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摘要：为完善现有鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，简称IBDV）灭活疫苗生产工艺，形成适用于批量生产的抗原制备技术流程，对IBDV NJ09株病毒在DF-1细胞上的增殖工艺进行研究。通过培养基筛选、血清最适浓度比较、接毒量测定等相关试验，明确了规模化生产工艺，即将DF-1细胞以1 ∶3、1 ∶4比例分瓶（0.85×105～1.2×105个/mL）传代培养，细胞生长36～48 h后按体积分数0.1%～0.2%接种IBDV NJ09株毒种，接毒后 36～48 h收毒；同时筛选出适宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培养基及小牛血清，既可以满足高滴度抗原增殖的生长需要，又降低了疫苗生产成本，形成了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标，按上述工艺所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量稳定在108.0 TCID50/mL以上，可满足含IBDV组分的系列灭活疫苗生产需要，为该病毒灭活疫苗大规模生产提供了技术支持。
关键词：鸡传染性法氏囊病毒；NJ09株；DF-1细胞；生产工艺
中图分类号： S858.315.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0152-03
收稿日期：2017-02-24
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）。
作者简介：揭鸿英（1978—），女，福建三明人，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：于漾，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究。Tel：（025）84392058；E-mail：[email protected]。DF-1细胞是一种可以持续传代的鸡胚成纤维细胞系，由美国明尼苏达大学的Himly等于1998年用10日龄EV-0鸡胚胎制备而成[1]。与传统的鸡成纤维（chicken embryo fibroblast，简称CEF）细胞相比，该细胞系在产业化生产中有着明显的优势，目前已广泛应用于禽类病毒的增殖研究及疫苗的规模化生产中[2-3]，其中在鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，简称IBDV）的增殖研究上也有相关报道[4-9]。IBDV是鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease）的致病病原，鸡感染该病毒不仅会引起雏鸡发病死亡，更重要的是会破坏雏鸡法氏囊组织，导致免疫抑制，诱发机体对其他病原的敏感性，威胁禽养殖业的健康发展[10-13]。在IBDV的疫苗研究中，近年来也有利用传代细胞培养病毒的报道，但由于IBDV包含多个株系，受毒源株系差别、培养体系等因素的影响，IBDV在DF-1等传代细胞上的增殖条件也各不相同[14-18]。为提高IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖的病毒含量，同时考虑大规模培养的生产成本，笔者所在实验室对IBDV NJ09株细胞适应毒在DF-1细胞上的增殖进行不同条件的筛选，拟确定IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳生产工艺。
1材料与方法
1.1材料
25 cm2细胞瓶、细胞计数板、96孔细胞培养板，均购自美国Corning Coster公司；DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清，均购自GIBCO公司；MD611培养基，购自北京清大天一科技有限公司；DF-1细胞，从美国ATCC公司购入，由国家兽用生物制品工程技术研究中心传代、建库和保存；鸡传染性法氏囊病毒NJ09株细胞适应毒F3代，病毒含量为108.0 TCID50/mL（TCID50表示半数组织感染量），由笔者所在实验室培育和保存。
1.2DF-1细胞传代比例筛选
选择细胞生长良好、致密度为95%以上的25 cm2细胞瓶，弃去培养液，用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）轻轻荡洗2次，加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）液2 mL进行消化。当细胞面呈毛玻璃状，弃去消化液，利用瓶内残留的0.5 mL消化液繼续消化，当细胞面出现松散脱落时，加入不同比例含5%小牛血清的MD611培养液轻轻吹打，悬浮细胞，进行细胞计数，使细胞生长液中DF-1细胞数分别为 0.5×105～0.7×105个/mL（传代比例1 ∶6）、0.67×105～083×105个/mL（传代比例1 ∶5）、0.85×105～1.0×105个/mL（传代比例 1 ∶4）、1.0×105～1.2×105个/mL（传代比例1 ∶3），在25 cm2细胞瓶中加入10 mL细胞悬液，在37 ℃条件下培养，观察细胞的贴壁情况、生长状态及细胞的密度。
1.3IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
取已长满单层的25 cm2细胞瓶12个，分4组，每组3个重复，分别按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量（体积分数）接毒。接毒后，观察细胞病变出现情况，待80%以上细胞出现病变时，收获细胞毒。收获的细胞毒反复冻融3次后，12 000 r/min 离心 10 min，取上清测定病毒含量。
1.4不同营养液对扩繁DF-1细胞的影响
DF-1细胞分别用3种细胞生长液（DMEM 5%小牛血清、DMEM/F12 5%小牛血清、MD611 5%小牛血清）连传3代后，消化细胞，进行细胞计数。
1.5不同营养液扩繁DF-1细胞对IBDV增殖的影响
取分别用3种细胞生长液（DMEM 10%小牛血清、DMEM/F12 10%小牛血清、MD611 5%小牛血清）连传细胞长满单层的25 cm2细胞瓶9个，3个1组，每个细胞瓶按 0.1%（体积比）接毒。第1组维持液为DMEM培养基（DMEM 2%小牛血清），第2组维持液为DMEM/F12培养基（DMEM/F12 2%小牛血清），第3组维持液为MD611培养基（MD611 2%小牛血清）。接毒后观察细胞病变情况，各组均在接毒后细胞病变数量超过80%时收毒，收获的细胞毒反复冻融3次后，12 000 r/min离心10 min，取上清测定病毒含量。 1.6不同血清对IBDV增殖的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个，3个1组，按 0.1%（体积比）接毒。第1组维持液为含2%小牛血清的培养基，第2组为含2%胎牛血清的培养基。接毒后观察细胞病变情况，各组均在接毒后细胞病变数量达到80%以上时收毒，-20 ℃冻存，12 000 r/min离心10 min，取上清测定病毒含量。
1.7IBDV收毒时冻融次数对病毒含量的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个，3个1组。按0.1%（体积比）接毒。接毒后观察细胞病变情况，当细胞病变数量超过80%时收毒，第1组将所取的3个方瓶细胞毒悬液混匀，反复吹打，不冻融，收获病毒液。第2组将细胞置于 -20 ℃ 冻融，分别在冻融1、2、3次时取样。所有样品经 12 000 r/min 离心10 min，取上清测定病毒含量。
1.8毒价测定方法
已长满单层细胞的96孔细胞板，弃去培养液，每孔用PBS洗涤1次。将病毒用无血清的培养液作10倍系列稀释，从最低稀释度的病毒液开始接种细胞，每个稀释度接4个孔，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培养箱中吸附1 h之后，每孔加入100 μL维持液（血清终浓度为2%）。放入37 ℃ CO2培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变情况，连续观察7 d，计算TCID50。
2结果与分析
2.1DF-1细胞传代比例筛选
由表1可以看出，将DF-1细胞按1 ∶3～1 ∶6不同比例分瓶传代，在一定时间内均能长成致密单层。但随着分瓶比例的加大，长成致密单层的时间延长。DF-1细胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶传代时，接种后24～48 h能长成致密单层，培养 48 h 时细胞数较多；而按1 ∶5～1 ∶6分瓶培养48 h细胞数少于1 ∶3、1 ∶4比例分瓶试验组，且于接种后60～84 h才长成致密单层。因此，以1 ∶3、1 ∶4的传代比例培养36～48 h 为最佳。
2.2IBDV在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
IBDV NJ09株在DF-1细胞上按0.5%～1.0%的量接毒，细胞在接毒后24 h出现病变，24～36 h细胞全部脱落，由表2可见，接种量0.5%～1.0%条件下，收毒时间为28～30 h，病毒含量为107.4～107.8 TCID50/mL。按0.1%～0.2% 的量接毒，细胞在接毒后24～36 h开始出现病变，36～48 h 80%的细胞出现病变，病毒含量为108.0～108.2 TCID50/mL。因此，按0.1%～0.2%接毒量接毒时，36～48 h收毒的病毒含量最高。
2.3不同营养液对DF-1细胞增殖的影响
由表3可知，培养48 h时，含DMEM培养基的营养液中的细胞数为67万个/mL，DMEM/F12培养基中的细胞数为70万个/mL，而MD611培养基中的细胞数为100万个/mL，高于另2种培养基；在生产成本上，MD611培养基增殖DF-1细胞的生产成本明显低于DMEM、DMEM/F12培养基，因此MD611培养基是经济又适宜的DF-1细胞培养基。
2.4不同营养液对IBDV增殖的影响
由表4可知，3种营养液中，含DMEM培养基的营养液中IBDV的增殖效价最低，病毒含量为107.67 TCID50/mL，而含DMEM/F12、MD611培养基的营养液中IBDV病毒含量分别为108.20、108.27 TCID50/mL，两者IBDV的增殖量相当，而在生产成本上，DMEM/F12生产成本大约是MD611的3倍（表3），因此MD611是一种适宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培养基。
3讨论与结论
DF-1作为一种重要的禽传代细胞，目前已在多种禽病毒增殖研究中被应用，如IBDV、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒等[19-20]。笔者所在实验室前期已经驯化获得1株DF-1细胞适应毒——IBDV NJ09株，基于该细胞毒，本研究对其在DF-1细胞上进行增殖培养时的接毒量、营养液、血清、收毒方法等方面进行了条件优化，为进一步完善该毒株的疫苗生产工艺提供支持。
从不同分瓶传代比例看，DF-1细胞按1 ∶3～1 ∶6传代，细胞都能长成单层，但长成单层需要的时间不同。因此可以根据不同的目的，选择不同的分瓶比例。当需要接毒时，可以选择1 ∶3～1 ∶4的比例传代，细胞在培养24～48 h时可以长成致密单层。如果仅是维持细胞的传代需要，可以选择 1 ∶5～1 ∶6的比例分瓶，這样既保存了细胞，又减轻了工作量。
不同营养液对DF-1细胞的增殖结果显示，DMEM、DMEM/F12培养基培养细胞48 h，细胞数约增殖2倍，用MD611培养DF-1 48 h后，细胞数增殖3倍左右，而且MD611价格便宜，仅为DMEM价格的1/2左右、DMEM/F12价格的1/3左右。
病毒接毒量研究结果显示，IBDV NJ09株在DF-1细胞上按1.0%的接毒量接毒，毒价并不是最高，这一结果说明了1.0%的接毒量过大，导致细胞病变出现过早，毒价亦未因接种量的增加而更高。病毒接毒量不是越大越好，细胞接毒量太大会造成细胞病变提前，导致细胞迅速圆缩脱落，毒价反而不高；而接毒量过少时又会造成细胞病变出现延迟，细胞衰老、状态差也会影响病毒增殖的毒价，前人研究IBDV在细胞上的增殖时也有类似的发现[21-22]。最佳接毒量应该用每个细胞的病毒感染复数（MOI）表示更科学，而本试验中，由于细胞培养工艺比较成熟，细胞数也比较稳定，且毒种的病毒含量是稳定的，故接毒量用占维持液的百分比表示，在具体操作中更便捷。
不同血清对IBDV增殖影响的研究结果显示，胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增殖后的含量比小牛血清略高，而成本比小牛血清高300元/L，结合生产实际，选择性价比高的小牛血清。 IBDV收毒时，冻融次数对病毒含量影响的研究结果显示，不冻融虽然对病毒含量影响不大，但有一部分细胞未脱壁，不能完全收清，而冻融1、2次后少量未脱璧的细胞也能脱落，利于完全收获。
通过系列试验对DF-1的培养及IBDV NJ09株细胞毒生产工艺条件进行了研究，确定了培养基及血清，同时制定了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标：（1）DF-1细胞在传代时，以1 ∶3、1 ∶4比例传代，培养36～48 h后能长成致密单层，适合接毒；（2）选用MD611培养基 2%小牛血清浓度维持液增殖IBDV病毒，既可以确保增殖抗原的高滴度，又降低了生产成本；（3）IBDV NJ09株最适接毒量为0.1%～0.2%（体积分数），接毒时间为细胞生长36～48 h后，收毒时间为接毒36～48 h（80%以上细胞出现细胞病变）后，可确保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL；（4）IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖收毒时的冻融次数，对抗原病毒含量影响不明显，为确保病毒收获完全，建议选择冻融1～2次。
参考文献：
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关键词：鸡传染性法氏囊病毒；NJ09株；DF-1细胞；生产工艺
中图分类号： S858.315.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）17-0152-03
收稿日期：2017-02-24
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（编号：201303046）。
作者简介：揭鸿英（1978—），女，福建三明人，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：于漾，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究。Tel：（025）84392058；E-mail：[email protected]。DF-1细胞是一种可以持续传代的鸡胚成纤维细胞系，由美国明尼苏达大学的Himly等于1998年用10日龄EV-0鸡胚胎制备而成[1]。与传统的鸡成纤维（chicken embryo fibroblast，简称CEF）细胞相比，该细胞系在产业化生产中有着明显的优势，目前已广泛应用于禽类病毒的增殖研究及疫苗的规模化生产中[2-3]，其中在鸡传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，简称IBDV）的增殖研究上也有相关报道[4-9]。IBDV是鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease）的致病病原，鸡感染该病毒不仅会引起雏鸡发病死亡，更重要的是会破坏雏鸡法氏囊组织，导致免疫抑制，诱发机体对其他病原的敏感性，威胁禽养殖业的健康发展[10-13]。在IBDV的疫苗研究中，近年来也有利用传代细胞培养病毒的报道，但由于IBDV包含多个株系，受毒源株系差别、培养体系等因素的影响，IBDV在DF-1等传代细胞上的增殖条件也各不相同[14-18]。为提高IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖的病毒含量，同时考虑大规模培养的生产成本，笔者所在实验室对IBDV NJ09株细胞适应毒在DF-1细胞上的增殖进行不同条件的筛选，拟确定IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳生产工艺。
1材料与方法
1.1材料
25 cm2细胞瓶、细胞计数板、96孔细胞培养板，均购自美国Corning Coster公司；DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胰蛋白酶、小牛血清、胎牛血清，均购自GIBCO公司；MD611培养基，购自北京清大天一科技有限公司；DF-1细胞，从美国ATCC公司购入，由国家兽用生物制品工程技术研究中心传代、建库和保存；鸡传染性法氏囊病毒NJ09株细胞适应毒F3代，病毒含量为108.0 TCID50/mL（TCID50表示半数组织感染量），由笔者所在实验室培育和保存。
1.2DF-1细胞传代比例筛选
选择细胞生长良好、致密度为95%以上的25 cm2细胞瓶，弃去培养液，用0.01 mol/L磷酸缓冲盐溶液（PBS）轻轻荡洗2次，加入0.1%胰酶-乙二胺四乙酸（EDTA）液2 mL进行消化。当细胞面呈毛玻璃状，弃去消化液，利用瓶内残留的0.5 mL消化液繼续消化，当细胞面出现松散脱落时，加入不同比例含5%小牛血清的MD611培养液轻轻吹打，悬浮细胞，进行细胞计数，使细胞生长液中DF-1细胞数分别为 0.5×105～0.7×105个/mL（传代比例1 ∶6）、0.67×105～083×105个/mL（传代比例1 ∶5）、0.85×105～1.0×105个/mL（传代比例 1 ∶4）、1.0×105～1.2×105个/mL（传代比例1 ∶3），在25 cm2细胞瓶中加入10 mL细胞悬液，在37 ℃条件下培养，观察细胞的贴壁情况、生长状态及细胞的密度。
1.3IBDV NJ09株在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
取已长满单层的25 cm2细胞瓶12个，分4组，每组3个重复，分别按0.1%、0.2%、0.5%、1.0%接毒量（体积分数）接毒。接毒后，观察细胞病变出现情况，待80%以上细胞出现病变时，收获细胞毒。收获的细胞毒反复冻融3次后，12 000 r/min 离心 10 min，取上清测定病毒含量。
1.4不同营养液对扩繁DF-1细胞的影响
DF-1细胞分别用3种细胞生长液（DMEM 5%小牛血清、DMEM/F12 5%小牛血清、MD611 5%小牛血清）连传3代后，消化细胞，进行细胞计数。
1.5不同营养液扩繁DF-1细胞对IBDV增殖的影响
取分别用3种细胞生长液（DMEM 10%小牛血清、DMEM/F12 10%小牛血清、MD611 5%小牛血清）连传细胞长满单层的25 cm2细胞瓶9个，3个1组，每个细胞瓶按 0.1%（体积比）接毒。第1组维持液为DMEM培养基（DMEM 2%小牛血清），第2组维持液为DMEM/F12培养基（DMEM/F12 2%小牛血清），第3组维持液为MD611培养基（MD611 2%小牛血清）。接毒后观察细胞病变情况，各组均在接毒后细胞病变数量超过80%时收毒，收获的细胞毒反复冻融3次后，12 000 r/min离心10 min，取上清测定病毒含量。 1.6不同血清对IBDV增殖的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个，3个1组，按 0.1%（体积比）接毒。第1组维持液为含2%小牛血清的培养基，第2组为含2%胎牛血清的培养基。接毒后观察细胞病变情况，各组均在接毒后细胞病变数量达到80%以上时收毒，-20 ℃冻存，12 000 r/min离心10 min，取上清测定病毒含量。
1.7IBDV收毒时冻融次数对病毒含量的影响
取已长满单层细胞的25 cm2细胞瓶6个，3个1组。按0.1%（体积比）接毒。接毒后观察细胞病变情况，当细胞病变数量超过80%时收毒，第1组将所取的3个方瓶细胞毒悬液混匀，反复吹打，不冻融，收获病毒液。第2组将细胞置于 -20 ℃ 冻融，分别在冻融1、2、3次时取样。所有样品经 12 000 r/min 离心10 min，取上清测定病毒含量。
1.8毒价测定方法
已长满单层细胞的96孔细胞板，弃去培养液，每孔用PBS洗涤1次。将病毒用无血清的培养液作10倍系列稀释，从最低稀释度的病毒液开始接种细胞，每个稀释度接4个孔，每孔100 μL，在37 ℃ CO2培养箱中吸附1 h之后，每孔加入100 μL维持液（血清终浓度为2%）。放入37 ℃ CO2培养箱中培养，每天观察并记录细胞病变情况，连续观察7 d，计算TCID50。
2结果与分析
2.1DF-1细胞传代比例筛选
由表1可以看出，将DF-1细胞按1 ∶3～1 ∶6不同比例分瓶传代，在一定时间内均能长成致密单层。但随着分瓶比例的加大，长成致密单层的时间延长。DF-1细胞按1 ∶3、1 ∶4 比例分瓶传代时，接种后24～48 h能长成致密单层，培养 48 h 时细胞数较多；而按1 ∶5～1 ∶6分瓶培养48 h细胞数少于1 ∶3、1 ∶4比例分瓶试验组，且于接种后60～84 h才长成致密单层。因此，以1 ∶3、1 ∶4的传代比例培养36～48 h 为最佳。
2.2IBDV在DF-1细胞上的最佳接毒量的确定
IBDV NJ09株在DF-1细胞上按0.5%～1.0%的量接毒，细胞在接毒后24 h出现病变，24～36 h细胞全部脱落，由表2可见，接种量0.5%～1.0%条件下，收毒时间为28～30 h，病毒含量为107.4～107.8 TCID50/mL。按0.1%～0.2% 的量接毒，细胞在接毒后24～36 h开始出现病变，36～48 h 80%的细胞出现病变，病毒含量为108.0～108.2 TCID50/mL。因此，按0.1%～0.2%接毒量接毒时，36～48 h收毒的病毒含量最高。
2.3不同营养液对DF-1细胞增殖的影响
由表3可知，培养48 h时，含DMEM培养基的营养液中的细胞数为67万个/mL，DMEM/F12培养基中的细胞数为70万个/mL，而MD611培养基中的细胞数为100万个/mL，高于另2种培养基；在生产成本上，MD611培养基增殖DF-1细胞的生产成本明显低于DMEM、DMEM/F12培养基，因此MD611培养基是经济又适宜的DF-1细胞培养基。
2.4不同营养液对IBDV增殖的影响
由表4可知，3种营养液中，含DMEM培养基的营养液中IBDV的增殖效价最低，病毒含量为107.67 TCID50/mL，而含DMEM/F12、MD611培养基的营养液中IBDV病毒含量分别为108.20、108.27 TCID50/mL，两者IBDV的增殖量相当，而在生产成本上，DMEM/F12生产成本大约是MD611的3倍（表3），因此MD611是一种适宜IBDV NJ09株病毒在DF-1上增殖的培养基。
3讨论与结论
DF-1作为一种重要的禽传代细胞，目前已在多种禽病毒增殖研究中被应用，如IBDV、H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、马立克氏病病毒等[19-20]。笔者所在实验室前期已经驯化获得1株DF-1细胞适应毒——IBDV NJ09株，基于该细胞毒，本研究对其在DF-1细胞上进行增殖培养时的接毒量、营养液、血清、收毒方法等方面进行了条件优化，为进一步完善该毒株的疫苗生产工艺提供支持。
从不同分瓶传代比例看，DF-1细胞按1 ∶3～1 ∶6传代，细胞都能长成单层，但长成单层需要的时间不同。因此可以根据不同的目的，选择不同的分瓶比例。当需要接毒时，可以选择1 ∶3～1 ∶4的比例传代，细胞在培养24～48 h时可以长成致密单层。如果仅是维持细胞的传代需要，可以选择 1 ∶5～1 ∶6的比例分瓶，這样既保存了细胞，又减轻了工作量。
不同营养液对DF-1细胞的增殖结果显示，DMEM、DMEM/F12培养基培养细胞48 h，细胞数约增殖2倍，用MD611培养DF-1 48 h后，细胞数增殖3倍左右，而且MD611价格便宜，仅为DMEM价格的1/2左右、DMEM/F12价格的1/3左右。
病毒接毒量研究结果显示，IBDV NJ09株在DF-1细胞上按1.0%的接毒量接毒，毒价并不是最高，这一结果说明了1.0%的接毒量过大，导致细胞病变出现过早，毒价亦未因接种量的增加而更高。病毒接毒量不是越大越好，细胞接毒量太大会造成细胞病变提前，导致细胞迅速圆缩脱落，毒价反而不高；而接毒量过少时又会造成细胞病变出现延迟，细胞衰老、状态差也会影响病毒增殖的毒价，前人研究IBDV在细胞上的增殖时也有类似的发现[21-22]。最佳接毒量应该用每个细胞的病毒感染复数（MOI）表示更科学，而本试验中，由于细胞培养工艺比较成熟，细胞数也比较稳定，且毒种的病毒含量是稳定的，故接毒量用占维持液的百分比表示，在具体操作中更便捷。
不同血清对IBDV增殖影响的研究结果显示，胎牛血清中IBDV NJ09株的病毒增殖后的含量比小牛血清略高，而成本比小牛血清高300元/L，结合生产实际，选择性价比高的小牛血清。 IBDV收毒时，冻融次数对病毒含量影响的研究结果显示，不冻融虽然对病毒含量影响不大，但有一部分细胞未脱壁，不能完全收清，而冻融1、2次后少量未脱璧的细胞也能脱落，利于完全收获。
通过系列试验对DF-1的培养及IBDV NJ09株细胞毒生产工艺条件进行了研究，确定了培养基及血清，同时制定了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标：（1）DF-1细胞在传代时，以1 ∶3、1 ∶4比例传代，培养36～48 h后能长成致密单层，适合接毒；（2）选用MD611培养基 2%小牛血清浓度维持液增殖IBDV病毒，既可以确保增殖抗原的高滴度，又降低了生产成本；（3）IBDV NJ09株最适接毒量为0.1%～0.2%（体积分数），接毒时间为细胞生长36～48 h后，收毒时间为接毒36～48 h（80%以上细胞出现细胞病变）后，可确保病毒含量不低于108.0 TCID50/mL；（4）IBDV NJ09株在DF-1细胞上增殖收毒时的冻融次数，对抗原病毒含量影响不明显，为确保病毒收获完全，建议选择冻融1～2次。
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