【摘 要】
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目的 优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件.方法 CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养
【机 构】
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宁夏医科大学临床医学院医学检验系,宁夏银川750004宁夏医科大学总医院儿科,宁夏银川750004;
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目的 优化嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞的体外培养体系及慢病毒侵染条件.方法 CD3磁珠分离纯化健康人外周血单个核细胞(PBMC)及健康孕妇脐带血单个核细胞(UCBMC),于8种不同培养体系进行扩增培养,培养体系包括以下成分的不同组合:重组人白细胞介素2 (rhIL-2)、rhIL-12、rhIL-18、rhIL-7、rhIL-21、TWS119.分别于第0、3、5、7、10、18天进行细胞计数检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)的表达,ELISA检测γ干扰素(IFN-γ)释放,优化T细胞体外培养体系.采用(0、20、50) μg/mL重组人纤连蛋白(RetroNectin(R)),(250、500、1000) ng/mL抗人CD3/CD28抗体包被培养板,以感染复数(MOI)=3、5的阴性对照慢病毒侵染T细胞72 h,于荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白(GFP)表达情况,初步判断病毒侵染效率;流式细胞术检测CD3/GFP阳性率,以获得慢病毒侵染条件.包装CD19 CAR慢病毒,实时荧光定量PCR、Western blot法检测是否成功构建CD19 CAR慢病毒载体,采用以上优化的病毒侵染条件及T细胞培养体系,包括建立rgIL-2、rhIL-12联合rhIL-18培养体系,使用1μg/mL抗人CD3/CD28,20 μg/mL RetroNectin(R)包被培养板,制备CD19 CAR-T细胞.结果 细胞增殖能力较佳体系为rhIL-2联合rhIL-18,IFN-γ释放最强体系为rhIL-2、rhIL-12联合rhIL-18.抗CD3/CD28抗体剂量为1 μg/mL,RetroNectin(R) 20 μg/mL,MOI为3时病毒侵染效率最优.该优化条件下CAR-T细胞阳性率达34％.结论 获得优化的CD19 CAR-T细胞体外培养体系及慢病毒侵染原代T细胞条件.
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