【摘 要】
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为探讨益母草碱（leonurine， Leo）对erastin诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）铁死亡的保护作用及其潜在机制，在体外构建erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型，检测Leo对铁死亡细胞活力、细胞状态、铁死亡相关指标及相关信号通路蛋白的影响。首先，体外培养HK-2细胞，CCK-8法检测10、20、40、80、100 μmol·L-1的Leo对正常HK-2细胞活性的影响，以此确定Le
【机 构】
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省部共建中医湿证国家重点实验室广州中医药大学第二附属医院&广东省中医院
【基金项目】
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国家自然科学基金项目（82004157）； 广东省中医院朝阳人才科研专项（ZY2022KY13）； 广东省中医药局科研项目（20225002）； 省部共建中医湿证国家重点实验室专项（SZ2021ZZ10）；
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为探讨益母草碱（leonurine， Leo）对erastin诱导的人肾小管上皮细胞（HK-2）铁死亡的保护作用及其潜在机制，在体外构建erastin诱导的HK-2细胞铁死亡模型，检测Leo对铁死亡细胞活力、细胞状态、铁死亡相关指标及相关信号通路蛋白的影响。首先，体外培养HK-2细胞，CCK-8法检测10、20、40、80、100 μmol·L-1的Leo对正常HK-2细胞活性的影响，以此确定Leo的安全给药剂量范围；用铁死亡经典诱导剂erastin诱导铁死亡细胞模型并筛选出合适的造模浓度；CCK-8法检测Leo(20、40、80 μmol·L-1)及阳性药铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1，1、2 μmol·L-1)对铁死亡模型细胞活性的影响，同时在相差显微镜下观察细胞形态学的变化。其次，通过Western blot法检测核转录因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid2-related factor 2， Nrf2）的入核激活情况，并筛选后续机制研究的最佳浓度；进一步用透射电镜观察铁死亡发生的特征性显微形态学改变，应用流式细胞术检测活性氧（reactive oxygen species， ROS）变化，使用还原型谷胱甘肽测定试剂盒检测还原型谷胱甘肽（glutathione， GSH）的含量。最后，用Western blot法定量检测各组谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4， GPX4）、通路蛋白p62及Nrf2下游蛋白血红素加氧酶-1（home oxygenase-1， HO-1）的表达，探讨Leo对HK-2铁死亡调控作用的具体机制。结果显示，Leo在浓度为10～100 μmol·L-1时对正常HK-2细胞活性无影响，表明该浓度范围的药物对细胞无明显毒副作用；HK-2细胞活性随着铁死亡诱导剂erastin浓度的增高而降低，5 μmol·L-1 erastin能够显著诱导HK-2细胞发生铁死亡；与模型组相比，20、40、80 μmol·L-1的Leo呈剂量依赖性提高HK-2细胞活性，并且能有效改善细胞形态；80 μmol·L-1 Leo能显著上调HK-2细胞核中Nrf2的表达。进一步研究表明，Leo可以显著改善erastin造成的铁死亡特征性显微结构损伤，抑制细胞内ROS的释放，升高GSH含量，促进Nrf2向细胞核内移位，增强GPX4，显著上调p62、HO-1蛋白的表达。综上所述，Leo对erastin诱导的人肾小管上皮细胞铁死亡具有保护作用，其机制可能是通过激活p62/Nrf2/HO-1信号通路实现抗氧化应激从而抑制铁死亡。
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