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摘 要 根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因（AcPmp）序列设计1对特异引物mp-FP/mp-RP，以病样槟榔总DNA为模板扩增该AcPmp的编码区并连接到pMD19T simple中间载体。将测序正确的阳性菌提取质粒pMD19T-AcPmp，经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切后回收AcPmp片段，然后以正确的编码框连接到原核表达载体pET32a（+），转化Escherichia coli BL21感受态细胞。含有pET32a-AcPmp的BL21表达菌经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明，在30 ℃，0.1 mmol/L IPTG条件下诱导4 h，可产生部分可溶性的融合蛋白。利用Ni2+-NTA亲和层析柱法进行纯化并获得高纯度的可溶性融合蛋白。将纯化后的融合蛋白多次免疫家兔，取其抗血清，以融合蛋白（1 ∶ 10 000稀释）作抗原，间接ELISA法测定抗血清效价大于125 000。Western Blot杂交结果表明槟榔植原体膜蛋白抗血清能与融合蛋白特异性结合。
关键词 槟榔植原体；膜蛋白基因；原核表达；抗血清制备
中图分类号 S59 文献标识码 A
Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a（+）and the recombinant plasmid pET32a-AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell， and the positive colony was induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography， and the high purity of fused protein was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ID-ELISA）indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶ 125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.
Key words Areca phytoplasma； Membrane protein gene； Prokaryotic expression； Preparing anti-serum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024
槟榔（Areca catechu Linnaeus）属棕榈科槟榔属（Areca）多年生常绿乔木，是一种典型的热带经济作物和观赏作物，也是重要的南药资源之一。据报道，在中国海南省，槟榔是第二大经济作物。而槟榔黄化病是槟榔上主要的病害之一，现已遍及印度、中国等大部分槟榔生产国主产区，造成槟榔大面积减产，并且有进一步扩大的趋势。1976年后，国内外科研工作者通过各种方法证实了在发病的槟榔中存在植原体[1-7]，但是植原体是否为槟榔黄化病的真正病原还在进一步研究当中。
植原体（Phyltoplasm）原称类菌原体（mycoplasma like-organism，MLO），是一类无细胞壁的植物病原微生物，其基因组较小（约0.53～1.35 Mb）[8-9]，（G+C）含量较低（约25 mol），在系统分类学上植原体属于柔膜体纲（Mollicutes）[10]。就物种起源而言，植原体被认为是厌氧植原体属中形成的一个单元演化分枝；从进化学说而论，植原体来自于革兰氏阳性菌，梭菌属细菌的祖先[11]。植原体不能人工培养，主要寄生于植物韧皮部筛管细胞中，可引起植物植株黄化、丛枝、花变叶、矮缩或花器返祖等症状，给经济作物造成巨大的损失[12]。自1967年由Doi首次报道植原体以来，至今已发现有300多种植物的病害与植原体相关，其中在中国已报道的约74种[13-15]。由于植原体没有细胞壁，菌体细胞膜直接与寄主植物或虫媒介体细胞接触，因此，认为其膜蛋白可能在虫媒介体-植原体-寄主植物的相互关系中起着非常重要的作用[16-21]。 本研究PCR扩增获得海南琼海槟榔植原体膜蛋白基因（AcPmp）编码区序列，构建到原核表达载体pET32a（+）并转化表达菌。通过该融合蛋白的表达、Ni2+-NTA亲和层析柱法纯化以及家兔免疫，制备了效价高、特异性强的槟榔植原体膜蛋白抗血清，为后期着手开展植原体膜蛋白与寄主蛋白之间的互作等研究奠定了前期基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病样 槟榔黄化病病样材料采至海南琼海，16S rRNA检测为阳性。健康槟榔由本实验室保存提供。
1.1.2 菌株与质粒 克隆载体pMD19T simple vector购至大连宝生物公司（TaKaRa）；表达载体pET-32a（+）由本实验室保存；克隆菌株E.coli DH5α购至北京全式金生物技术有限公司；表达菌株E.coli BL21（DE3）购至德国默克公司。
1.1.3 酶和化学试剂 PrimerSTARTM HS DNA polymerase、rTaq DNA polymerase、氨苄青霉素（Ampicillin）、IPTG均购自大连宝生物公司；限制性内切酶NcoⅠ/XhoⅠ购自Fermentas公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker购自天根生化科技有限公司；蛋白低分子量Marker购自Promega公司；丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Solarbio公司；十二烷基磺酸钠（SDS）、考马斯亮蓝R-250购自Amresco公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取 槟榔基因组总DNA提取按照本实验室改良的CTAB法[22]。
1.2.2 PCR产物的克隆及测序 根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因编码区序列（图1）设计一对特异引物mp-FP（5′-TGCCATGGCTATGAATCAC
AAAGAAAATTTTTTA-3′，含NcoⅠ酶切位点）和mp-RP（5′-CCCTCGAGTTATGATTGTACTTTTAAGT
CTGT-3′，含XhoⅠ酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成。
PCR反应条件如下：94 ℃预变性3 min ；94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s ，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min并终止。取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶（1%）电泳检测，剩余PCR产物采用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物技术有限公司）回收纯化，具体操作过程参照说明书进行。将纯化PCR产物用T-A克隆的方法连接到质粒pMD19T simple vector（TaKaRa公司），转化DH5α大肠杆菌。经菌液PCR和质粒双酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）鉴定后，阳性克隆子送往上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定 将中间质粒pMD19T-AcPmp和表达载体pET32a（+）分别进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切，37 ℃水浴过夜。TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性的AcPmp和pET32a（+）片段。将回收的目的基因AcPmp片段连接到pET32a（+）上，构建重组表达质粒pET32a-AcPmp。连接产物转化到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞。经菌液PCR和NcoⅠ/XhoⅠ质粒双酶切鉴定后，再随机选择3个阳性单克隆送往上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达和可溶性分析 含有重组质粒pET32a-AcPmp的大肠杆菌（BL 21）以1 ∶ 100的接种量接种于50 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）中，37 ℃摇床振荡培养。A600值达到0.5～0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃继续诱导培养3～6 h。
取不同诱导时间的表达菌液1 mL加入2 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用50 μL双蒸水悬浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4 ℃条件下，12 000 r/min离心1 min，取上清10 μL进行SDS-PAGE电泳。另收集经诱导培养4 h的菌液10 mL，离心沉淀后用500 μL双蒸水悬浮细胞，使用超声波进行菌体破碎；离心后将上清转到2 mL离心管中，沉淀用500 μL双蒸水重悬。取5 μL上清和5 μL沉淀，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴煮5 min。取10 μL进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的可溶性。
1.2.5 融合蛋白的纯化 扩大培养pET32a-AcPmp表达菌至1 L，按上述条件诱导表达4 h。于4 ℃ 6 000 r/min离心30 min，菌体沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。冰上超声波破碎仪破碎细胞后，于4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，上清过0.45 μm滤膜。过膜上清液进行Ni2+-NTA亲和层析柱纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次，再用6 mL Binding Buffer平衡亲和柱；然后含目的蛋白的上清液上柱，用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脱杂蛋白；最后再以6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）将融合蛋白洗脱下来。融合蛋白溶液置换：将含有融合蛋白的Elution Buffer置于透析袋经100 mL 1×PBS溶液透析3次，即可获得溶于PBS的纯化蛋白。 1.2.6 抗血清制备及血清学检测 纯化的融合蛋白溶液经透析袋透析后获得溶于1×PBS的蛋白溶液，利用BCA法测定其浓度后，与佐剂（1 ∶ 1）混匀，采用皮下多点注射抗原的方法多次免疫家兔，每只家兔的融合蛋白总注射量为1.5～2.0 mg。第3次免疫10 d后，每只白兔耳缘静脉取血0.5～1.0 mL，分离抗血清。以1×PBS的蛋白溶液（1 ∶ 10 000）作抗原，ID-ELISA法检测抗血清效价，血清效价未符合要求则继续免疫。血清效价符合要求后，心脏采血，分离抗血清。以免疫前的家兔血清为对照。
1.2.7 Western Blot鉴定抗血清特异性 取诱导表达4 h的pET32a-AcPmp菌体，处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳。用蒸馏水漂洗电泳后的蛋白胶，转入电转液中平衡10 min。利用转膜仪在100 V，60 mA的条件下反应1 h使蛋白转移到NC膜上，取出NC膜并在蒸馏水中漂洗。将NC膜平衡于TBST缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20]后，置于含有5%脱脂牛奶的封闭液中封闭过夜（4 ℃）。然后用TBST缓冲液漂洗NC膜3次，将其放入按1 ∶ 5 000的一抗TBST溶液，在37 ℃孵育40 min。取出NC膜经TBST漂洗后，转入按1 ∶ 30 000稀释的碱性磷酸标记的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37 ℃孵育40 min。再取出NC膜，经TBST漂洗后，滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺）和165 μg/m LBCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺）的显色液于NC膜蛋白面，直到条带清晰后，用蒸馏水漂洗2次，终止显色反应。取出NC膜晾干并扫描保存图片。
2 结果与分析
2.1 AcPmp基因克隆和表达质粒的构建
从病样总DNA中扩增获得的AcPmp基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后结果如图所示（图2），扩增片段大小约为500 bp，与预期结果相符，而健康植株和ddH2O对照均未出现特异性扩增条带。
构建的表达质粒pET32a-AcPmp经XhoⅠ/NcoⅠ双酶切验证，出现特异性DNA条带，其中一条大小约为500 bp（图3），与预期AcPmp基因片段结果相符。测序结果进一步证明成功构建了重组表达质粒pET32a-AcPmp。
2.2 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
SDS-PAGE电泳结果显示（如图4）：含有pET32a-AcPmp重组质粒的表达菌经IPTG诱导表达4、6 h后，在大小约37 ku处均有一明显的蛋白条带，其大小与预估的融合蛋白（6×His-AcPmp）符合。而未诱导的BL21表达菌、pET32a/BL21表达菌、pET32a-AcPmp/BL21表达菌和IPTG诱导的BL21表达菌、pET32a/BL21表达菌均未出现该特异蛋白条带。
融合蛋白的可溶性分析（如图5）：SDS-PAGE胶显示融合蛋白（6×His-AcPmp）主要以沉淀的形式表达，但是仍有一小部分溶于溶液中，即可溶性融合蛋白，含量较低。
2.3 融合蛋白的纯化
为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物活性，笔者选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行Ni2+-NTA亲和层析蛋白纯化。于30 ℃，IPTG终浓度为0.1 mmol/L的条件下，对重组表达菌pET32a-AcPmp/BL21进行大量（1 L）诱导培养4 h。如2.2所述，获得的融合蛋白大部分以包涵体形式存在，但也有一小部分可溶于溶液中，即是可溶性的。可溶性的杂蛋白经100 mmol/L咪唑浓度的washing buffer洗脱除去后，与亲和层析柱Ni2+螯合的目的蛋白纯度已达要求。最终，用含500 mmol/L咪唑浓度的washing buffer将融合蛋白溶于其中（图6）。
2.4 抗血清制备和效价测定
用ID-ELISA法对家兔进行免疫前血清本底水平检测，结果显示：实验所选用的新西兰大白兔（编号A）血清本底比较低（表1），符合实验要求。将溶于1×PBS溶液的纯化融合蛋白作为免疫原，第一次与完全佐剂等比例混匀，第二、三次与不完全佐剂等比例混匀，采用肌肉与皮下注射相结合免疫新西兰大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液（1 ∶ 10 000稀释）为抗原进行ID-ELISA测定抗血清效价。结果显示（表2），本试验制备的多克隆抗血清的效价大于125 000。
2.5 Western Blot鉴定抗血清特异性
经Western Blot抗原抗体结合反应和NBT/BCIP显色反应，兔抗融合蛋白（6×His-AcPmp）的抗血清与IPTG诱导的pET32a-AcPmp表达菌有特异性反应（图7），其特异性蛋白大小约为37 ku，与预期大小相符，而与其它杂蛋白条带均无明显特异反应，表明本研究制备的兔抗融合蛋白抗血清具有较好的特异性。
3 讨论与结论
随着生物技术，特别是蛋白分子生物学的快速发展，研究学者们对蛋白的结构及生物学功能的认识有了显著的提高。从蛋白的溶解度方面来说，目前常规纯化技术对于可溶性蛋白的分析、纯化和制备均具有较高的成功率。但对于一些棘手的不溶性蛋白质（如膜蛋白等）的纯化研究却困难重重，如蛋白质的活性问题等。近年来，对于膜蛋白质的纯化和功能研究等技术是非常迫切的，这是因为膜蛋白在基础生理过程中（如信号转导、分子转运、能量利用以及细胞和组织结构的维护）具有极其重要的作用。
利用细菌原核表达系统表达外源蛋白来获得高纯度和高浓度的蛋白已经成为一项成熟的实验技术，且可选择的宿主和载体具有多样性，这就为不同性质的蛋白表达和蛋白纯化奠定了基础。表达的外源蛋白主要有2种形式，一种是可溶性的外源融合蛋白，一种是以包涵体形式存在的融合蛋白。这2种不同形式的蛋白进行纯化时，主要区别在于包涵体需要经过变复性处理，而可溶性蛋白则不需要[23]。本研究的槟榔植原体膜蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在，但仍有一小部分是可溶的。为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物活性，我们选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行Ni2+-NTA亲和层析蛋白纯化。在30 ℃的条件下大量诱导表达融合蛋白，取可溶性的上清（含部分融合蛋白）进行纯化，与佐剂混匀多次免疫新西兰大白兔，制备高特异高效价的抗血清。 本研究制备的槟榔植原体膜蛋白多克隆抗血清具有效价高、特异性强等特点，且抗血清将为后续细菌双杂交或酵母双杂交等实验的展开奠定基础。除此之外，现今槟榔植原体的检测或诊断基本采用PCR方法[24-25]，而其它的快速检测方法较欠缺。与PCR方法相比[24-25]，本研究槟榔植原体膜蛋白多克隆抗血清的制备，是后续ELISA检测方法建立的先决条件，将大大降低检测槟榔植原体的费用，具有操作简单、快速、应用范围广泛等特点[26]。
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关键词 槟榔植原体；膜蛋白基因；原核表达；抗血清制备
中图分类号 S59 文献标识码 A
Abstract Total DNA was extracted from the infected Areca and used for amplifying the membrane protein gene of Areca Phytoplasma by using primers mp-FP/mp-RP based on its sequence from previous study. The membrane protein gene was finally inserted into prokaryotic expression vector pET-32a（+）and the recombinant plasmid pET32a-AcPmp was identified by NcoⅠ/XhoⅠ restriction enzymes and Sanger sequencing. Subsequently the recombinant plasmid was transferred into Escherichia coli BL21 competent cell， and the positive colony was induced at 30 ℃ with 0.1 mmol/L IPTG for 4 hours. The result showed that small part of soluble fused protein was expressed and then purified by Ni2+-NTA agarose affinity chromatography， and the high purity of fused protein was finally obtained in 500 mmol/L imidazole Elution buffer. Two rabbits were immunizeed for 3 times by using purified protein and phosphate buffer control the antiserum against Phytoplasma MP was collected and indirect. Indirect enzyme-linked immunosorbent assay（ID-ELISA）indicated that the titer of antiserum was higher than 1 ∶ 125 000. Western Blot analysis further showed that the antiserum was specifically binding with the MP fused protein.
Key words Areca phytoplasma； Membrane protein gene； Prokaryotic expression； Preparing anti-serum
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.11.024
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1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病样 槟榔黄化病病样材料采至海南琼海，16S rRNA检测为阳性。健康槟榔由本实验室保存提供。
1.1.2 菌株与质粒 克隆载体pMD19T simple vector购至大连宝生物公司（TaKaRa）；表达载体pET-32a（+）由本实验室保存；克隆菌株E.coli DH5α购至北京全式金生物技术有限公司；表达菌株E.coli BL21（DE3）购至德国默克公司。
1.1.3 酶和化学试剂 PrimerSTARTM HS DNA polymerase、rTaq DNA polymerase、氨苄青霉素（Ampicillin）、IPTG均购自大连宝生物公司；限制性内切酶NcoⅠ/XhoⅠ购自Fermentas公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA Marker购自天根生化科技有限公司；蛋白低分子量Marker购自Promega公司；丙烯酰胺、N，N′-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）购自Solarbio公司；十二烷基磺酸钠（SDS）、考马斯亮蓝R-250购自Amresco公司；其它化学试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 总DNA提取 槟榔基因组总DNA提取按照本实验室改良的CTAB法[22]。
1.2.2 PCR产物的克隆及测序 根据实验室测得的槟榔植原体膜蛋白基因编码区序列（图1）设计一对特异引物mp-FP（5′-TGCCATGGCTATGAATCAC
AAAGAAAATTTTTTA-3′，含NcoⅠ酶切位点）和mp-RP（5′-CCCTCGAGTTATGATTGTACTTTTAAGT
CTGT-3′，含XhoⅠ酶切位点）。引物由Invitrogen公司合成。
PCR反应条件如下：94 ℃预变性3 min ；94 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s ，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min并终止。取适量PCR产物进行琼脂糖凝胶（1%）电泳检测，剩余PCR产物采用TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生物技术有限公司）回收纯化，具体操作过程参照说明书进行。将纯化PCR产物用T-A克隆的方法连接到质粒pMD19T simple vector（TaKaRa公司），转化DH5α大肠杆菌。经菌液PCR和质粒双酶切（NcoⅠ/XhoⅠ）鉴定后，阳性克隆子送往上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.2.3 原核表达载体的构建及鉴定 将中间质粒pMD19T-AcPmp和表达载体pET32a（+）分别进行NcoⅠ/XhoⅠ双酶切，37 ℃水浴过夜。TIANGEN琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒纯化线性的AcPmp和pET32a（+）片段。将回收的目的基因AcPmp片段连接到pET32a（+）上，构建重组表达质粒pET32a-AcPmp。连接产物转化到BL21（DE3）大肠杆菌感受态细胞。经菌液PCR和NcoⅠ/XhoⅠ质粒双酶切鉴定后，再随机选择3个阳性单克隆送往上海英俊生物技术有限公司进行测序。
1.2.4 融合蛋白的诱导表达和可溶性分析 含有重组质粒pET32a-AcPmp的大肠杆菌（BL 21）以1 ∶ 100的接种量接种于50 mL LB液体培养基（含氨苄青霉素100 μg/mL）中，37 ℃摇床振荡培养。A600值达到0.5～0.6时，加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG，30 ℃继续诱导培养3～6 h。
取不同诱导时间的表达菌液1 mL加入2 mL离心管中，12 000 r/min离心1 min，弃上清，沉淀用50 μL双蒸水悬浮，再加入50 μL的2×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水浴煮5 min后放置在冰上2 min。在4 ℃条件下，12 000 r/min离心1 min，取上清10 μL进行SDS-PAGE电泳。另收集经诱导培养4 h的菌液10 mL，离心沉淀后用500 μL双蒸水悬浮细胞，使用超声波进行菌体破碎；离心后将上清转到2 mL离心管中，沉淀用500 μL双蒸水重悬。取5 μL上清和5 μL沉淀，加入等体积2×SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴煮5 min。取10 μL进行SDS-PAGE电泳，分析融合蛋白的可溶性。
1.2.5 融合蛋白的纯化 扩大培养pET32a-AcPmp表达菌至1 L，按上述条件诱导表达4 h。于4 ℃ 6 000 r/min离心30 min，菌体沉淀溶于50 mL Binding buffer中，冰浴放置30 min。冰上超声波破碎仪破碎细胞后，于4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，上清过0.45 μm滤膜。过膜上清液进行Ni2+-NTA亲和层析柱纯化：用6 mL灭菌水洗涤琼脂糖树脂2次，再用6 mL Binding Buffer平衡亲和柱；然后含目的蛋白的上清液上柱，用6 mL Washing Buffer（500 mmol/L NaCl，20 mmol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）洗脱杂蛋白；最后再以6 mL Elution Buffer（500 mmol/L NaCl，0.5 mol/L imidazole，20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）将融合蛋白洗脱下来。融合蛋白溶液置换：将含有融合蛋白的Elution Buffer置于透析袋经100 mL 1×PBS溶液透析3次，即可获得溶于PBS的纯化蛋白。 1.2.6 抗血清制备及血清学检测 纯化的融合蛋白溶液经透析袋透析后获得溶于1×PBS的蛋白溶液，利用BCA法测定其浓度后，与佐剂（1 ∶ 1）混匀，采用皮下多点注射抗原的方法多次免疫家兔，每只家兔的融合蛋白总注射量为1.5～2.0 mg。第3次免疫10 d后，每只白兔耳缘静脉取血0.5～1.0 mL，分离抗血清。以1×PBS的蛋白溶液（1 ∶ 10 000）作抗原，ID-ELISA法检测抗血清效价，血清效价未符合要求则继续免疫。血清效价符合要求后，心脏采血，分离抗血清。以免疫前的家兔血清为对照。
1.2.7 Western Blot鉴定抗血清特异性 取诱导表达4 h的pET32a-AcPmp菌体，处理后进行SDS-PAGE凝胶电泳。用蒸馏水漂洗电泳后的蛋白胶，转入电转液中平衡10 min。利用转膜仪在100 V，60 mA的条件下反应1 h使蛋白转移到NC膜上，取出NC膜并在蒸馏水中漂洗。将NC膜平衡于TBST缓冲液[20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20]后，置于含有5%脱脂牛奶的封闭液中封闭过夜（4 ℃）。然后用TBST缓冲液漂洗NC膜3次，将其放入按1 ∶ 5 000的一抗TBST溶液，在37 ℃孵育40 min。取出NC膜经TBST漂洗后，转入按1 ∶ 30 000稀释的碱性磷酸标记的山羊抗兔（IgG）TBST溶液中，37 ℃孵育40 min。再取出NC膜，经TBST漂洗后，滴加含有330 μg/mL NBT（0.5 g NBT溶于10 mL 70%的二甲基甲酰胺）和165 μg/m LBCIP（0.5 g BCIP溶于10 mL 100%的二甲基甲酰胺）的显色液于NC膜蛋白面，直到条带清晰后，用蒸馏水漂洗2次，终止显色反应。取出NC膜晾干并扫描保存图片。
2 结果与分析
2.1 AcPmp基因克隆和表达质粒的构建
从病样总DNA中扩增获得的AcPmp基因片段，经1%琼脂糖凝胶电泳后结果如图所示（图2），扩增片段大小约为500 bp，与预期结果相符，而健康植株和ddH2O对照均未出现特异性扩增条带。
构建的表达质粒pET32a-AcPmp经XhoⅠ/NcoⅠ双酶切验证，出现特异性DNA条带，其中一条大小约为500 bp（图3），与预期AcPmp基因片段结果相符。测序结果进一步证明成功构建了重组表达质粒pET32a-AcPmp。
2.2 融合蛋白的诱导表达及可溶性分析
SDS-PAGE电泳结果显示（如图4）：含有pET32a-AcPmp重组质粒的表达菌经IPTG诱导表达4、6 h后，在大小约37 ku处均有一明显的蛋白条带，其大小与预估的融合蛋白（6×His-AcPmp）符合。而未诱导的BL21表达菌、pET32a/BL21表达菌、pET32a-AcPmp/BL21表达菌和IPTG诱导的BL21表达菌、pET32a/BL21表达菌均未出现该特异蛋白条带。
融合蛋白的可溶性分析（如图5）：SDS-PAGE胶显示融合蛋白（6×His-AcPmp）主要以沉淀的形式表达，但是仍有一小部分溶于溶液中，即可溶性融合蛋白，含量较低。
2.3 融合蛋白的纯化
为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物活性，笔者选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行Ni2+-NTA亲和层析蛋白纯化。于30 ℃，IPTG终浓度为0.1 mmol/L的条件下，对重组表达菌pET32a-AcPmp/BL21进行大量（1 L）诱导培养4 h。如2.2所述，获得的融合蛋白大部分以包涵体形式存在，但也有一小部分可溶于溶液中，即是可溶性的。可溶性的杂蛋白经100 mmol/L咪唑浓度的washing buffer洗脱除去后，与亲和层析柱Ni2+螯合的目的蛋白纯度已达要求。最终，用含500 mmol/L咪唑浓度的washing buffer将融合蛋白溶于其中（图6）。
2.4 抗血清制备和效价测定
用ID-ELISA法对家兔进行免疫前血清本底水平检测，结果显示：实验所选用的新西兰大白兔（编号A）血清本底比较低（表1），符合实验要求。将溶于1×PBS溶液的纯化融合蛋白作为免疫原，第一次与完全佐剂等比例混匀，第二、三次与不完全佐剂等比例混匀，采用肌肉与皮下注射相结合免疫新西兰大白兔。3次注射后采集血清，以融合蛋白溶液（1 ∶ 10 000稀释）为抗原进行ID-ELISA测定抗血清效价。结果显示（表2），本试验制备的多克隆抗血清的效价大于125 000。
2.5 Western Blot鉴定抗血清特异性
经Western Blot抗原抗体结合反应和NBT/BCIP显色反应，兔抗融合蛋白（6×His-AcPmp）的抗血清与IPTG诱导的pET32a-AcPmp表达菌有特异性反应（图7），其特异性蛋白大小约为37 ku，与预期大小相符，而与其它杂蛋白条带均无明显特异反应，表明本研究制备的兔抗融合蛋白抗血清具有较好的特异性。
3 讨论与结论
随着生物技术，特别是蛋白分子生物学的快速发展，研究学者们对蛋白的结构及生物学功能的认识有了显著的提高。从蛋白的溶解度方面来说，目前常规纯化技术对于可溶性蛋白的分析、纯化和制备均具有较高的成功率。但对于一些棘手的不溶性蛋白质（如膜蛋白等）的纯化研究却困难重重，如蛋白质的活性问题等。近年来，对于膜蛋白质的纯化和功能研究等技术是非常迫切的，这是因为膜蛋白在基础生理过程中（如信号转导、分子转运、能量利用以及细胞和组织结构的维护）具有极其重要的作用。
利用细菌原核表达系统表达外源蛋白来获得高纯度和高浓度的蛋白已经成为一项成熟的实验技术，且可选择的宿主和载体具有多样性，这就为不同性质的蛋白表达和蛋白纯化奠定了基础。表达的外源蛋白主要有2种形式，一种是可溶性的外源融合蛋白，一种是以包涵体形式存在的融合蛋白。这2种不同形式的蛋白进行纯化时，主要区别在于包涵体需要经过变复性处理，而可溶性蛋白则不需要[23]。本研究的槟榔植原体膜蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体的形式存在，但仍有一小部分是可溶的。为了简便操作过程和尽量保持融合蛋白的生物活性，我们选择上清液（可溶性的融合蛋白）进行Ni2+-NTA亲和层析蛋白纯化。在30 ℃的条件下大量诱导表达融合蛋白，取可溶性的上清（含部分融合蛋白）进行纯化，与佐剂混匀多次免疫新西兰大白兔，制备高特异高效价的抗血清。 本研究制备的槟榔植原体膜蛋白多克隆抗血清具有效价高、特异性强等特点，且抗血清将为后续细菌双杂交或酵母双杂交等实验的展开奠定基础。除此之外，现今槟榔植原体的检测或诊断基本采用PCR方法[24-25]，而其它的快速检测方法较欠缺。与PCR方法相比[24-25]，本研究槟榔植原体膜蛋白多克隆抗血清的制备，是后续ELISA检测方法建立的先决条件，将大大降低检测槟榔植原体的费用，具有操作简单、快速、应用范围广泛等特点[26]。
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