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摘要：建立α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法，对淀粉基质液浓度、反应温度系列试验条件进行确定。结果显示，最佳测定条件为淀粉基质液浓度为2.5%，酶促反应的最适温度40 ℃，平均回收率为99.03%（n=6），精密度RSD=1.82%。可见，该测定方法简便、快捷、重复性良好，可作为α-淀粉酶抑制剂活性的常规测定方法。
关键词：白芸豆；碘试液比色法；α-淀粉酶抑制剂活性
中图分类号： TS201.2 5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0301-02
收稿日期：2014-04-03
作者简介：谢雨杉（1989—），女，福建福州人，硕士研究生，主要从事天然药物提取与分离及应用研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：李多伟，副教授，硕士生导师，主要从事天然动植物资源提取、分离与植物细胞工程研究。E-mail：[email protected]。α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，简称α-AI）属于糖苷水解酶。胃肠道内唾液胰淀粉酶的活性能被α-AI有效抑制，人体对食物中主要碳水化合物的水解和消化受到阻碍或延缓，降低了食物中淀粉糖类物质的分解吸收，起到了降低血糖、血脂作用并抑制了血糖浓度的升高，在糖尿病患者的饮食治疗中起到了很好的作用；α-AI可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗，对肥胖患者减轻体质量也起到了很好的作用。因此，α-AI可以用来防治糖尿病、动脉硬化症、高血脂、脂肪过多症及肥胖症[1-2]。从白芸豆中获得α-AI具有高效价及耐热性而倍受关注[3]。
α-AI能特异性抑制α-淀粉酶，从而减少α-淀粉酶对淀粉的水解，碘试液与淀粉呈蓝色反应，并在一定波长下有最大吸光度。通过定量测定添加抑制剂前后淀粉量的变化可测得α-AI的活性[4]。本研究对碘试液比色法测定α-淀粉酶抑制剂活性的试验条件进行系列试验，以期寻找最佳试验条件，为α-AI的科学研究和生产检测提供可借鉴的参考数据。
1材料与方法
1.1仪器
德国赛多利斯ME235S-电子分析天平；上海医疗器械五厂H·H·S21-6C电热恒温水浴锅；上海博迅公司THZ-92A 恒温振荡器；上海大龙医疗器械有限公司PotPette 100～1 000 μL 手动单道可调式移液器；日本岛津UV-1700紫外可见光分光光度计等。
1.2试剂
1.2.10.2 mol/L 乙酸盐缓冲液（pH值 5.6）的配制取0.2 mol/L 乙酸溶液90 mL，0.2 mol/L乙酸钠溶液910 mL，混匀即为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液（pH值 5.6） 。其中，0.2 mol/L 乙酸溶液配制：吸取11.8 mL乙酸用蒸馏水定容至1 000 mL； 0.2 mol/L 乙酸钠溶液配制：称取27.22 g乙酸钠用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。
1.2.2碘试液的配制称取0.317 g碘溶于4 mL 25%碘化钾溶液中，加蒸馏水至200 mL，取10 mL加入至25 mL 25%盐酸中，再用水稀释至500 mL。
1.2.31.5%可溶性淀粉溶液的配制准确称取105 ℃干燥4 h的可溶性淀粉3.0 g，加20 mL蒸馏水使成混悬液，然后缓缓倒入约100 mL沸水中，溶解后煮沸至清亮透明，放冷，加40 mL 0.2 mol/L 乙酸盐缓冲液（pH值 5.6），用蒸馏水稀释至 200 mL。
1.2.4淀粉基质液的配制10 mL 1.5%可溶性淀粉加1 mL蒸馏水混合，取其0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合后于波长620 nm处测定吸光度，取吸光度为0.9～1.0的1.5%可溶性淀粉溶液作为淀粉基质液。
1.2.5酶稀释液的配制1.641 g乙酸钠、0.176 g乙酸钙及5.84 g氯化钠溶于约800 mL蒸馏水中，用1 mol/L乙酸调至pH值为6.0后加蒸馏水至1 000 mL。
1.2.6α-淀粉酶试样溶液的配制准确称取0.5 g α-淀粉酶（购于北京奥特星生物技术有限责任公司），加酶稀释液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中悬保温2 h后备用。用下述活性测定法进行预试验，试验溶液的蓝色全部消失并变为红色时作为试样溶液。
1.2.7α-AI试样溶液的配制用以下方法从白芸豆中提取供试品α-AI[5]：白芸豆→粉碎→水浸提→硫酸铵盐析→透析→浓缩→干燥→产品（灰白色粉未状）。准确称取 0.5 g α-AI试样，加酶稀释液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中保温2 h后备用。
2结果与分析
2.1测定条件的选择
2.1.1淀粉基质液浓度的确定配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%系列可溶性淀粉溶液，分别取10 mL于各试管中，再各加1 mL蒸馏水混合，取其0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合后于波长620 nm处测定吸光度，并作为淀粉基质液进行活性测定，观察在波长620 nm处试验溶液的蓝色消失并变为红色时管数。确定淀粉基质液的浓度。
从表1可以看出，淀粉基质液浓度在2.0%及以下时，由于淀粉少、相对酶量大，待反应6 min后观察时几乎看不到蓝色消失而直接是浅红色；而淀粉基质液浓度在3.0%及以上时，由于淀粉多、相对酶量少，待反应6 min后观察至20 min时仍未见蓝色消失的迹象；淀粉基质液浓度在2.5%时，待反应 6 min 后，7～20 min内可观察到蓝色消失转变为浅红色的过程。因此，淀粉基质液浓度确定为2.5%。
表1淀粉基质液浓度的确定
浓度
（%）取液量 （mL）加水量
（mL）吸光度管数结果0.51010.1～0.3第1管无法观察1.01010.3～0.5第1管无法观察1.51010.5～0.7第1管无法观察2.01010.7～0.9第1管无法观察2.51010.9～1.0第2管至第15管可观察到3.01011.0～1.215管以后无法观察注：n=5。
2.1.2反应温度的确定取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，分别在20、30、40、50、60 ℃恒温振荡器内振摇15 min后，准确加入1 mL α-淀粉酶试样溶液，立即振摇混匀后放回相应温度振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过 1 min 取出0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的管数，确定酶促反应的最适温度。从表2可以看出，20、60 ℃时由于不是酶促反应最适温度，第30管以后仍无法观察到蓝色消失；30、50 ℃时虽接近酶促反应最适温度，但不是最适温度，在第20管至第30管可观察到蓝色消失，但时间过长不利于检测；40 ℃时是酶促反应的最适温度，在第2管至第20管可观察到蓝色消失，能满足检测观察的需要。
表2酶促反应最适温度的确定
温度（℃）管数结果20第30管以后无法观察30第20管至第30管可观察到40第2管至第20管可观察到50第20管至第30管可观察到60第30管以后无法观察注：n=5。
2.2α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法
按照上述确定的最佳基质液浓度、反应温度，对分离纯化的白芸豆α-AI进行活性测定。
2.2.1α-淀粉酶活性的测定取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，40 ℃恒温振荡器内振摇15 min后准确加入1 mL α-淀粉酶试样溶液，立即振摇混匀后放回40 ℃振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过1 min取出0.1 mL于 10 mL 碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的吸光度Dt。用 1 mL 水代替试样溶液作为空白试验溶液，与试验溶液同样操作，测定吸光度Db。求酶活性。
2.2.2α-AI活性的测定精确吸取α-AI 1.0 mL与α-淀粉酶溶液1.0 mL于试管中，充分摇匀后在40 ℃恒温振荡器内反应15 min，同时另取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，于40 ℃恒温振荡器内振摇15 min后，准确加入1 mL上述反应液，立即振摇混匀后放回40 ℃振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过1 min取出0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的吸光度Dt。用1 mL水代替反应液作为空白试验溶液，与反应液同样操作，测定吸光度Db。求酶活性。
2.2.3酶活性计算酶活性单位以1 g酶在1 min内基质液中蓝色的碘减少10%时为1 U/g。
α-淀粉酶活性（U/g）=（Db-Dt）/Db×（100/10）×（1/t）×（1/m）。
式中：t为反应时间（min）；m为1 mL试样溶液中酶的质量（g），α-淀粉酶抑制剂活性（U/g）=抑制前α-淀粉酶活性-抑制后α-淀粉酶活性。
2.3精密度测定
取试验分离纯化的白芸豆α-AI样品，精确称取，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，6次连续重复测定，试验结果表明，该比色测定方法测定α-AI有良好的精密度，RSD=1.82%（n=6）。
2.4重复性试验
取同批次试验分离纯化的白芸豆α-AI样品，精确称取6份，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，结果表明，该比色测定方法有良好的重复性，RSD=2.12%（n=6）。
2.5加样回收率试验
从已知α-AI活性的样品溶液中精密吸取300 μL，共6份，分别准确加入α-AI对照品溶液200 μL，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，测加入量的回收率。从表3得出，α-AI平均回收率为99.03%（n=6）。
表3α-AI加样回收率试验（n=3）
浓度
（%）α-AI活性（U/g）样品对照品实测对照品回收率
（%）RSD
（%）11 2083 6384 80298.792.0221 2203 6824 83598.181.9431 1953 6574 853100.031.9741 2133 6624 84899.262.1051 2093 6494 81798.881.9361 2163 6554 83699.041.95注：n=3。
3结论
通过对淀粉基质液浓度、反应温度系列试验条件的研究，确定α-AI的碘试液比色测定方法的最佳试验条件为：淀粉基质液浓度2.5%，酶促反应的最适温度40 ℃。此方法精密度为RSD=1.82%，平均回收率为99.03%（n=6）。可见，该检测方法简便、快捷、重复性好，可用于α-AI活性的常规测定。
参考文献：
[1]Uchida R，Nase A. New enzymatic synthesis of 6-modified maltooligosaccharides and their inhibitory activities for human α-amylases[J]. Carbohydrate Research，1998，307：69.
[2]Munck L，Mundy L，Vaag P. Characterization of enzyme Ihibitiors in barley and their tentative role in malting and brewing[J]. Amer Soc Brew Chem J，1985，43：35-38.
[3]Bernard F G，Alli I. Chracterization of a purifieel α-amylase inhibitor from white kidney beans （Phaseolus vulgansis）[J]. Food Research International，1998，31：217-225.
[4]张文德.市售食品生产用α-淀粉酶活性的统一测定方法[J].国外医学：卫生学分册，1999，26（4）：65-66.
[5]Ho F M，Whitaker J R. Purification and partial characterization of white kidney bean（Phaseolus vulgaris） alpha-amylase inhibitor from two esperimental cultivars[J]. Journal of Food Biochemistry，1993，17：15-33.刘水英，李新生，江海，等. 彩色甘薯不同品种中基本物质及功能成分分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：303-305.
关键词：白芸豆；碘试液比色法；α-淀粉酶抑制剂活性
中图分类号： TS201.2 5文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0301-02
收稿日期：2014-04-03
作者简介：谢雨杉（1989—），女，福建福州人，硕士研究生，主要从事天然药物提取与分离及应用研究。E-mail：[email protected]。
通信作者：李多伟，副教授，硕士生导师，主要从事天然动植物资源提取、分离与植物细胞工程研究。E-mail：[email protected]。α-淀粉酶抑制剂（α-amylase inhibitor，简称α-AI）属于糖苷水解酶。胃肠道内唾液胰淀粉酶的活性能被α-AI有效抑制，人体对食物中主要碳水化合物的水解和消化受到阻碍或延缓，降低了食物中淀粉糖类物质的分解吸收，起到了降低血糖、血脂作用并抑制了血糖浓度的升高，在糖尿病患者的饮食治疗中起到了很好的作用；α-AI可减少糖向脂肪转化，延缓肠道排空，增加脂肪消耗，对肥胖患者减轻体质量也起到了很好的作用。因此，α-AI可以用来防治糖尿病、动脉硬化症、高血脂、脂肪过多症及肥胖症[1-2]。从白芸豆中获得α-AI具有高效价及耐热性而倍受关注[3]。
α-AI能特异性抑制α-淀粉酶，从而减少α-淀粉酶对淀粉的水解，碘试液与淀粉呈蓝色反应，并在一定波长下有最大吸光度。通过定量测定添加抑制剂前后淀粉量的变化可测得α-AI的活性[4]。本研究对碘试液比色法测定α-淀粉酶抑制剂活性的试验条件进行系列试验，以期寻找最佳试验条件，为α-AI的科学研究和生产检测提供可借鉴的参考数据。
1材料与方法
1.1仪器
德国赛多利斯ME235S-电子分析天平；上海医疗器械五厂H·H·S21-6C电热恒温水浴锅；上海博迅公司THZ-92A 恒温振荡器；上海大龙医疗器械有限公司PotPette 100～1 000 μL 手动单道可调式移液器；日本岛津UV-1700紫外可见光分光光度计等。
1.2试剂
1.2.10.2 mol/L 乙酸盐缓冲液（pH值 5.6）的配制取0.2 mol/L 乙酸溶液90 mL，0.2 mol/L乙酸钠溶液910 mL，混匀即为0.2 mol/L乙酸盐缓冲液（pH值 5.6） 。其中，0.2 mol/L 乙酸溶液配制：吸取11.8 mL乙酸用蒸馏水定容至1 000 mL； 0.2 mol/L 乙酸钠溶液配制：称取27.22 g乙酸钠用蒸馏水溶解，定容至1 000 mL。
1.2.2碘试液的配制称取0.317 g碘溶于4 mL 25%碘化钾溶液中，加蒸馏水至200 mL，取10 mL加入至25 mL 25%盐酸中，再用水稀释至500 mL。
1.2.31.5%可溶性淀粉溶液的配制准确称取105 ℃干燥4 h的可溶性淀粉3.0 g，加20 mL蒸馏水使成混悬液，然后缓缓倒入约100 mL沸水中，溶解后煮沸至清亮透明，放冷，加40 mL 0.2 mol/L 乙酸盐缓冲液（pH值 5.6），用蒸馏水稀释至 200 mL。
1.2.4淀粉基质液的配制10 mL 1.5%可溶性淀粉加1 mL蒸馏水混合，取其0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合后于波长620 nm处测定吸光度，取吸光度为0.9～1.0的1.5%可溶性淀粉溶液作为淀粉基质液。
1.2.5酶稀释液的配制1.641 g乙酸钠、0.176 g乙酸钙及5.84 g氯化钠溶于约800 mL蒸馏水中，用1 mol/L乙酸调至pH值为6.0后加蒸馏水至1 000 mL。
1.2.6α-淀粉酶试样溶液的配制准确称取0.5 g α-淀粉酶（购于北京奥特星生物技术有限责任公司），加酶稀释液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中悬保温2 h后备用。用下述活性测定法进行预试验，试验溶液的蓝色全部消失并变为红色时作为试样溶液。
1.2.7α-AI试样溶液的配制用以下方法从白芸豆中提取供试品α-AI[5]：白芸豆→粉碎→水浸提→硫酸铵盐析→透析→浓缩→干燥→产品（灰白色粉未状）。准确称取 0.5 g α-AI试样，加酶稀释液溶解至100 mL，在40 ℃水浴中保温2 h后备用。
2结果与分析
2.1测定条件的选择
2.1.1淀粉基质液浓度的确定配制0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%系列可溶性淀粉溶液，分别取10 mL于各试管中，再各加1 mL蒸馏水混合，取其0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合后于波长620 nm处测定吸光度，并作为淀粉基质液进行活性测定，观察在波长620 nm处试验溶液的蓝色消失并变为红色时管数。确定淀粉基质液的浓度。
从表1可以看出，淀粉基质液浓度在2.0%及以下时，由于淀粉少、相对酶量大，待反应6 min后观察时几乎看不到蓝色消失而直接是浅红色；而淀粉基质液浓度在3.0%及以上时，由于淀粉多、相对酶量少，待反应6 min后观察至20 min时仍未见蓝色消失的迹象；淀粉基质液浓度在2.5%时，待反应 6 min 后，7～20 min内可观察到蓝色消失转变为浅红色的过程。因此，淀粉基质液浓度确定为2.5%。
表1淀粉基质液浓度的确定
浓度
（%）取液量 （mL）加水量
（mL）吸光度管数结果0.51010.1～0.3第1管无法观察1.01010.3～0.5第1管无法观察1.51010.5～0.7第1管无法观察2.01010.7～0.9第1管无法观察2.51010.9～1.0第2管至第15管可观察到3.01011.0～1.215管以后无法观察注：n=5。
2.1.2反应温度的确定取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，分别在20、30、40、50、60 ℃恒温振荡器内振摇15 min后，准确加入1 mL α-淀粉酶试样溶液，立即振摇混匀后放回相应温度振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过 1 min 取出0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的管数，确定酶促反应的最适温度。从表2可以看出，20、60 ℃时由于不是酶促反应最适温度，第30管以后仍无法观察到蓝色消失；30、50 ℃时虽接近酶促反应最适温度，但不是最适温度，在第20管至第30管可观察到蓝色消失，但时间过长不利于检测；40 ℃时是酶促反应的最适温度，在第2管至第20管可观察到蓝色消失，能满足检测观察的需要。
表2酶促反应最适温度的确定
温度（℃）管数结果20第30管以后无法观察30第20管至第30管可观察到40第2管至第20管可观察到50第20管至第30管可观察到60第30管以后无法观察注：n=5。
2.2α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法
按照上述确定的最佳基质液浓度、反应温度，对分离纯化的白芸豆α-AI进行活性测定。
2.2.1α-淀粉酶活性的测定取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，40 ℃恒温振荡器内振摇15 min后准确加入1 mL α-淀粉酶试样溶液，立即振摇混匀后放回40 ℃振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过1 min取出0.1 mL于 10 mL 碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的吸光度Dt。用 1 mL 水代替试样溶液作为空白试验溶液，与试验溶液同样操作，测定吸光度Db。求酶活性。
2.2.2α-AI活性的测定精确吸取α-AI 1.0 mL与α-淀粉酶溶液1.0 mL于试管中，充分摇匀后在40 ℃恒温振荡器内反应15 min，同时另取10 mL基质液于25 mL容量瓶中，于40 ℃恒温振荡器内振摇15 min后，准确加入1 mL上述反应液，立即振摇混匀后放回40 ℃振荡器内继续振摇。从计时反应6 min后开始每过1 min取出0.1 mL于10 mL碘试液中，立即混合并作为试验溶液。于波长620 nm处测定试验溶液的蓝色消失并变为红色时的吸光度Dt。用1 mL水代替反应液作为空白试验溶液，与反应液同样操作，测定吸光度Db。求酶活性。
2.2.3酶活性计算酶活性单位以1 g酶在1 min内基质液中蓝色的碘减少10%时为1 U/g。
α-淀粉酶活性（U/g）=（Db-Dt）/Db×（100/10）×（1/t）×（1/m）。
式中：t为反应时间（min）；m为1 mL试样溶液中酶的质量（g），α-淀粉酶抑制剂活性（U/g）=抑制前α-淀粉酶活性-抑制后α-淀粉酶活性。
2.3精密度测定
取试验分离纯化的白芸豆α-AI样品，精确称取，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，6次连续重复测定，试验结果表明，该比色测定方法测定α-AI有良好的精密度，RSD=1.82%（n=6）。
2.4重复性试验
取同批次试验分离纯化的白芸豆α-AI样品，精确称取6份，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，结果表明，该比色测定方法有良好的重复性，RSD=2.12%（n=6）。
2.5加样回收率试验
从已知α-AI活性的样品溶液中精密吸取300 μL，共6份，分别准确加入α-AI对照品溶液200 μL，按照“2.2”节 α-淀粉酶抑制剂活性的碘试液比色测定方法进行测定，测加入量的回收率。从表3得出，α-AI平均回收率为99.03%（n=6）。
表3α-AI加样回收率试验（n=3）
浓度
（%）α-AI活性（U/g）样品对照品实测对照品回收率
（%）RSD
（%）11 2083 6384 80298.792.0221 2203 6824 83598.181.9431 1953 6574 853100.031.9741 2133 6624 84899.262.1051 2093 6494 81798.881.9361 2163 6554 83699.041.95注：n=3。
3结论
通过对淀粉基质液浓度、反应温度系列试验条件的研究，确定α-AI的碘试液比色测定方法的最佳试验条件为：淀粉基质液浓度2.5%，酶促反应的最适温度40 ℃。此方法精密度为RSD=1.82%，平均回收率为99.03%（n=6）。可见，该检测方法简便、快捷、重复性好，可用于α-AI活性的常规测定。
参考文献：
[1]Uchida R，Nase A. New enzymatic synthesis of 6-modified maltooligosaccharides and their inhibitory activities for human α-amylases[J]. Carbohydrate Research，1998，307：69.
[2]Munck L，Mundy L，Vaag P. Characterization of enzyme Ihibitiors in barley and their tentative role in malting and brewing[J]. Amer Soc Brew Chem J，1985，43：35-38.
[3]Bernard F G，Alli I. Chracterization of a purifieel α-amylase inhibitor from white kidney beans （Phaseolus vulgansis）[J]. Food Research International，1998，31：217-225.
[4]张文德.市售食品生产用α-淀粉酶活性的统一测定方法[J].国外医学：卫生学分册，1999，26（4）：65-66.
[5]Ho F M，Whitaker J R. Purification and partial characterization of white kidney bean（Phaseolus vulgaris） alpha-amylase inhibitor from two esperimental cultivars[J]. Journal of Food Biochemistry，1993，17：15-33.刘水英，李新生，江海，等. 彩色甘薯不同品种中基本物质及功能成分分析[J]. 江苏农业科学，2015，43（1）：303-305.