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【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）11-0457-01
【摘 要】人类Rh血型D抗原是临床输血引起红细胞同种免疫反应的重要抗原，是红细胞血型中最复杂的系统，仅次于ABO血型抗原。通常检测D抗原首先采用抗D血清或抗D单抗和多抗混合抗体盐水法，阴性结果再用抗人球蛋白试验确认。
【关键词】RhD抗原 抗人球蛋白试验 吸收放散试验 D基因
人类Rh血型D抗原是临床输血引起紅细胞同种免疫反应的重要抗原，是红细胞血型中最复杂的系统，仅次于ABO血型抗原。通常检测D抗原首先采用抗D血清或抗D单抗和多抗混合抗体盐水法，阴性结果再用抗人球蛋白试验确认。笔者针对抗人球蛋白试验是否存在漏检某些D抗原弱表现型，进行了如下试验。
一、材料与方法
1、样品筛选
采用 LgM、LgC 混合抗一D试剂（Immucor）筛 选（盐水法）随机筛无关供者获得60名RhD阴性，2名AHG（Immucor）试验鉴定为弱D或D变量，其余58名确认为RhD阴性。
2、吸收放散试验
①三氯乙烯-三氯甲烷放散法，红细胞经生理盐水洗涤三次，取压积红细胞（3000rpm，离心2分钟）6一8滴，加等量人抗-D血清，置37℃水浴吸收，分别于吸收0.5小时、1小时、1.5小时、2小时取出少许红细胞进行AHG试验，其余红细胞用生理盐水充分洗涤后，配成50%悬液，与等量三氯乙烯-三氯甲烷（1：l临时配制）充分混合，2000rpm，离心3分钟，吸取下层红细胞抗体放散液，再用三份Rh（D）阳性、0型混合红细胞，结合间接AHG试验鉴定放散液。② 热放散法，同上红细胞吸收抗D血清后，取压积红细胞与等量生理盐水混合，56℃轻摇放散7分钟，立即2000rpm，离心3分钟，吸取上层红细胞抗体放散液，间接AHG试验鉴定。
3、Rh血型D基因检测
亲和层析柱法（QIAGen，Gene Co.）提取DNA，DNA/RNA测定仪（Phamiacia Co.）测定其纯度和浓度。引物设计根据Arce作适当调整，SensePrimer：5’一AAC GAT ACC CAG TTT GTC TG3'；Anti一Sense
Primer：5’一ATG ACC CTG AGA TGG CTG T一3'。50ul反应体积中，含模板DNA 50ng、引物各1OPmol，MgCL22.5mmol/L、KCL50 mmol/L、Tris10mmol/L、Trions l% 、Taq DNA聚合酶（Gene Company）1.5u，940C预变性5min，接940CImin、580C 30s，720C 2min，扩增（PE9600）35个循环。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，GDS8000凝胶成像仪（Gene Company）成像处理。
二、结果
1、RhD表型测定
60名初筛 RhD阴性，AHG试验鉴定2名为D弱阳性，确认58名为阴性；吸收放散试验显示，8名能检出D抗原（表1），吸收过程中，不同时间进行的抗人球蛋白试验结果全部为阴性（表2），说明延长吸收时间并没有提高AHG试验的敏感性。
2、 RhD基因检测
2名D弱表现型或D变量，及6名吸收放散试验检出D抗原的个体，基因检测为阳性，吸收放散试验鉴定为阴性的个体均未检出D基因，显示基因检测与吸收放散试验检测红细胞抗原的一致性。
三、讨论
D抗原多贯穿红细胞膜，膜外部分较短，其免疫原性主要依赖于在红细胞膜外的精细的表面结构相互作用，免疫原性较强。红细胞膜D抗原存在数量和质量的变化，数量变化指D抗原数目的改变，通常单个红细胞表面约有几百到几万个抗原数不等；质量变化指D抗原表位数的改变，现已确定D抗原表位数至少有30个。D抗原弱表现型一般均存在数量和/或质量的改变。常规RhD盐水检测法，可用于检测正常D抗原，AHG试验可以检出一部分D抗原弱表现型，但某些D抗原弱表现型需要进行吸收放散试验才可排解，或通过抗不同D抗原表位的组合单克隆抗体排除。
一直以来，AHG试验是Rh血型D抗原检测的重要手段，也是D抗原阴性确认的最终手段，然而本文发现58名经AHG试验确认的RhD阴性中，仍有6名（10.3%）采用吸收放散试验能检出D抗原，说明某些D抗原弱表现型，AHG试验尚不能检测出。常规AHG试验抗D血清与红细胞的孵育吸收时间为30分钟，本文在对58名AHG试验确认的RhD阴性样本吸收过程中，分别于1小时、1.5小时、2小时取出红细胞进行AHG试验，结果全部为阴性（表2），说明延长AHG试验抗。台湾作者采用吸收放散试验在230名D阴性个体中，检出75名为D抗原弱表现型。
AHG试验鉴定的D阴性中，部分有可能是D阳性，意味中国人群RhD阴性比率实际上低于根据AHG试验得出阴性比率3一5‰，同时由于AHG试验可能漏检某些D抗原弱表现型个体，是否也意味着在临床试验中，为了避免输血反应，AHG不能作为供者或受者D阴性的确认试验呢？事实上，AHG无法检测到的红细胞D抗原，由于其免疫原性大大降低，虽然也有人发现D弱表现型引起同种免疫反应，但此类报道较少，但作者认为临床也不能因此忽视弱D的检测，应该根据不同的情况提出不同的要求，某些RhD阴性慢性输血患者如血液病等，需长期进行输血治疗，供者必需进行吸收放散试验进行鉴定D抗原，以确认是否存在漏检的D抗原，提高输血安全性。
参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程.天津：天津 科学技术出版社，1997.60一86
【摘 要】人类Rh血型D抗原是临床输血引起红细胞同种免疫反应的重要抗原，是红细胞血型中最复杂的系统，仅次于ABO血型抗原。通常检测D抗原首先采用抗D血清或抗D单抗和多抗混合抗体盐水法，阴性结果再用抗人球蛋白试验确认。
【关键词】RhD抗原 抗人球蛋白试验 吸收放散试验 D基因
人类Rh血型D抗原是临床输血引起紅细胞同种免疫反应的重要抗原，是红细胞血型中最复杂的系统，仅次于ABO血型抗原。通常检测D抗原首先采用抗D血清或抗D单抗和多抗混合抗体盐水法，阴性结果再用抗人球蛋白试验确认。笔者针对抗人球蛋白试验是否存在漏检某些D抗原弱表现型，进行了如下试验。
一、材料与方法
1、样品筛选
采用 LgM、LgC 混合抗一D试剂（Immucor）筛 选（盐水法）随机筛无关供者获得60名RhD阴性，2名AHG（Immucor）试验鉴定为弱D或D变量，其余58名确认为RhD阴性。
2、吸收放散试验
①三氯乙烯-三氯甲烷放散法，红细胞经生理盐水洗涤三次，取压积红细胞（3000rpm，离心2分钟）6一8滴，加等量人抗-D血清，置37℃水浴吸收，分别于吸收0.5小时、1小时、1.5小时、2小时取出少许红细胞进行AHG试验，其余红细胞用生理盐水充分洗涤后，配成50%悬液，与等量三氯乙烯-三氯甲烷（1：l临时配制）充分混合，2000rpm，离心3分钟，吸取下层红细胞抗体放散液，再用三份Rh（D）阳性、0型混合红细胞，结合间接AHG试验鉴定放散液。② 热放散法，同上红细胞吸收抗D血清后，取压积红细胞与等量生理盐水混合，56℃轻摇放散7分钟，立即2000rpm，离心3分钟，吸取上层红细胞抗体放散液，间接AHG试验鉴定。
3、Rh血型D基因检测
亲和层析柱法（QIAGen，Gene Co.）提取DNA，DNA/RNA测定仪（Phamiacia Co.）测定其纯度和浓度。引物设计根据Arce作适当调整，SensePrimer：5’一AAC GAT ACC CAG TTT GTC TG3'；Anti一Sense
Primer：5’一ATG ACC CTG AGA TGG CTG T一3'。50ul反应体积中，含模板DNA 50ng、引物各1OPmol，MgCL22.5mmol/L、KCL50 mmol/L、Tris10mmol/L、Trions l% 、Taq DNA聚合酶（Gene Company）1.5u，940C预变性5min，接940CImin、580C 30s，720C 2min，扩增（PE9600）35个循环。产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，GDS8000凝胶成像仪（Gene Company）成像处理。
二、结果
1、RhD表型测定
60名初筛 RhD阴性，AHG试验鉴定2名为D弱阳性，确认58名为阴性；吸收放散试验显示，8名能检出D抗原（表1），吸收过程中，不同时间进行的抗人球蛋白试验结果全部为阴性（表2），说明延长吸收时间并没有提高AHG试验的敏感性。
2、 RhD基因检测
2名D弱表现型或D变量，及6名吸收放散试验检出D抗原的个体，基因检测为阳性，吸收放散试验鉴定为阴性的个体均未检出D基因，显示基因检测与吸收放散试验检测红细胞抗原的一致性。
三、讨论
D抗原多贯穿红细胞膜，膜外部分较短，其免疫原性主要依赖于在红细胞膜外的精细的表面结构相互作用，免疫原性较强。红细胞膜D抗原存在数量和质量的变化，数量变化指D抗原数目的改变，通常单个红细胞表面约有几百到几万个抗原数不等；质量变化指D抗原表位数的改变，现已确定D抗原表位数至少有30个。D抗原弱表现型一般均存在数量和/或质量的改变。常规RhD盐水检测法，可用于检测正常D抗原，AHG试验可以检出一部分D抗原弱表现型，但某些D抗原弱表现型需要进行吸收放散试验才可排解，或通过抗不同D抗原表位的组合单克隆抗体排除。
一直以来，AHG试验是Rh血型D抗原检测的重要手段，也是D抗原阴性确认的最终手段，然而本文发现58名经AHG试验确认的RhD阴性中，仍有6名（10.3%）采用吸收放散试验能检出D抗原，说明某些D抗原弱表现型，AHG试验尚不能检测出。常规AHG试验抗D血清与红细胞的孵育吸收时间为30分钟，本文在对58名AHG试验确认的RhD阴性样本吸收过程中，分别于1小时、1.5小时、2小时取出红细胞进行AHG试验，结果全部为阴性（表2），说明延长AHG试验抗。台湾作者采用吸收放散试验在230名D阴性个体中，检出75名为D抗原弱表现型。
AHG试验鉴定的D阴性中，部分有可能是D阳性，意味中国人群RhD阴性比率实际上低于根据AHG试验得出阴性比率3一5‰，同时由于AHG试验可能漏检某些D抗原弱表现型个体，是否也意味着在临床试验中，为了避免输血反应，AHG不能作为供者或受者D阴性的确认试验呢？事实上，AHG无法检测到的红细胞D抗原，由于其免疫原性大大降低，虽然也有人发现D弱表现型引起同种免疫反应，但此类报道较少，但作者认为临床也不能因此忽视弱D的检测，应该根据不同的情况提出不同的要求，某些RhD阴性慢性输血患者如血液病等，需长期进行输血治疗，供者必需进行吸收放散试验进行鉴定D抗原，以确认是否存在漏检的D抗原，提高输血安全性。
参考文献
[1] 中华人民共和国卫生部.中国输血技术操作规程.天津：天津 科学技术出版社，1997.60一86