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摘 要：目的：优化卡痛试剂卡玻纤工艺。方法：以卡痛试剂卡阴性质控结果为指标，采用Plackett-Burman设计筛选卡痛试剂卡玻纤体系的主要影响因素;再以阴性质控结果为评价指标，采用 Box-Behnken设计对影响卡痛试剂卡阴性质控结果的主要因素进一步优化，对实验数据进行多元线性回归、二项式拟合，分析预测最佳工艺。结果：卡痛试剂卡玻纤体系的最佳工艺条件为：Na2HPO4添加量为0.05M，Chemal LA-9添加量为8.74g/L，pH7.0。结论：采用Plackett-Burman和Box-Behnken设计法优化卡痛试剂卡科学合理，优选的工艺稳定可靠，为卡痛试剂卡的工业化生产提供了可靠依据。
关键词：卡痛;胶体金;Plackett-Burman试验;Box-Behnken试验
卡痛（Kratom）叶为茜草科的热带常绿树[1]，原生于泰国、马来西亚、印度尼西亚、缅甸等东南亚国家，其主要成分为生物碱帽柱木碱和7-羟基帽柱木碱[2]。其中主要成分帽柱木碱为白色无定形粉末，分子式为C23H30N2O4，熔点102～106℃，沸点230～240℃，旋光度[ɑ]D+39°（氯仿），可溶于乙醇、氯仿和醋酸，对离体组织有抑制作用，还具有避部麻醉作用。人体内帽柱木碱的代谢是通过侧链酯的水解、甲氧基的去甲基化、氧化和/或还原转化以及葡萄糖醛酸和硫酸盐偶联的形成来实现的。这种生物碱的结构和致幻剂结构相似，但无致幻剂的活性，常用来阻止或缓解阿片类药物依赖患者的戒断症状，或被用于降低对阿片类药物的依赖[3-6]。除此之外，由于卡痛叶的延缓戒断综合征作用，其也有一定的被滥用为毒品的风险。目前，帽柱木堿和7-羟基帽柱木碱已被多个国家列为受管制物质，因此，卡痛检测试剂卡的研制开发具有重要的现实意义和市场需求。
毒品及毒品犯罪作为我国严厉打击的对象，一直以来，深受国家重视，而毒品快速检测方法的开发对于毒品打击有至关重要的作用，尤其是新型毒品的检测方法的开发，对于识别判定毒品流入，加强市场管控有重要意义[7]。
毒品检测方法多样，其中免疫层析技术的引入，对现场毒品检测方法的发展有重要作用，运用免疫法制造的各种免疫试剂盒等能够实现产品大规模商品化生产，且制作成本较低，操作简便快速，便于实现毒品的现场初筛检测[8]。
本研究采用胶体金免疫层析技术，运用Plackett-Burman试验和Box-Behnken[9]试验的方法，以卡痛试剂卡阴性质控结果为考察指标，对卡痛试剂卡玻纤体系进行优化，得到最优卡痛检测试剂卡玻纤方案。
1.材料与方法
1.1 实验材料和仪器
1.1.1 实验材料
帽柱木碱：购于Cerilliant;柠檬酸三钠、K2CO3为常规分析纯试剂;牛血清蛋白帽柱木碱偶联物：杭州傲锐生物医药科技有限公司;鼠抗帽柱木碱单克隆抗体：杭州傲锐生物医药科技有限公司;羊抗兔IgG：杭州傲锐生物医药科技有限公司;兔IgG：杭州傲锐生物医药科技有限公司;氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC膜）、样品吸收垫、PVC底板、吸水垫等均为杭州奥泰生物技术股份有限公司提供;
1.1.2 实验仪器
三维XYZ3000 点膜仪，由Bio-Dot 公司提供;3H16R1高速冷冻离心机，由长沙湘智离心机仪器有限公司提供;AutoKun HG5510金标机，由杭州峰航科技提供;电热鼓风干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司提供;全自动切条机：上海金标生物科技有限公司;85-2 型恒温磁力搅拌器：上海志威电器有限公司;奥瑞德分析仪，杭州奥泰生物技术股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 卡痛试剂卡的检测
取3滴（约40?L）阴性质控或者阳性质控加入到试剂卡加样窗口中，5min后采用奥瑞德分析仪读取试剂卡的线条强度。
1.2.2 Plackett-Burman实验设计
对缓冲剂的添加量，PH，烘制温度，烘制时间和活性剂的添加量等5个因素进行考察，每个因素取低水平和高水平，另设一个空项列，以卡痛试剂卡阴性质控响应值为考察指标，设计N=12的Plackett-Burman实验。
1.2.3 Box-Behnken实验设计
在Plackett-Burman实验结果的基础上，以卡痛阴性质控响应值作为考察指标，选取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal LA-9添加量）等三个因素为自变量，根据Box-Behnken设计原理，做三因素三水平的响应面试验。
2 结果与分析
2.1 卡痛试剂卡质控检测结果的判读
采用奥瑞德分析仪对不同质控色卡进行读数，质控色卡的线条强度越弱，分析仪上响应值越弱，其关系曲线如图1所示，质控色卡的线条强度与分析仪响应值曲线有较好的拟合度（R2=0.9917）。
2.2Plackett-Burman实验设计及结果
缓冲剂的添加量，pH，烘制温度，烘制时间和活性剂的添加量等5个因素进行考察，每个因素取低水平和高水平，另设一个空项列，以卡痛试剂卡阴性质控响应值为考察指标，设计N=12的Plackett-Burman实验。其中A为Na2HPO4添加量，B为pH值，C为玻纤烘制温度，D为玻纤烘制时间，E为Chemal LA-9添加量。
利用MINITAB15对Plackett-Burman的实验数据进行统计分析，结果如表2所示，其标准偏差为2.11021，R2为93.68%，调整后R2为86.09%。其中两个因素Na2HPO4添加量和Chemal LA-9添加量对结果的有显著影响（P<0.05），pH值对结果有极显著影响（P<0.01），此三个因素均可作为进一步优化因素。其他因素对结果影响不大，对影响效果不进行分析。 2.3Box-Behnken实验设计及结果
根据Plackett-Burman实验结果，以卡痛阴性质控响应值作为考察指标，选取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal LA-9添加量）三个因素为自变量，根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平的响应面方法进行分析，每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。Box-Behnken设计及结果见表3。
实验数据采用MINITAB15软件进行统计分析，得到自变量相对于结果的回归方程，标准差为1.19245，R2为97.00%，R2Adj为91.60%，表明模型的相关性和解释度都很好。方差分析的结果表4表明，模型P值小于0.01（模型极显著），失拟项P值为0.138不显著，说明方程不失拟，所选模型合适。因此该Box-Behnken试验设计可靠，模型可以应用于卡痛试剂卡玻纤体系优化的理论预测。在该模型中，回归系数的显著性检验显示一次项A，一次项B和平方项B2达到显著水平;平方项A2的影响达到极显著水平;3个因素对卡痛试剂卡结果影响大小的排序为：B>A>C。各因素交互作用对卡痛试剂卡阴性质控结果影响的响应面如图2所示。
2.4卡痛试剂卡最佳玻纤工艺验证
运用MINITAB15响应优化器，可以得出，最优的玻纤方案是，Na2HPO4添加量为0.05M，Chemal LA-9添加量为8.74g/L，PH值为7.0时，理论方案达到最优为485.51mV。在此条件下进行3次平行验证实验，取平均值，实际测卡痛试剂卡阴性质控响应值为为480.44mV，实际值与预测值相对误差为1.04%，说明采用Box-Behnken试验优化得到的工艺参数准确可靠，有实际应用价值。
3结论
卡痛是一种新型阿片替代物类毒品，具有一定的成瘾性。本研究先从缓冲剂和活化剂类型的选择对卡痛试剂卡阴性质控结果影响方面考察，联和采用Plackett-Burman试验和Box-Behnken试验的方法，建立了卡痛试剂卡玻纤体系的多项式模型，经显著性检验分析和响应面分析，其最佳工艺参数为Na2HPO4添加量为0.05M，Chemal LA-9添加量为8.74g/L，pH7.0，获得卡痛试剂卡阴性质控结果的理论值为485.51mV。经验证实际值为480.44mV，证明该模型准确可靠。该研究为今后对此卡痛试剂卡开发研究奠定了基础，同时也为卡痛试剂卡的工业化制备和应用提供理论参考。
参考文献
[1] 卡痛叶[J].大自然探索，2017，（6）：73.
[2] Charles Veltri，Oliver Grundmann.Current perspectives on the impact of Kratom use[J].Substance Abuse and Rehabilitation，2019，（10）：23-31.
[3] C Michael White.Pharmacologic and clinical assessment of kratom：An update.[J].American journal of health-system pharmacy：AJHP：official journal of the American Society of Health-System Pharmacists，2019，（0）.
[4] Khadija Tayabali，Colin Bolzon，Paul Foster，Janki Patel，Mohammad Omar Kalim.Kratom：a dangerous player in the opioid crisis[J].Journal of community hospital internal medicine perspectives，2018，（3）：107-110.
[5] Dimy Fluyau，Neelambika Revadigar.Biochemical Benefits，Diagnosis，and Clinical Risks Evaluation of Kratom[J].Frontiers in Psychiatry，2017，（8）.
[6] Meyer，David.Opioid Alternative Kratom Is Actually an Opioid Itself，FDA Warns.[J].Fortune.com，2018，：26.
[7] 宮学勤.毒品现场快速检测方法的应用，法制沙龙，2016，（4）：116.
[8] 张亚海，周文华.阿片类类毒品常用检测方法及评价[J].中国药物滥用防治杂志，2005，5.
[9] 马逢时.六西格玛管理统计指南：MINITAB使用指导[M].北京：中国人民大学出版社，2008.
关键词：卡痛;胶体金;Plackett-Burman试验;Box-Behnken试验
卡痛（Kratom）叶为茜草科的热带常绿树[1]，原生于泰国、马来西亚、印度尼西亚、缅甸等东南亚国家，其主要成分为生物碱帽柱木碱和7-羟基帽柱木碱[2]。其中主要成分帽柱木碱为白色无定形粉末，分子式为C23H30N2O4，熔点102～106℃，沸点230～240℃，旋光度[ɑ]D+39°（氯仿），可溶于乙醇、氯仿和醋酸，对离体组织有抑制作用，还具有避部麻醉作用。人体内帽柱木碱的代谢是通过侧链酯的水解、甲氧基的去甲基化、氧化和/或还原转化以及葡萄糖醛酸和硫酸盐偶联的形成来实现的。这种生物碱的结构和致幻剂结构相似，但无致幻剂的活性，常用来阻止或缓解阿片类药物依赖患者的戒断症状，或被用于降低对阿片类药物的依赖[3-6]。除此之外，由于卡痛叶的延缓戒断综合征作用，其也有一定的被滥用为毒品的风险。目前，帽柱木堿和7-羟基帽柱木碱已被多个国家列为受管制物质，因此，卡痛检测试剂卡的研制开发具有重要的现实意义和市场需求。
毒品及毒品犯罪作为我国严厉打击的对象，一直以来，深受国家重视，而毒品快速检测方法的开发对于毒品打击有至关重要的作用，尤其是新型毒品的检测方法的开发，对于识别判定毒品流入，加强市场管控有重要意义[7]。
毒品检测方法多样，其中免疫层析技术的引入，对现场毒品检测方法的发展有重要作用，运用免疫法制造的各种免疫试剂盒等能够实现产品大规模商品化生产，且制作成本较低，操作简便快速，便于实现毒品的现场初筛检测[8]。
本研究采用胶体金免疫层析技术，运用Plackett-Burman试验和Box-Behnken[9]试验的方法，以卡痛试剂卡阴性质控结果为考察指标，对卡痛试剂卡玻纤体系进行优化，得到最优卡痛检测试剂卡玻纤方案。
1.材料与方法
1.1 实验材料和仪器
1.1.1 实验材料
帽柱木碱：购于Cerilliant;柠檬酸三钠、K2CO3为常规分析纯试剂;牛血清蛋白帽柱木碱偶联物：杭州傲锐生物医药科技有限公司;鼠抗帽柱木碱单克隆抗体：杭州傲锐生物医药科技有限公司;羊抗兔IgG：杭州傲锐生物医药科技有限公司;兔IgG：杭州傲锐生物医药科技有限公司;氯金酸、牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）玻璃纤维、硝酸纤维素膜（NC膜）、样品吸收垫、PVC底板、吸水垫等均为杭州奥泰生物技术股份有限公司提供;
1.1.2 实验仪器
三维XYZ3000 点膜仪，由Bio-Dot 公司提供;3H16R1高速冷冻离心机，由长沙湘智离心机仪器有限公司提供;AutoKun HG5510金标机，由杭州峰航科技提供;电热鼓风干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司提供;全自动切条机：上海金标生物科技有限公司;85-2 型恒温磁力搅拌器：上海志威电器有限公司;奥瑞德分析仪，杭州奥泰生物技术股份有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 卡痛试剂卡的检测
取3滴（约40?L）阴性质控或者阳性质控加入到试剂卡加样窗口中，5min后采用奥瑞德分析仪读取试剂卡的线条强度。
1.2.2 Plackett-Burman实验设计
对缓冲剂的添加量，PH，烘制温度，烘制时间和活性剂的添加量等5个因素进行考察，每个因素取低水平和高水平，另设一个空项列，以卡痛试剂卡阴性质控响应值为考察指标，设计N=12的Plackett-Burman实验。
1.2.3 Box-Behnken实验设计
在Plackett-Burman实验结果的基础上，以卡痛阴性质控响应值作为考察指标，选取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal LA-9添加量）等三个因素为自变量，根据Box-Behnken设计原理，做三因素三水平的响应面试验。
2 结果与分析
2.1 卡痛试剂卡质控检测结果的判读
采用奥瑞德分析仪对不同质控色卡进行读数，质控色卡的线条强度越弱，分析仪上响应值越弱，其关系曲线如图1所示，质控色卡的线条强度与分析仪响应值曲线有较好的拟合度（R2=0.9917）。
2.2Plackett-Burman实验设计及结果
缓冲剂的添加量，pH，烘制温度，烘制时间和活性剂的添加量等5个因素进行考察，每个因素取低水平和高水平，另设一个空项列，以卡痛试剂卡阴性质控响应值为考察指标，设计N=12的Plackett-Burman实验。其中A为Na2HPO4添加量，B为pH值，C为玻纤烘制温度，D为玻纤烘制时间，E为Chemal LA-9添加量。
利用MINITAB15对Plackett-Burman的实验数据进行统计分析，结果如表2所示，其标准偏差为2.11021，R2为93.68%，调整后R2为86.09%。其中两个因素Na2HPO4添加量和Chemal LA-9添加量对结果的有显著影响（P<0.05），pH值对结果有极显著影响（P<0.01），此三个因素均可作为进一步优化因素。其他因素对结果影响不大，对影响效果不进行分析。 2.3Box-Behnken实验设计及结果
根据Plackett-Burman实验结果，以卡痛阴性质控响应值作为考察指标，选取因素A（Na2HPO4添加量），因素B（pH值），因素C（Chemal LA-9添加量）三个因素为自变量，根据Box-Behnken设计原理，采用三因素三水平的响应面方法进行分析，每个自变量的低、中、高实验水平分别以-1、0、1进行编码。Box-Behnken设计及结果见表3。
实验数据采用MINITAB15软件进行统计分析，得到自变量相对于结果的回归方程，标准差为1.19245，R2为97.00%，R2Adj为91.60%，表明模型的相关性和解释度都很好。方差分析的结果表4表明，模型P值小于0.01（模型极显著），失拟项P值为0.138不显著，说明方程不失拟，所选模型合适。因此该Box-Behnken试验设计可靠，模型可以应用于卡痛试剂卡玻纤体系优化的理论预测。在该模型中，回归系数的显著性检验显示一次项A，一次项B和平方项B2达到显著水平;平方项A2的影响达到极显著水平;3个因素对卡痛试剂卡结果影响大小的排序为：B>A>C。各因素交互作用对卡痛试剂卡阴性质控结果影响的响应面如图2所示。
2.4卡痛试剂卡最佳玻纤工艺验证
运用MINITAB15响应优化器，可以得出，最优的玻纤方案是，Na2HPO4添加量为0.05M，Chemal LA-9添加量为8.74g/L，PH值为7.0时，理论方案达到最优为485.51mV。在此条件下进行3次平行验证实验，取平均值，实际测卡痛试剂卡阴性质控响应值为为480.44mV，实际值与预测值相对误差为1.04%，说明采用Box-Behnken试验优化得到的工艺参数准确可靠，有实际应用价值。
3结论
卡痛是一种新型阿片替代物类毒品，具有一定的成瘾性。本研究先从缓冲剂和活化剂类型的选择对卡痛试剂卡阴性质控结果影响方面考察，联和采用Plackett-Burman试验和Box-Behnken试验的方法，建立了卡痛试剂卡玻纤体系的多项式模型，经显著性检验分析和响应面分析，其最佳工艺参数为Na2HPO4添加量为0.05M，Chemal LA-9添加量为8.74g/L，pH7.0，获得卡痛试剂卡阴性质控结果的理论值为485.51mV。经验证实际值为480.44mV，证明该模型准确可靠。该研究为今后对此卡痛试剂卡开发研究奠定了基础，同时也为卡痛试剂卡的工业化制备和应用提供理论参考。
参考文献
[1] 卡痛叶[J].大自然探索，2017，（6）：73.
[2] Charles Veltri，Oliver Grundmann.Current perspectives on the impact of Kratom use[J].Substance Abuse and Rehabilitation，2019，（10）：23-31.
[3] C Michael White.Pharmacologic and clinical assessment of kratom：An update.[J].American journal of health-system pharmacy：AJHP：official journal of the American Society of Health-System Pharmacists，2019，（0）.
[4] Khadija Tayabali，Colin Bolzon，Paul Foster，Janki Patel，Mohammad Omar Kalim.Kratom：a dangerous player in the opioid crisis[J].Journal of community hospital internal medicine perspectives，2018，（3）：107-110.
[5] Dimy Fluyau，Neelambika Revadigar.Biochemical Benefits，Diagnosis，and Clinical Risks Evaluation of Kratom[J].Frontiers in Psychiatry，2017，（8）.
[6] Meyer，David.Opioid Alternative Kratom Is Actually an Opioid Itself，FDA Warns.[J].Fortune.com，2018，：26.
[7] 宮学勤.毒品现场快速检测方法的应用，法制沙龙，2016，（4）：116.
[8] 张亚海，周文华.阿片类类毒品常用检测方法及评价[J].中国药物滥用防治杂志，2005，5.
[9] 马逢时.六西格玛管理统计指南：MINITAB使用指导[M].北京：中国人民大学出版社，2008.