目的建立HPLC法测定人血清中甲氨蝶呤(MTX)的浓度并应用于临床。方法采用HPLC法,血清用70%高氯酸沉淀蛋白后,旋涡混匀2 min,离心10 min,取上清液进行分析。色谱柱ZORBAX XDB C18,柱温30℃,流动相:乙腈-H2O(30∶70),流速1.0 m L·min-1,检测波长225 nm。结果血清中MTX保留时间为4.92 min,内标保留时间为9.42 min,最低检测浓度为0.03 mg·L-1,样品稳定性较好。相对回收率为100.15%~102.62%,日内、日间RSD≤10%。结论本法检测MTX血浓度简单、快速、灵敏。通过对大剂量MTX化疗的白血病患儿的血药浓度进行常规检测,可掌握甲酰四氢叶酸钙解救剂量,以提高疗效,减少不良反应的发生。