摘要：涡虫具有极强的再生能力，并且认为涡虫体内存在一类具有增殖分化潜能被称为neoblasts的全能干细胞。这种细胞在涡虫体内可发生迁移、增殖和分化，对其个体组织器官损伤的修复具有重要作用。本实验中，三角涡虫经过饥饿处理后切取特定的组织块，然后再经过处理使组织块中的细胞分离出来。分离的细胞继续培养并通过碱性磷酸酶检测最终鉴定为neoblasts干细胞。
　　关键词：三角涡虫；全能干细胞；分离；培养；鉴定
　　中图分类号：Q959.151+.302文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）02-0034-04
　　涡虫（Planarian）是动物界最早出现两侧对称、三胚层、营自由生活的扁形动物，也是由水生向陆生过渡的重要类群，因而在动物系统演化中占有重要地位[1]。涡虫国内分布广泛，进化地位十分重要，是发育生物学、细胞遗传学和再生生物学、进化和遗传学研究的好材料。Kawakatsu认为中国的淡水三角涡虫全部属于三角涡虫属中的日本三角涡虫（Dugesia japonica Ichikawa et Kawakatsu）[2]。不同的地区和环境对其生殖具有一定影响，但大多以有性和无性方式交替进行。涡虫具有极强的再生能力，已知如果把涡虫切割成许多小的片段，一周内它可以重新长成完整的个体[3，4]。其再生潜能归因于体内一类称为“neoblasts”的细胞群，这是成体涡虫体内仅有的一类具有增殖分化潜能的干细胞，即成体未分化细胞[5～7]。它在整个个体的间质细胞内都有分布，而在其它类型细胞如上皮细胞、肠细胞、脑部分布较少；在生长、喂养、饥饿状态下细胞状态也处于动态的变化[8～9]。其体内neoblasts约占全部细胞的30%，是一种全能干细胞，可分化为体内的40多种细胞，因此成为研究胚胎发育、细胞分化与去分化分子机理的理想材料[10]。
　　迄今为止，体外分离干细胞技术已有很多报道，建立在对细胞表面标记物的识别基础上用来纯化干细胞的标记包括CD34、AC133、STRO-1、神经营养受体p7520等[11]。分离方法包括荧光标记细胞分选、免疫磁分离和免疫吸附柱分离；密度梯度离心法从单个核细胞中分离干细胞也用于涡虫干细胞的分离[12～13]，但这种方法要求的实验器材与熟练程度都比较高且操作繁琐，因此不常用。常用的分离哺乳动物干细胞的方法是通过胰酶处理组织块，使之消化成单个细胞，再用培养液培养，但处理时会对细胞造成一定程度的损伤。在现代再生科学方面，最早尝试培养涡虫细胞是在芝加哥Ch.M.Child’s实验室[14]。但是直到目前，没有任何关于稳定培养扁形动物细胞系的报道。最近有neoblasts细胞重要性及其分子相关实验方面的报道，所以在借鉴国外分离日本三角涡虫全能干细胞neoblasts方法的基础上，摸索建立稳定的neoblasts细胞系非常重要[15～17]。
　　干细胞的细胞质中含有较高的碱性磷酸酶（ALP），而已分化的细胞中活性明显降低。在碱性磷酸酯酶的催化下，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸（BCIP）会被水解产生强反应性的产物，该产物会和氯化硝基四氮唑蓝（NBT）发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan产物，所以利用这一点可以鉴定细胞是否为干细胞[18～19]。本实验初步摸索了一种分离培养及鉴定涡虫全能干细胞neoblasts的方法，为下一步开展涡虫相关方面的研究提供了一定的基础。