【摘 要】 目的：优化阿尔泰金莲花荭草素2″-O-β-L半乳糖苷（OGA）的纤维素酶辅助超声提取工艺。方法：以OGA提取率为考察指标，通过单因素试验考察pH、酶添加量、料液比、提取时间和提取温度对OGA提取率的影响， 进一步采用Box-Behnken中心组合试验及响应面分析优化阿尔泰金莲花OGA的纤维素酶辅助超声提取工艺。结果：最佳提取工艺条件为pH=4、料液比1∶40、超声功率90W、酶添加量1.5%、乙醇浓度48.0%、超声时间38.0 min、超声温度 40 ℃;在此条件下，OGA提取率达到了2.7%以上。结论：该工艺简单高效，可用于荭草素2″-O-β-L半乳糖苷的提取。
　　【关键词】 阿尔泰金莲花;荭草素2″-O-β-L半乳糖苷;响应面法;纤维素酶;提取
　　【中图分类号】R284.2   【文献标志码】 A    【文章编号】1007-8517（2020）18-0052-06
　　
　　Study on Cellulase-Assisted Ultrasonic Extraction of Orientin 2″-O-β-L Galactoside from Trollius altaicus
　　XILIAZHATI Abulimiti1 YAO Yuhan2 ZHAN Yujiao2 WANG Liang2 ZHAO Jun2*
　　1.College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi 830046， China;
　　2. Xinjiang Key Laboratory for Uighur Medicine， Institute of Materia Medica of Xinjiang， Urumqi 830004， China
　　Abstract：Objective To optimize cellulase-assisted ultrasonic extraction technology of Orientin 2″-O-β-L galactoside （OGA） from Trollius altaicus. Methods Taking the extraction rate of OGA as the index， the influence of pH， amount of enzyme， solid-liquid ratio， extraction time， power and temperature on the yield rate of OGA were investigated. Furthermore， the extraction process of OGA was optimized by box-behnken central combination test and response surface analysis. Results The optimum extraction conditions were pH=4， solid-liquid ratio 1∶40， ultrasonic power 90 W， enzyme dosage 1.5%， ethanol concentration 48.0%， ultrasonic time 38.0 min， and ultrasonic temperature 40.0℃. Under these conditions， the extraction rate of OGA was more than 2.7%.Conclusion The process is simple and efficient， and can be used for OGA extraction.
　　Keywords：Trollius Altaicus; Orientin 2″-O-β-L Galactoside; Response Surface Analysis; Cellulase; Extraction
　　阿尔泰金莲花Trollius altaicus是毛茛科金莲花属多年生草本植物，主要分布于我国新疆阿勒泰、塔城地區，具有清热解毒、止血止咳等功效，其干燥花蕾在临床上多用于上呼吸道感染、急慢性咽炎和扁桃体炎等疾病的治疗，收载于《哈萨克药志》等医药文献中[1-2]。黄酮碳苷类化合物是该药材主要特征性化合物，其中以荭草素2″-O-β-L-半乳糖（OGA）的含量最高[3-5]。然而，对该化合物的研究文献报道较少。因此，在前期研究基础上，本实验拟通过Box-Behnken中心组合实验设计优化阿尔泰金莲花OGA的纤维素酶辅助超声提取工艺，为阿尔泰金莲花及其OGA的开发利用提供参考依据。
　　1 仪器与材料
　　1.1 仪器 LC-10ATvp 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）;AL204 型分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）;AS系列超声波清洗机（天津欧特赛恩斯仪器有限公司）;DZKW-S-4电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）;SHB-III 型循环水式多用真空泵（上海知信实验仪器技术有限公司）;ST-02A 型小型粉碎机（永康市帅同工具有限公司）。
　　1.2 材料 阿尔泰金莲花药材于2018年7月采自新疆阿勒泰地区，经新疆药物研究所何江研究员鉴定为阿尔泰金莲花T.altaicus的干燥花蕾，药材粉碎，过40目筛。荭草素2″-O-b-L-半乳糖苷对照品（OGA，上海源叶生物科技有限公司，纯度为98.0%）;纤维素酶（4×105U/g）购自上海如吉生物科技发展有限公司;色谱纯乙腈和甲醇分别购自美国 Fishe公司）;去离子水（乌鲁木齐市雪白真纯净水有限公司）;其他试剂均为国产分析纯。 　　2 方法及结果
　　2.1 阿尔泰金莲花OGA的含量测定
　　2.1.1 色谱条件 色谱柱为Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相为乙腈（A）：0.2%磷酸水溶液（B）;梯度洗脱程序（0 min～10 min～15 min～20 min，15%A～19%A～25%A～15%A）;柱温30℃;流速1.0 mL/min;检测波长345 nm;进样量 10 μL。
　　2.1.2 标准曲线绘制 精密称取OGA对照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇定容，制备成浓度为 0.20 mg/mL 的OGA对照品溶液。精密吸取OGA对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 和5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀。进样10 μL，记录峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），OGA 质量浓度（mg/mL）为横坐标（X），进行线性拟合，得回归方程为 Y=1.690357752×107X+5.02805594×104，R2=0.9999，表明样品在 0.002～0.1 mg/mL浓度范围内对照品色谱峰面积与OGA质量浓度线性关系良好。
　　2.1.3 OGA的含量测定 取一定量阿尔泰金莲花样品，加入一定量的纤维素酶后，加入乙醇溶液，超声提取后，灭酶（沸水浴5 min），过滤，滤液进液相，记录峰面积，计算阿尔泰金莲花OGA提取率（W）。
　　W=C×D×Vm×100%
　　式中：W为 OGA提取率（%）;C为提取液中OGA浓度（mg/mL）;D为溶液稀释倍数;V为提取液体积（mL）;m为药材质量（g）。
　　2.2 单因素考察
　　2.2.1 pH的确定 称取药材5份，每份1.0 g， 其中5份加入1.0%的纤维素酶，另外5份不加酶作为对照。每份样品加入50倍量50%乙醇，以盐酸缓冲液调 pH分别为 3、4、5、6后，于40 ℃功率90 W条件下超理 30 min酶解，灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图1所示，在不同pH条件下，纤维素酶对OGA提取率的影响不同。随着pH的增加，提取率呈现先增后降的趋势、pH为4 时OGA提取率最高，过后逐渐降低，且加纤维素酶的提取率明显高于不加酶的。
　　2.2.2 酶添加量对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%的纤维素酶后，加入50倍量50%乙醇，以盐酸缓冲液调pH为4，于40℃功率90W条件下下超声30 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。从图2可以看出，随着酶添加量的增大，提取率呈增长趋势，当酶添加量为1.5%时，提取率达到最高，大于1.5%后，提取率逐渐降低。
　　2.2.3 料液比对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，每份样品加入1.5% 的纤维素酶后，分别加入料液比为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的50%乙醇，以盐酸缓冲液调 pH为4，于40 ℃功率90 W条件下超声30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图3所示，随着料液比的增大，OGA提取率逐步增大，当料液比为1∶40 时，提取率达到最高值，之后略有下降。
　　2.2.4 乙醇浓度对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，每份样品加入1.5%的纤维素酶后，分别加入50倍量30%、40%、50%、60%、70%乙醇，以盐酸缓冲液调pH为4，于40 ℃功率90 W条件下超声30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图4所示，随着乙醇浓度（30%～50%）的增加，OGA提取率不断增加，当乙醇浓度为50%时，提取率达到最高，随着乙醇浓度的增大，提取率缓慢下降，可能是由于乙醇浓度的增加使提取液中杂质增多，限制了OGA的溶出，致使其提取率下降。
　　2.2.5 超声温度对OGA提取率的影响 称取药材1.0 g 5份，分别向其中加入1.5%的纤维素酶、50倍量50%乙醇，并以盐酸缓冲液调 pH为4，于35、40、45、50、55 ℃，功率为90 W条件下超声处理30 min酶解后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。从图5可以看出，温度为40℃时，OGA提取率最高。温度过高会导致酶变性失活，也会对有效成分造成一定程度的破坏。
　　2.2.6 超声时间对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入1.5%纤维素酶、50倍量50%乙醇，且以盐酸缓冲液调pH为4，于40℃，功率90W条件下超声处理10、20、30、40、50 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。超声时间短会影响酶解效果，时间过长不利于工业化生产，因此选择合适的超声时间对酶发挥最大作用和节约时间有双重作用。从图6可以看出，在超声时间为40 min时，OGA提取率达到最高，之后，随着超声时间的增加，提取率反而呈下降趋势。
　　2.2.7 超声功率对OGA提取率的影响 称取药材5份，每份1.0 g，分别加入1.5%维素酶、50倍量50%乙醇，且以盐酸缓冲液调 pH为4，在40℃功率分别为90、132、174、216、258、300 W条件下超声处理30 min后灭酶，过滤，测定并计算OGA提取率。如图7所示，随着超声功率的增加，OGA提取率整体呈下降趋势，当超声频率为 90 W时，提取率為最高。故选择提取的超声频率为90 W。
　　2.3 响应面试验设计及优化结果 结合单因素试验分析结果，依据Box-Behnken中心组合原理，优化酶辅助超声提取阿尔泰金莲花OGA的提取工艺条件。选择酶添加量、乙醇浓度、超声时间和超声温度四个因素为自变量，每一自变量的试验分别以-1、0、1编码，以OGA提取率（%）为响应值，进行四因素三水平实验，利用Design-Expert 8.05软件对试验多元线性回归和二项式拟合，并对拟合方程进行方差分析。因素水平设计见表1，试验结果见表2。 　　
　　以OGA提取率为指标，通过Design-Expert V 8.05软件对表中试验数据进行多元回归拟合，获得OGA提取率（Y）对酶添加量（A）、乙醇浓度（B）、超声时间（C）和超声温度（D）四因素的二次多项回归模拟方程为：Y=+2.77-0.020×A-0.052×B-0.018×C-0.019×D- 0.015×D-0.042×AB-0.048×AC-5.500E-003×AD+1.250E-003×AD-0.070×BC-8.750E-003×BD+1.667E-003×BD+4.500E-003×CD+0.014×CD-0.063×A2-0.065×B2-0.044×C2。
　　
　　
　　对该模型进行方差分析，结果如表3所示，该回归模型F值0.15，P<0.0001，方程模型达到极显著;决定系数R2=0.9582，校正系数Adj R2=0.8937;失拟项大于0.05，失拟不显著，说明回归方程拟合状态良好;变异系数CV为0.9%，表明模型的重现性很好;因此可以利用此模型优化阿尔泰金莲花OGA的酶辅助超声提取条件。B、C的P值均小于0.01，说明乙醇浓度和提取时间对OGA提取影响极显著。各因素对OGA得率影响大小顺序为B>C>A>D。而AD、BD、CD的P值大于0.05，表明他们之间的作用对OGA提取率没有显著性影响。AB、AC、BC的P值小于0.01，说明酶添加量和乙醇浓度、提取时间，乙醇浓度和提取时间之间有明显的交互作用。不同因子交互作用的响应面分析图如图8所示。通过 Design Expert 8.0.5 软件分析得出阿尔泰金莲花OGA纤维素酶辅助超声提取的最佳工艺条件为：酶添加量1.50%，乙醇浓度48.49%，超声时间38.31 min，超声温度40 ℃;在此工艺条件下，阿尔泰金莲花理论预测提取率为2.81%。
　　2.4 验证试验 为检验响应面法优化后工艺的可靠性以及考虑实验操作的可行性，结合单因素实验结果，将上述提取工艺条件确定为：酶添加量1.50%，乙醇浓度48.0%，超声时间38.0 min，超声温度40.0 ℃。在此条件下，进行3 组平行试验，获得阿尔泰金莲花OGA提取率的均值为（2.79±0.03）%，与理论值的相对误差为0.2%，回归方程的预测值与实际实验值相一致，说明运用响应面法优化得到的模型参数可靠准确，可真实地反映各因素对阿尔泰金莲花OGA提取率的影响。
　　3 讨论
　　阿尔泰金莲花荭草素2″-O-β-L半乳糖苷（OGA）是连接有两个糖的黄酮碳苷类化合物，水溶性较大，故采用低浓度的乙醇就可以将其较好的提取出来。然而乙醇浓度过低，会使过多水溶性杂质也被提取出来，导致其提取率降低;乙醇浓度过高，其溶解性降低，亦会减少提取率。在乙醇浓度为50%左右的提取条件下，提取率最高，验证了这一推断。采用纤维素酶辅助超声波萃取法对OGA进行了提取工艺优化研究。该工艺通过纤维素酶水解破坏阿尔泰金莲花的细胞壁，且在超声作用下，药材中所含黄酮类成分大量渗出，提取液中OGA含量得到较大提高。本研究以单因素实验结果为基础，通过响应面分析优化出阿尔泰金莲花OGA的纤维素酶辅助超声提取工艺，较优工艺条件为：pH为4、料液比1∶40、超声功率90W、酶添加量1.5%、乙醇浓度48.0%、超声时间38.0 min、超声温度40.0 ℃，在此工艺条件下阿尔泰金莲花OGA提取率可达2.7%以上;且该方法简单高效、成本低、易于操作。研究结果可为阿尔泰金莲花及其OGA的深入研究提供基础资料。
　　
　　参考文献
　　[1]中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1979：83.
　　[2]王仁.哈萨克药志（第一册）[M].乌鲁木齐：新疆科学技术出版社，2008，34.
　　[3]朱殿龙，丁万隆，陈士林.金莲花属植物的研究进展[J].世界科学技术中药现代化，2006，8（4）：26-34.
　　[4]宋冬梅，孙启时.阿尔泰金莲花化学成分的研究（Ⅰ）[J].中国药物化学杂志，2004，14（4）：233-235.
　　[5]霍潘峰，滕亮，李倩，等.高速逆流色谱分离纯化阿尔泰金莲花中的活性成分[J].新疆医科大学学报，2017，40（9）：1199-1202.
　　（收稿日期：2020-04-16 编辑：程鹏飞）
　　基金項目：新疆维吾尔自治区自然科学基金项目 （2017D01B44）。
　　作者简介：希力阿扎提·阿不力米提（1994-），男，维吾尔族，硕士，研究方向为中药民族药的研究与开发。E-mail：[email protected]
　　通信作者：赵军（ 1973-）， 男， 汉族， 博士， 研究员，研究方向为中药民族药的研究与开发。E-mail： [email protected]