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摘 要：
以富含90%±2%纯度聚磷菌（PAOs）的强化生物除磷系统（EBPR）为研究对象，考察了10℃厌氧、10℃好氧、20℃厌氧、20℃好氧4种运行条件下PAOs的衰减特征。结果表明：温度越高对应衰减速率越快，4个系统在1～9 d里衰减速率的平均值分别为：10℃厌氧：0.053/d；10℃好氧：0.050/d；20℃厌氧：0.072/d；20℃好氧：0.145/d。其中4个系统由于细胞死亡引起的活性衰减速率分别为：10℃厌氧：0.019/d；10℃好氧：0.017/d；20℃厌氧：0.019/d；20℃好氧：0.03/d，占总活性衰减的比例分别为：35.8%、34%、26.4%、20.7%。在9 d饥饿衰减期间，污泥中所含PHA与糖原的量总体呈下降趋势。相同温度下，糖原在厌氧衰减过程中降解速率大于好氧；在同样的厌氧、好氧衰减条件下，温度越高糖原降解速率越快。
关键词：聚磷菌；强化生物除磷；衰减速率；LIVE/DEAD染色；聚羟基烷酸；糖原
中图分类号：X703.1 文献标志码：A
文章编号：16744764（2013）02011305
强化生物除磷技术（Enhanced Biological Phosphorus Removal，简称EBPR）已成为生物除磷的重要途径，日益受到学者们的关注。EBPR是以富集的聚磷菌（PAOs）在厌氧条件下吸收VFA用于细胞内合成PHA并且释放磷，好氧条件下分解PHA提供能量同时过量吸磷，通过排泥达到除磷的目的[1]。EBPR的设计大多是以ASM2号模型为基础，PAOs衰减速率作为模型中最重要的参数之一，获得其准确的数值对建立完善、实用的数学模型具有重要意义，同时对EBPR生物处理过程的设计和运行管理、控制策略也具有借鉴意义[24]。水温的变化对于微生物衰减速率有重要的影响[5]，在实际污水处理厂运行过程中主要面临的问题也是季节温差变化较大，尤其是中国北方大部分地区水温波动较大。目前对于EBPR系统衰减特征的研究主要是环境温度恒定在20℃左右，Lu等[6]采用PAOs纯度达到85%的EBPR系统为研究对象，考察了22℃条件下PAOs在厌氧、缺氧、好氧的衰减过程，Hao等[7]考察了同样是恒定环境温度在22±0.5℃的条件下PAOs和聚糖菌（GAOs）好氧条件下的衰减特征，而目前对于低温下PAOs的衰减特征的研究未见报道。所以本文采用已运行340 d的EBPR系统内种泥，考察不同温度对PAOs在厌氧和好氧条件下的衰减特性，并结合现代分子生物学的手段鉴定分析细胞死亡引起的数量衰减所占比例[8]。
苗志加，等：不同温度及厌氧/好氧运行条件对聚磷菌衰减特性的影响
1 材料与方法
1.1 衰减速率试验装置及运行方式
衰减速率试验在3 L抽滤瓶中进行，取已富集PAOs浓度达到90%以上的EBPR系统内好氧结束时刻的种泥，持续曝气5 h后平均分装在4个小试反应器内，加入不含碳源的配水定容为2 L，采用磁力搅拌器进行搅拌，其转速为100 r·min-1。1#，2#反应器放置在10℃恒温培养箱，3#、4#放置在20℃恒温培养箱。1#、3#为厌氧条件，试验过程中曝氮气以保证厌氧环境。2#、4#为好氧条件，控制空气流量为0.1 m3/h保证溶解氧在2.0以上。
4个反应器分别在第0、0.5、1、3、5、7、9 d取250 mL泥水混合物，6 000转离心5 min，用配水清洗2遍离心后放入500 mL锥形瓶中，加入0.127 5 g乙酸钠（200 mgCOD），配水补足500 mL，厌氧搅拌1 h，测定期间的磷释放速率。在运行的9 d内每天取泥样，测污泥浓度、PHA、糖原的变化。
1.2 试验水质
配水配方如下[9]：NH4Cl 1.02 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.20 g·L-1，CaCl2·2 H2O 0.19 g·L-1，ATU（硝化抑制剂） 7.94 mg·L-1，微量元素溶液4 ml·L-1，其中微量金属元素成分为： FeCl3·6H2O 1.5 g·L-1，H3BO3 0.15 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.03 g·L-1，KI 0.18 g·L-1，MnCl2·4H2O 0.12 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.06 g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.12 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.15 g·L-1，乙二胺四乙酸（EDTA）10 g·L-1。4个反应器内加入Trisbuffer使系统维持pH值稳定在7.5左右。
1.3 试验种泥
试验种泥采用已乙酸/丙酸交替运行340 d的EBPR系统内污泥，通过荧光原位杂交（FISH）结果分析，其PAOs的纯度高达90%±2，污泥龄（SRT）：10 d。
1.4 LIVE/DEAD 活死细胞鉴定
1.4.1 常规检测方法 实验所用常规检测方法见水和废水监测分析方法（第4版）[10]。PHA及其组分采用气相色谱法[11]；VFA采用气相色谱法。
1.4.2 LIVE/DEAD活死细胞鉴定 采用LIVE/DEADR BacLightTM（moleculer probes，L7012）试剂盒测定第0、0.5、1、3、5、7、9 d的泥样中活死细胞的变化情况。该试剂包括绿荧光核酸染料SYTOR9和红色荧光染料PI（propidium iodide）2中荧光染料，与待测样品孕育一定时间后，具有完整细胞壁的活细胞显绿色，细胞壁已经破损的的死细胞显红色。
染色步骤对试剂盒的方法进行了优化，每次取待测泥样15 mL，去离子水清洗1遍后离心后倒去上清液，采用0.85%的NaCl浸泡1 h，期间隔10 min上下颠倒一次。取1 mL经预处理的泥样与2 mL离心管内，分别加入0.5 μL 的SYTOR9 和05 μL 的PI染料，混合均匀后在暗处放置15 min，期间上下混匀2～3次。取10 μL已染色的泥样制作玻片，在荧光显微镜下观测拍照30组照片。同一视野内照红绿两组荧光照片，通过AxioVision软件对照片做灰度分析并结合IPP软件的计数分析，得出绿色和红色荧光所占的比例，即活死细胞所占的比例。 3 结 论
1） 考察了在10、20℃条件下PAOs厌氧、好氧衰减速率，结果表明温度越高衰减速率越明显。在初始阶段由于种泥中一部分颗粒污泥破碎，4个系统在衰减1 d后释磷活性反而升高，在1～9 d里释磷速率逐渐下降，其平均值分别为：1#（10℃厌氧）：0.053/d；2#（10℃好氧）：0.050/d；3#（20℃厌氧）：0.072/d；4#（20℃好氧）：0.145/d。
2） 通过LIVE/DEAD试剂盒鉴定0～9 d衰减期内细胞的活性，测得4个衰减系统内由细胞死亡所引起衰减速率为：10℃厌氧：0.019/d；10℃好氧：0.017/d；20℃厌氧：0.019/d；20℃好氧：0.03/d，温度越高细胞死亡引起的活性衰减占总活性衰减比例越低，其比例分别为：35.8%、34%、26.4%、20.7%。
3） 在10、20℃温度条件下的厌氧、好氧衰减的4个系统中，细胞内所贮存的PHA与糖原被分解用来提供能量，在9 d衰减过程中其浓度总体均呈现下降趋势。相同温度下，糖原在厌氧衰减过程中降解速率大于好氧；在同样的厌氧、好氧衰减条件下，温度越高糖原降解速率越快。
参考文献：
[1]Barat R，Montoya T，Seco A.Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems [J].Water Research，2011，45（12）：37443752.
[2]Zhang T，Zhang D J，Li Z L.Evaluating the structural identifiability of the parameters of the EBPR submodel in ASM 2 d by the differential algebra method [J].Water Research，2010，44（9）：28152822.
[3]Oehmen A，CarvalhoG，Lopez V.Incorporating microbial ecology into the metabolic modelling of polyphosphate accumulating organisms and glycogen accumulating organisms [J].Water Research，2010，44（17）：49925004.
[4]Trutnau M，Petzold M，Mehlig L.Using a carbonbased ASM3 EAWAG BioP for modelling the enhanced biological phosphorus removal in anaerobic/aerobic activated sludge systems [J].Bioprocess and Biosystems Engineering，2011，34（3）：287295.
[5]Hao X D，Wang Q L，Cao Y L.Evaluating sludge minimization caused by predation and viral infection based on the extended activated sludge model No. 2 d [J].Water Research，2011，45（16）：51305140.
[6]Lu H B，Keller J，Yuan Z G.Endogenous metabolism of Candidatus Accumulibacter phosphatis under various starvation conditions [J].Water Research，2007，41（20）：46464656.
[7]Hao X D，Wang Q L，Cao Y L.Experimental evaluation of decrease in the activities of polyphosphate/glycogenaccumulating organisms due to cell death and activity decay in activated sludge [J].Biotechnology and Bioengineering，2010，106（3）：399407.
[8]Hao X D，Wang Q L，Zhang X P.Experimental evaluation of decrease in bacterial activity due to cell death and activity decay in activated sludge [J].Water Research，2009，43（14）：36043612.
[9]Lu H B，Oehmen A，Virdis B，et al.Obtaining highly enriched cultures of Candidatus Accumulibacter phosphates through alternating carbon sources [J].Water Research，2006，40（20）：38383848.
[10]国家环保护局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法[M].北京：中国环境科学出版社，2002：252354.
[11]Oehmen A，Keller L B，Zeng R J， et al.Optimisation of polybetahydroxyalkanoate analysis using gas chromatography for enhanced biological phosphorus removal [J].Journal of Chromatography A，2005，1070（1/2）：131136. [12]Lesouef A，Payraydeau M，Rogalla F，et al.Optimizing nitrogen removal reactor configuration by onsite calibration of the IAWPRC activated sludge model [J].Water Science and Technology，1992，25（6）：105123.
[13]Siegrist H，Brunner I，Koch G.Reduction of biomass decay rate under anoxic and anaerobic conditions [J].Water Science and Technology，1999，39（1）：129137.
[14]Gujer W，Henze M，Mino T.Activated sludge model No. 3 [J].Water Science and Technology，1999， 39 （1）：183193.
[15]Lavallee B，Lessard P，Besser C.Decay rate variability of active heterotrophic biomass [J].Water Science and Technology，2002，46（1/2）：423430.
[16]Temmink H，Petersen B，Isaacs S.Recovery of biological phosphorus removal after periods of low organic loading [J].Water Science and Technology，1996，34（1/2）：18.
[17]Lopez C，Pons M N，Morgenroth E.Endogenous processes during longterm starvation in activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal [J].Water Research，2006，40（8）：15191530.
[18]Lopez C M，Oehmen A，Hooijmans C M.Modeling the PAOGAO competition： Effects of carbon source， pH and temperature [J].Water Research，2009，43（2）：450462.
（编辑 王秀玲）
以富含90%±2%纯度聚磷菌（PAOs）的强化生物除磷系统（EBPR）为研究对象，考察了10℃厌氧、10℃好氧、20℃厌氧、20℃好氧4种运行条件下PAOs的衰减特征。结果表明：温度越高对应衰减速率越快，4个系统在1～9 d里衰减速率的平均值分别为：10℃厌氧：0.053/d；10℃好氧：0.050/d；20℃厌氧：0.072/d；20℃好氧：0.145/d。其中4个系统由于细胞死亡引起的活性衰减速率分别为：10℃厌氧：0.019/d；10℃好氧：0.017/d；20℃厌氧：0.019/d；20℃好氧：0.03/d，占总活性衰减的比例分别为：35.8%、34%、26.4%、20.7%。在9 d饥饿衰减期间，污泥中所含PHA与糖原的量总体呈下降趋势。相同温度下，糖原在厌氧衰减过程中降解速率大于好氧；在同样的厌氧、好氧衰减条件下，温度越高糖原降解速率越快。
关键词：聚磷菌；强化生物除磷；衰减速率；LIVE/DEAD染色；聚羟基烷酸；糖原
中图分类号：X703.1 文献标志码：A
文章编号：16744764（2013）02011305
强化生物除磷技术（Enhanced Biological Phosphorus Removal，简称EBPR）已成为生物除磷的重要途径，日益受到学者们的关注。EBPR是以富集的聚磷菌（PAOs）在厌氧条件下吸收VFA用于细胞内合成PHA并且释放磷，好氧条件下分解PHA提供能量同时过量吸磷，通过排泥达到除磷的目的[1]。EBPR的设计大多是以ASM2号模型为基础，PAOs衰减速率作为模型中最重要的参数之一，获得其准确的数值对建立完善、实用的数学模型具有重要意义，同时对EBPR生物处理过程的设计和运行管理、控制策略也具有借鉴意义[24]。水温的变化对于微生物衰减速率有重要的影响[5]，在实际污水处理厂运行过程中主要面临的问题也是季节温差变化较大，尤其是中国北方大部分地区水温波动较大。目前对于EBPR系统衰减特征的研究主要是环境温度恒定在20℃左右，Lu等[6]采用PAOs纯度达到85%的EBPR系统为研究对象，考察了22℃条件下PAOs在厌氧、缺氧、好氧的衰减过程，Hao等[7]考察了同样是恒定环境温度在22±0.5℃的条件下PAOs和聚糖菌（GAOs）好氧条件下的衰减特征，而目前对于低温下PAOs的衰减特征的研究未见报道。所以本文采用已运行340 d的EBPR系统内种泥，考察不同温度对PAOs在厌氧和好氧条件下的衰减特性，并结合现代分子生物学的手段鉴定分析细胞死亡引起的数量衰减所占比例[8]。
苗志加，等：不同温度及厌氧/好氧运行条件对聚磷菌衰减特性的影响
1 材料与方法
1.1 衰减速率试验装置及运行方式
衰减速率试验在3 L抽滤瓶中进行，取已富集PAOs浓度达到90%以上的EBPR系统内好氧结束时刻的种泥，持续曝气5 h后平均分装在4个小试反应器内，加入不含碳源的配水定容为2 L，采用磁力搅拌器进行搅拌，其转速为100 r·min-1。1#，2#反应器放置在10℃恒温培养箱，3#、4#放置在20℃恒温培养箱。1#、3#为厌氧条件，试验过程中曝氮气以保证厌氧环境。2#、4#为好氧条件，控制空气流量为0.1 m3/h保证溶解氧在2.0以上。
4个反应器分别在第0、0.5、1、3、5、7、9 d取250 mL泥水混合物，6 000转离心5 min，用配水清洗2遍离心后放入500 mL锥形瓶中，加入0.127 5 g乙酸钠（200 mgCOD），配水补足500 mL，厌氧搅拌1 h，测定期间的磷释放速率。在运行的9 d内每天取泥样，测污泥浓度、PHA、糖原的变化。
1.2 试验水质
配水配方如下[9]：NH4Cl 1.02 g·L-1，MgSO4·7H2O 1.20 g·L-1，CaCl2·2 H2O 0.19 g·L-1，ATU（硝化抑制剂） 7.94 mg·L-1，微量元素溶液4 ml·L-1，其中微量金属元素成分为： FeCl3·6H2O 1.5 g·L-1，H3BO3 0.15 g·L-1，CuSO4·5H2O 0.03 g·L-1，KI 0.18 g·L-1，MnCl2·4H2O 0.12 g·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.06 g·L-1，ZnSO4·7H2O 0.12 g·L-1，CoCl2·6H2O 0.15 g·L-1，乙二胺四乙酸（EDTA）10 g·L-1。4个反应器内加入Trisbuffer使系统维持pH值稳定在7.5左右。
1.3 试验种泥
试验种泥采用已乙酸/丙酸交替运行340 d的EBPR系统内污泥，通过荧光原位杂交（FISH）结果分析，其PAOs的纯度高达90%±2，污泥龄（SRT）：10 d。
1.4 LIVE/DEAD 活死细胞鉴定
1.4.1 常规检测方法 实验所用常规检测方法见水和废水监测分析方法（第4版）[10]。PHA及其组分采用气相色谱法[11]；VFA采用气相色谱法。
1.4.2 LIVE/DEAD活死细胞鉴定 采用LIVE/DEADR BacLightTM（moleculer probes，L7012）试剂盒测定第0、0.5、1、3、5、7、9 d的泥样中活死细胞的变化情况。该试剂包括绿荧光核酸染料SYTOR9和红色荧光染料PI（propidium iodide）2中荧光染料，与待测样品孕育一定时间后，具有完整细胞壁的活细胞显绿色，细胞壁已经破损的的死细胞显红色。
染色步骤对试剂盒的方法进行了优化，每次取待测泥样15 mL，去离子水清洗1遍后离心后倒去上清液，采用0.85%的NaCl浸泡1 h，期间隔10 min上下颠倒一次。取1 mL经预处理的泥样与2 mL离心管内，分别加入0.5 μL 的SYTOR9 和05 μL 的PI染料，混合均匀后在暗处放置15 min，期间上下混匀2～3次。取10 μL已染色的泥样制作玻片，在荧光显微镜下观测拍照30组照片。同一视野内照红绿两组荧光照片，通过AxioVision软件对照片做灰度分析并结合IPP软件的计数分析，得出绿色和红色荧光所占的比例，即活死细胞所占的比例。 3 结 论
1） 考察了在10、20℃条件下PAOs厌氧、好氧衰减速率，结果表明温度越高衰减速率越明显。在初始阶段由于种泥中一部分颗粒污泥破碎，4个系统在衰减1 d后释磷活性反而升高，在1～9 d里释磷速率逐渐下降，其平均值分别为：1#（10℃厌氧）：0.053/d；2#（10℃好氧）：0.050/d；3#（20℃厌氧）：0.072/d；4#（20℃好氧）：0.145/d。
2） 通过LIVE/DEAD试剂盒鉴定0～9 d衰减期内细胞的活性，测得4个衰减系统内由细胞死亡所引起衰减速率为：10℃厌氧：0.019/d；10℃好氧：0.017/d；20℃厌氧：0.019/d；20℃好氧：0.03/d，温度越高细胞死亡引起的活性衰减占总活性衰减比例越低，其比例分别为：35.8%、34%、26.4%、20.7%。
3） 在10、20℃温度条件下的厌氧、好氧衰减的4个系统中，细胞内所贮存的PHA与糖原被分解用来提供能量，在9 d衰减过程中其浓度总体均呈现下降趋势。相同温度下，糖原在厌氧衰减过程中降解速率大于好氧；在同样的厌氧、好氧衰减条件下，温度越高糖原降解速率越快。
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[1]Barat R，Montoya T，Seco A.Modelling biological and chemically induced precipitation of calcium phosphate in enhanced biological phosphorus removal systems [J].Water Research，2011，45（12）：37443752.
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[8]Hao X D，Wang Q L，Zhang X P.Experimental evaluation of decrease in bacterial activity due to cell death and activity decay in activated sludge [J].Water Research，2009，43（14）：36043612.
[9]Lu H B，Oehmen A，Virdis B，et al.Obtaining highly enriched cultures of Candidatus Accumulibacter phosphates through alternating carbon sources [J].Water Research，2006，40（20）：38383848.
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[13]Siegrist H，Brunner I，Koch G.Reduction of biomass decay rate under anoxic and anaerobic conditions [J].Water Science and Technology，1999，39（1）：129137.
[14]Gujer W，Henze M，Mino T.Activated sludge model No. 3 [J].Water Science and Technology，1999， 39 （1）：183193.
[15]Lavallee B，Lessard P，Besser C.Decay rate variability of active heterotrophic biomass [J].Water Science and Technology，2002，46（1/2）：423430.
[16]Temmink H，Petersen B，Isaacs S.Recovery of biological phosphorus removal after periods of low organic loading [J].Water Science and Technology，1996，34（1/2）：18.
[17]Lopez C，Pons M N，Morgenroth E.Endogenous processes during longterm starvation in activated sludge performing enhanced biological phosphorus removal [J].Water Research，2006，40（8）：15191530.
[18]Lopez C M，Oehmen A，Hooijmans C M.Modeling the PAOGAO competition： Effects of carbon source， pH and temperature [J].Water Research，2009，43（2）：450462.
（编辑 王秀玲）