酵后所得产品的肽氮、总酸的含量，以及对游离氨基酸组成和呈味特性的影响，为使用小麦面筋蛋白制备呈味基料提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料。小麦，市售；焙炒小麦，实验室自行炒制；小麦面筋蛋白，河南莲花味精集团；光明曲精（沪酿3.042米曲霉孢子粉，孢子发芽率≥80%，孢子数≥1010/g干基，水分≤10%），上海酿造一厂；乳酸菌CICC6064，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要仪器设备。
精密电子天平JJ500型，上海亚津电子科技有限公司；凯式定氮仪KND-2C型，上海洪纪仪器设备有限公司；数显电热鼓风干燥箱101A-0，苏州学森仪器设备公司；紫外可见UV-2100型分光光度计，上海尤尼科仪器有限公司；恒温培养箱HPX-9052MBE，常州诺基仪器有限公司；立式杀菌锅JYS-900，利宏轻工机械有限公司；电热恒温水浴锅，北京市医疗设备厂；JJ-1B恒速强力电动搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司；全自动电位滴定仪CBS-1D型，哈希TitraLab仪器设备有限公司；全自动氨基酸分析仪A300型，曼默博尔（德国）有限公司，等。
1.1.3 主要试剂。
福林酚、酪蛋白、Na2CO3、HCl、H2SO4、硒粉、K2SO4、硼酸、NaOH、甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4、无水乙醇，所用试剂均为分析纯。
1.2 方法 小麦面筋蛋白脱酰胺工艺[8]：取 0～0.42 mol/L 的 HCl 与小麦面筋蛋白（0.24 g/ml）配制成混合溶液，在水浴摇床中（50～90 ℃）振荡一定时间（0～36 h）后冷却制得一定脱酰胺程度的酶解前处理样品。同样配制上述混合溶液，在水浴摇床中振荡一定时间后冷却离心（9 500 r/min，10 min）。取上清液测脱酰胺度。假设采用脱酰胺度为37%的小麦面筋蛋白进行发酵的工艺为A工艺，50%为B工艺，65%为C工艺，未进行脱酰胺处理的小麦面筋蛋白为空白对照。
脱酰胺处理后小麦面筋蛋白发酵工艺：全小麦焙炒→粉碎→润水（接种量为107 cfu/g乳酸菌）→造粒[9]→接种→出曲→添加脱酰胺处理小麦面筋蛋白和盐水[小麦面筋蛋白∶大曲∶盐水=1∶1∶5（g∶g∶g），18%盐水]→入发酵罐发酵→发酵过程中定期取样后4 ℃冰箱贮藏。
1.3 分析方法 总氮的测定：凯氏定氮法，参考GB 5009.5-2010，食品中蛋白质的测定。
总酸的测定：氢氧化钠滴定法。
氨基酸态氮的测定：甲醛滴定法，参考GB/T 5009.39-2003， 酱油卫生标准的分析方法。
肽氮的测定：发酵液中总氮与氨基酸态氮含量之差。
游离氨基酸的含量分析： 4 ml样品，加入1 ml磺基水杨酸，置于4 ℃冷藏60 min后10 000 r/min离心15 min，取上清液稀释100倍，调pH为2.2后0.2 μm滤膜过滤。用menbraPureTS263锂离子交换柱，取滤液20 μl，梯度洗脱，茚三酮柱后衍生，反应温度为115 ℃，流动相流速为120 μl/min，茚三酮流速为60 μl/min，在570 nm处测吸光值，脯氨酸在440 nm处测吸光值。数据分析：将所有测试重复进行3次，用SPSS 14.0统计分析软件对所有数据进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中总氮含量的变化 如图1所示，发酵初期蛋白酶活力高造成总氮含量上升明显，随着发酵的进行，蛋白酶活力逐渐下降导致中后期总氮含量增长趋于平缓。发酵初始阶段，A、B样品的总氮含量高于空白样，而5 d后，空白样品的总氮含量高于其他样品，这主要因为对面筋蛋白进行恰当的脱酰胺处理可加快发酵前期的总氮溶出速率，但随着发酵的进行，空白原料在自身内源酶和种曲中酶的共同作用下促进了反应的进行。在整个发酵过程中C样品的总氮含量始终低于其他样品的，原因可能是过度脱酰胺钝化了其酶解敏感性。 2.2 发酵过程中氨态氮含量的变化 氨态氮是评价发酵液营养价值的重要参考。在发酵过程中蛋白质在微生物发酵的作用下产生一些小分子肽和氨基酸，其含量变化如图2所示。与总氮变化趋势相似，发酵初期全部样品的氨态氮含量明显升高，在后期增长速度放缓。发现在整个发酵过程中，空白样品的氨态氮含量始终高于A、B、C样品的，其氨态氮含量在第30天时达到9.4 g/L，这可能是由于脱酰胺处理后的样品的高盐度产生了高渗透压及强离子静电效应，它们破坏蛋白酶的稳定性，进而造成蛋白质水解度降低，氨态氮含量增长放缓。同时，B和C样品的氨态氮含量始终高于A的，在30 d时分别比A样品高6.26%和4.95%。
2.3 发酵过程中肽氮含量的变化 大豆蛋白在曲霉的蛋白酶作用下会分解为可溶肽段，需要肽酶的作用进一步分解成为游离氨基酸。如图3所示，所有样品在发酵过程中肽氮的含量呈现出先上升后下降的趋势，其中A和B的肽氮含量高于空白，到发酵结束时B样品肽氮含量最高，达到7.7 g/L，比空白高出11.93%。综上，脱酰胺度为37%和50%的小麦面筋蛋白有利于发酵液多肽的产生。
2.4 发酵过程中总酸含量的变化 有机酸不仅可以增强酶解液的酸味，还能够提高其缓冲能力，加强呈味效果。如图4所示，在整个发酵过程中，总酸的含量呈上升趋势，且在初期的增长速率要高于后期。发酵过程中A、B、C 3个样品的总酸含量始终高于空白样品，30 d时，A样品的总酸含量为13.5 g/L，比空白提高了16%。发酵初期，发酵液中营养物质充分，耐盐性乳酸菌大量增殖，导致总酸含量显著上升，随着发酵的进行，乳酸和酒精等中间产物的逐渐积累，抑制乳酸菌的活动，导致后期酸度增速变缓。
2.5 发酵成品游离氨基酸结果 由表1可知，在样品中含量较高的氨基酸是谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸，这4种氨基酸的含量分别占空白、A、B和C的总游离氨基酸量的48.5%、46.03%、51.49%和50.88%。鲜味氨基酸，谷氨酸和天门冬氨酸，在空白、A、B和C的含量和占据总氨基酸的比例分别是20 461.7 mg/L，17.42%；17 387.8 mg/L，14.94%；24 655.8 mg/L，23.87%以及27 462.2 mg/L，27.27%。其中谷氨酸的含量和比例分别为16 574.6 mg/L，11.97%；13 929.4 mg/L，21.67%；22 387.8 mg/L，25.30%以及25 471.0 mg/L，14.11%。由此可知，谷氨酸含量随着脱酰胺的上升而增加，这也使得鲜味氨基酸的含量上升，同时谷氨
酰胺则随之上升而降低。含有疏水氨基酸和苦味氨基酸的多肽会造成蛋白酶解液的苦味。A、B和C样品中的疏水性氨基酸比例显著低于空白样品的（P<0.05），说明脱酰胺处理可以有效减少疏水氨基酸的含量。
3 结论
通过使用脱酰胺的小麦面筋蛋白进行发酵试验，研究了脱酰胺处理对面筋蛋白发酵液的各种理化指标，游离氨基酸组成和呈味特性的影响，得到以下结论：
脱酰胺度为37%和50%的面筋蛋白可以提高发酵液中肽氮的含量，30 d时，肽氮含量分别为7.7 g/L和7.5 g/L，比空白提高了11.93%和9.34%。
脱酰胺处理可以提高发酵液中游离谷氨酸的含量，随着脱酰胺度的提高含量越高；能够显著降低样品中的疏水性氨基酸，提高鲜味氨基酸的含量。
参考文献
[1] GIANIBELLI M C，LARROQUE O R，MACRITCHIE F，et al.Biochemical， genetic and molecular characterization of wheat endosperm proteins[J].Journal of Cereal Science（online review），2001，78：635-646.
[2] QIU C Y，SUN W Z，ZHAO Q Z， et al.Emulsifying and surface properties of citric acid deamidated wheat gliadin[J].Journal of Cereal Science， 2013，58：68-75.
[3] KIRIMURAL J，SHIMIZU A，KIMIZUKA A，et al.The contribution of peptides and amino acids to the taste of food stuffs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1969， 17（4）：689-695. [4] QIU C Y，SUN W Z，CUI C， et al.Effect of citric acid deamidation on in vitro digestibility and antioxidant properties of wheat gluten[J].Food Chemistry， 2013，141：2772-2778.
[5] CUI C，HU Q L，REN J Y， et al.The effect of lactic acid bacteria fermentation on the oxidant activity of wheat gluten pancreatin hydrolysates[J].International Journal of Food Science and Technology，2014，49（4）：1048-1054.
[6] GRIMRATH A，BERENDS P，RADE S， et al.Koji fermentation based on extracellular peptidases of Flammulina velutipes[J].European Food Research and Technology，2011，232（3）：415-424.
[7] 刘金霞.酱油酿造过程中米曲霉酶系的影响因素[J].江苏调味副食品， 2002， 73（2）：10-11.
[8] 胡庆玲，尹文颖，赵谋明，等.小麦面筋盐酸脱酰胺工艺优化及其酶解敏感性[J].食品与发酵工业， 2013，39（4）：7-11.
[9] 黄婵媛，崔春，赵谋明.米曲霉全小麦制曲条件的优化[J].食品与发酵工业， 2010，36（4）：88-91.
关键词：小麦面筋蛋白；脱酰胺；发酵；感官评价
中图分类号：S511 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）08-257-02
小麦面筋蛋白，又称活性小麦面筋，是生产小麦淀粉时的一种副产物[1]。小麦面筋蛋白中富含谷氨酰胺和天冬酰胺等疏水性氨基酸，导致其在水中分散性差，限制其在食品工业等领域的应用[2-3]。脱酰胺改性将面筋蛋白中的谷氨酰胺和天冬酰胺转化为谷氨酸和天冬氨酸，增大蛋白质侧链的静电斥力，提高水溶特性，改善酶解敏感性[4]。有研究发现，在发酵前对面筋蛋白进行一定的改性可改善其发酵品质[5-6]。米曲霉是我国传统酿造酱油时常使用的菌株，富含多种酶类，发酵工业常采用米曲霉固体制取产生的复合酶系。利用多菌种混合发酵具有成本低、风味独特、酶解效率高等优点，适宜工业化生产[7]。
笔者选取了以3种不同浓度的盐酸处理得到的不同脱酰胺程度的小麦面筋蛋白作为原料进行发酵，研究了经过脱酰胺处理得到的不同脱酰胺度的小麦面筋蛋白经发酵后所得产品的肽氮、总酸的含量，以及对游离氨基酸组成和呈味特性的影响，为使用小麦面筋蛋白制备呈味基料提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 原料。小麦，市售；焙炒小麦，实验室自行炒制；小麦面筋蛋白，河南莲花味精集团；光明曲精（沪酿3.042米曲霉孢子粉，孢子发芽率≥80%，孢子数≥1010/g干基，水分≤10%），上海酿造一厂；乳酸菌CICC6064，中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2 主要仪器设备。
精密电子天平JJ500型，上海亚津电子科技有限公司；凯式定氮仪KND-2C型，上海洪纪仪器设备有限公司；数显电热鼓风干燥箱101A-0，苏州学森仪器设备公司；紫外可见UV-2100型分光光度计，上海尤尼科仪器有限公司；恒温培养箱HPX-9052MBE，常州诺基仪器有限公司；立式杀菌锅JYS-900，利宏轻工机械有限公司；电热恒温水浴锅，北京市医疗设备厂；JJ-1B恒速强力电动搅拌器，金坛市荣华仪器制造有限公司；全自动电位滴定仪CBS-1D型，哈希TitraLab仪器设备有限公司；全自动氨基酸分析仪A300型，曼默博尔（德国）有限公司，等。
1.1.3 主要试剂。
福林酚、酪蛋白、Na2CO3、HCl、H2SO4、硒粉、K2SO4、硼酸、NaOH、甲醛、Na2HPO4、NaH2PO4、无水乙醇，所用试剂均为分析纯。
1.2 方法 小麦面筋蛋白脱酰胺工艺[8]：取 0～0.42 mol/L 的 HCl 与小麦面筋蛋白（0.24 g/ml）配制成混合溶液，在水浴摇床中（50～90 ℃）振荡一定时间（0～36 h）后冷却制得一定脱酰胺程度的酶解前处理样品。同样配制上述混合溶液，在水浴摇床中振荡一定时间后冷却离心（9 500 r/min，10 min）。取上清液测脱酰胺度。假设采用脱酰胺度为37%的小麦面筋蛋白进行发酵的工艺为A工艺，50%为B工艺，65%为C工艺，未进行脱酰胺处理的小麦面筋蛋白为空白对照。
脱酰胺处理后小麦面筋蛋白发酵工艺：全小麦焙炒→粉碎→润水（接种量为107 cfu/g乳酸菌）→造粒[9]→接种→出曲→添加脱酰胺处理小麦面筋蛋白和盐水[小麦面筋蛋白∶大曲∶盐水=1∶1∶5（g∶g∶g），18%盐水]→入发酵罐发酵→发酵过程中定期取样后4 ℃冰箱贮藏。
1.3 分析方法 总氮的测定：凯氏定氮法，参考GB 5009.5-2010，食品中蛋白质的测定。
总酸的测定：氢氧化钠滴定法。
氨基酸态氮的测定：甲醛滴定法，参考GB/T 5009.39-2003， 酱油卫生标准的分析方法。
肽氮的测定：发酵液中总氮与氨基酸态氮含量之差。
游离氨基酸的含量分析： 4 ml样品，加入1 ml磺基水杨酸，置于4 ℃冷藏60 min后10 000 r/min离心15 min，取上清液稀释100倍，调pH为2.2后0.2 μm滤膜过滤。用menbraPureTS263锂离子交换柱，取滤液20 μl，梯度洗脱，茚三酮柱后衍生，反应温度为115 ℃，流动相流速为120 μl/min，茚三酮流速为60 μl/min，在570 nm处测吸光值，脯氨酸在440 nm处测吸光值。数据分析：将所有测试重复进行3次，用SPSS 14.0统计分析软件对所有数据进行单因素方差分析。
2 结果与分析
2.1 发酵过程中总氮含量的变化 如图1所示，发酵初期蛋白酶活力高造成总氮含量上升明显，随着发酵的进行，蛋白酶活力逐渐下降导致中后期总氮含量增长趋于平缓。发酵初始阶段，A、B样品的总氮含量高于空白样，而5 d后，空白样品的总氮含量高于其他样品，这主要因为对面筋蛋白进行恰当的脱酰胺处理可加快发酵前期的总氮溶出速率，但随着发酵的进行，空白原料在自身内源酶和种曲中酶的共同作用下促进了反应的进行。在整个发酵过程中C样品的总氮含量始终低于其他样品的，原因可能是过度脱酰胺钝化了其酶解敏感性。 2.2 发酵过程中氨态氮含量的变化 氨态氮是评价发酵液营养价值的重要参考。在发酵过程中蛋白质在微生物发酵的作用下产生一些小分子肽和氨基酸，其含量变化如图2所示。与总氮变化趋势相似，发酵初期全部样品的氨态氮含量明显升高，在后期增长速度放缓。发现在整个发酵过程中，空白样品的氨态氮含量始终高于A、B、C样品的，其氨态氮含量在第30天时达到9.4 g/L，这可能是由于脱酰胺处理后的样品的高盐度产生了高渗透压及强离子静电效应，它们破坏蛋白酶的稳定性，进而造成蛋白质水解度降低，氨态氮含量增长放缓。同时，B和C样品的氨态氮含量始终高于A的，在30 d时分别比A样品高6.26%和4.95%。
2.3 发酵过程中肽氮含量的变化 大豆蛋白在曲霉的蛋白酶作用下会分解为可溶肽段，需要肽酶的作用进一步分解成为游离氨基酸。如图3所示，所有样品在发酵过程中肽氮的含量呈现出先上升后下降的趋势，其中A和B的肽氮含量高于空白，到发酵结束时B样品肽氮含量最高，达到7.7 g/L，比空白高出11.93%。综上，脱酰胺度为37%和50%的小麦面筋蛋白有利于发酵液多肽的产生。
2.4 发酵过程中总酸含量的变化 有机酸不仅可以增强酶解液的酸味，还能够提高其缓冲能力，加强呈味效果。如图4所示，在整个发酵过程中，总酸的含量呈上升趋势，且在初期的增长速率要高于后期。发酵过程中A、B、C 3个样品的总酸含量始终高于空白样品，30 d时，A样品的总酸含量为13.5 g/L，比空白提高了16%。发酵初期，发酵液中营养物质充分，耐盐性乳酸菌大量增殖，导致总酸含量显著上升，随着发酵的进行，乳酸和酒精等中间产物的逐渐积累，抑制乳酸菌的活动，导致后期酸度增速变缓。
2.5 发酵成品游离氨基酸结果 由表1可知，在样品中含量较高的氨基酸是谷氨酰胺、谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸，这4种氨基酸的含量分别占空白、A、B和C的总游离氨基酸量的48.5%、46.03%、51.49%和50.88%。鲜味氨基酸，谷氨酸和天门冬氨酸，在空白、A、B和C的含量和占据总氨基酸的比例分别是20 461.7 mg/L，17.42%；17 387.8 mg/L，14.94%；24 655.8 mg/L，23.87%以及27 462.2 mg/L，27.27%。其中谷氨酸的含量和比例分别为16 574.6 mg/L，11.97%；13 929.4 mg/L，21.67%；22 387.8 mg/L，25.30%以及25 471.0 mg/L，14.11%。由此可知，谷氨酸含量随着脱酰胺的上升而增加，这也使得鲜味氨基酸的含量上升，同时谷氨
酰胺则随之上升而降低。含有疏水氨基酸和苦味氨基酸的多肽会造成蛋白酶解液的苦味。A、B和C样品中的疏水性氨基酸比例显著低于空白样品的（P<0.05），说明脱酰胺处理可以有效减少疏水氨基酸的含量。
3 结论
通过使用脱酰胺的小麦面筋蛋白进行发酵试验，研究了脱酰胺处理对面筋蛋白发酵液的各种理化指标，游离氨基酸组成和呈味特性的影响，得到以下结论：
脱酰胺度为37%和50%的面筋蛋白可以提高发酵液中肽氮的含量，30 d时，肽氮含量分别为7.7 g/L和7.5 g/L，比空白提高了11.93%和9.34%。
脱酰胺处理可以提高发酵液中游离谷氨酸的含量，随着脱酰胺度的提高含量越高；能够显著降低样品中的疏水性氨基酸，提高鲜味氨基酸的含量。
参考文献
[1] GIANIBELLI M C，LARROQUE O R，MACRITCHIE F，et al.Biochemical， genetic and molecular characterization of wheat endosperm proteins[J].Journal of Cereal Science（online review），2001，78：635-646.
[2] QIU C Y，SUN W Z，ZHAO Q Z， et al.Emulsifying and surface properties of citric acid deamidated wheat gliadin[J].Journal of Cereal Science， 2013，58：68-75.
[3] KIRIMURAL J，SHIMIZU A，KIMIZUKA A，et al.The contribution of peptides and amino acids to the taste of food stuffs[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1969， 17（4）：689-695. [4] QIU C Y，SUN W Z，CUI C， et al.Effect of citric acid deamidation on in vitro digestibility and antioxidant properties of wheat gluten[J].Food Chemistry， 2013，141：2772-2778.
[5] CUI C，HU Q L，REN J Y， et al.The effect of lactic acid bacteria fermentation on the oxidant activity of wheat gluten pancreatin hydrolysates[J].International Journal of Food Science and Technology，2014，49（4）：1048-1054.
[6] GRIMRATH A，BERENDS P，RADE S， et al.Koji fermentation based on extracellular peptidases of Flammulina velutipes[J].European Food Research and Technology，2011，232（3）：415-424.
[7] 刘金霞.酱油酿造过程中米曲霉酶系的影响因素[J].江苏调味副食品， 2002， 73（2）：10-11.
[8] 胡庆玲，尹文颖，赵谋明，等.小麦面筋盐酸脱酰胺工艺优化及其酶解敏感性[J].食品与发酵工业， 2013，39（4）：7-11.
[9] 黄婵媛，崔春，赵谋明.米曲霉全小麦制曲条件的优化[J].食品与发酵工业， 2010，36（4）：88-91.