【摘 要】
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应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA.序列分析证实,与国外的报道完全一致.将含完整阅读框
【机 构】
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中山大学生物工程研究中心,广州,510275中山大学生物防治国家重点实验室/昆虫研究所,广州,510275;
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应用RT-PCR技术,从人黑色素瘤Bowes细胞株中扩增出人组织型纤溶酶原激活剂(tissue-typeplasminogenactivator,t-PA)cDNA.序列分析证实,与国外的报道完全一致.将含完整阅读框架的人t-PAcDNA克隆至昆虫细胞表达转移载体pBacPAK8中,获得重组质粒pBac-tPA.应用脂质体共转染法,将pBactPA和线性化杆状病毒BacPAK6DNA共转染Tn-5B-1昆虫细胞.经空斑筛选获得11株重组病毒.经PCR鉴定与生物活性测定,获得一株高效表达t-PA的重组病毒BactPA3.在含胎牛血清的培养基中,t-PA表达活性在感染(MOI≈10)后72h左右达到最高,为3.04×103IU/ml,即相当于1.8×104IU/106细胞;在无血清培养基中,t-PA最高表达水平相差不大,但时间为感染后132h左右.经SDS-PAGE纤维蛋白自显影分析,分子量为68kda左右.与从人黑色素瘤细胞培养液中提纯的天然t-PA相比,其受纤维蛋白原激活的特性、和纤维蛋白的亲和力及在血浆中的失活速率基本相同.表达的t-PA在血液循环中的半衰期为7min.
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