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[摘要] 目的 通过逆相蒸发法制备抗结核药物利奈唑胺脂质体，并利用响应面法优化其制备工艺和处方组成。 方法 以包封率为主要指标进行单因素试验，以Box-Behnken响应面分析法优化其制备工艺。并将最优工艺下制得的利奈唑胺脂质体于倒置荧光显微镜下观察其形态。 结果 通过逆相蒸发法制备利奈唑胺脂质体的包封率较高;最佳制备工艺：胆固醇-卵磷脂质量比为1：2.45，缓冲液pH值为6.65，超声时间为3.2 min，旋转蒸发仪转速为50 r。 结论 逆相蒸发法的制备工艺简单，重现性好，所得包封率高。
[关键词] 利奈唑胺脂质体;逆相蒸发法;包封率;Box-Behnken响应面分析法
[Abstract] Objective To prepare antituberculous drug linezolid liposome using the reverse-phase evaporation method， and optimize its preparation process and prescription composition using the response surface method. Methods Single-factor experiment was performed with the entrapment rate as key indicators， and Box-Behnken response surface analysis was used to optimize the preparation process. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results It was found that the entrapment rate of linezolid liposome prepared using the reverse-phase evaporation method was relatively high; under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：2.45， the pH value of the buffer solution was 6.65， the ultrasonic time was 3.2 min， and the rotation speed of the rotary evaporator was 50 r. Conclusion The reverse-phase evaporation method has the advantages of simple preparation process， good reproducibility and high entrapment rate.
[Key words] Linezolid liposome; Reverse-phase evaporation method; Entrapment rate; Box-Behnken response surface analysis
結核病是危害性较高的一种疾病，随着药学的快速发展，多种抗结核药物不断被研发且在临床上得到广泛应用。但抗结核药物往往会产生毒副作用，因此如何减轻抗结核药物的毒副作用成了新的研究热点。利奈唑胺为人工合成的恶唑烷酮类抗菌药，可抗多重耐药，利奈唑胺为水溶性药物，通常为片剂，患者口服后常会产生腹泻、呕吐等不良反应，其被吸收入血后不易到达病灶而且血药浓度超过一定浓度还会产生严重的毒副作用，因此如何将其有效成分安全高效地送至靶器官是一个极有意义的研究方向。脂质体的靶向性、两亲性、缓释性等特性使其成为一种理想的药物载体，因此本实验欲通过制备利奈唑胺脂质体来实现利奈唑胺的肺部直接给药[1-3]。
1 材料与仪器
紫外分光光度计（UV-6000PC），郑州宝京科技有限公司;旋转蒸发仪（QA-205B），济宁瑞德仪器设备有限公司;LS13320型激光粒度分析仪（江苏荣华仪器制造有限公司）;倒置荧光显微镜（U-LH100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺原料药（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陕西澄明科技有限公司;胆固醇（20180228），江苏百得科技有限公司;磷脂膜荧光剂（20190310），SIGMAALDRICH。
2 方法与结果
2.1 最大吸收波长的选择
50 mL容量瓶中加入1 mg利奈唑胺，以 pH值为6.5的缓冲液定容，得20 μg/mL药物溶液，紫外分光光度法在200～400 nm范围内每隔10 nm测定吸光度，考察最大吸收波长并绘制曲线。移取空白脂质体混悬液2 mL至50 mL容量瓶中，同法测定。最终确定利奈唑胺最大吸收波长为289 nm，空白脂质体在此波长处无干扰。见图1、2。
2.2 利奈唑胺的含量测定
标准曲线的建立及方法学考察：10 mg利奈唑胺置50mL容量瓶中定容，得溶液浓度为200 μg/mL。移取0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL置25 mL容量瓶中定容，以PBS溶液为空白对照，得到标准曲线A=0.01C 0.0516，R2=0.9998。线性范围为1～24 μg/mL，考察其精密度RSD为0.32%，平均回收率为99.7%，24 h内稳定性0.15%，均低于2%，符合制备要求。 2.3包封率的测定
（1）游离药物量的测定：取利奈唑胺脂质体混悬液置于离心管中，2500 r/min离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，缓冲液定容，测定吸光度，然后计算游离药物浓度。
（2）总药量的测定：取等量的利奈唑胺脂质体加入甲醇破乳，充分振摇后于2500 r/min下离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩冲液定容，测定吸光度，然后计算总的药物浓度[4-5]。
（3）计算包封率的公式：包封率=（C总-C游离）/C总×100%。
2.4 逆相蒸发法制备利奈唑胺脂质体
精密称取卵磷脂100 mg和胆固醇50 mg于50 mL烧杯中，加入二氯甲烷5 mL、95%乙醇5 mL、吐温80 0.2 mL，在50℃恒温水浴锅上充分振摇使其完全溶解;10 mg利奈唑胺置50 mL烧杯中，加缓冲液5 mL使溶解;将两溶液混合后超声3～5 min，再于40℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂并形成均匀薄膜，加入40 mL 缓冲液，使膜溶解即得利奈唑胺脂质体[6-13]。
2.5 利奈唑胺脂质体制备处方工艺的单因素考察及结果[14]
在固定其他因素不变的前提下，分别对卵磷脂-胆固醇质量比、缓冲液pH、超声时间、旋转蒸发仪转速四个关键制备条件进行单因素考察，选取包封率最大的因素作进一步优化，其结果显示胆卵比（A）、缓冲液pH（B）、超声时间（C）为对包封率影响较大因素，见图3。
2.6 响应面法筛选最佳处方组成[15]
以单因素考察结果上下浮动设置三个梯度，通过Design Expert 8.0.6数据处理软件设计出的17组实验设计如表1所示，其中以利奈唑胺脂质体的包封率（Y）为响应值，其实验结果如表1所示。
2.6.1 显著性实验结果
[关键词] 利奈唑胺脂质体;逆相蒸发法;包封率;Box-Behnken响应面分析法
[Abstract] Objective To prepare antituberculous drug linezolid liposome using the reverse-phase evaporation method， and optimize its preparation process and prescription composition using the response surface method. Methods Single-factor experiment was performed with the entrapment rate as key indicators， and Box-Behnken response surface analysis was used to optimize the preparation process. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results It was found that the entrapment rate of linezolid liposome prepared using the reverse-phase evaporation method was relatively high; under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：2.45， the pH value of the buffer solution was 6.65， the ultrasonic time was 3.2 min， and the rotation speed of the rotary evaporator was 50 r. Conclusion The reverse-phase evaporation method has the advantages of simple preparation process， good reproducibility and high entrapment rate.
[Key words] Linezolid liposome; Reverse-phase evaporation method; Entrapment rate; Box-Behnken response surface analysis
結核病是危害性较高的一种疾病，随着药学的快速发展，多种抗结核药物不断被研发且在临床上得到广泛应用。但抗结核药物往往会产生毒副作用，因此如何减轻抗结核药物的毒副作用成了新的研究热点。利奈唑胺为人工合成的恶唑烷酮类抗菌药，可抗多重耐药，利奈唑胺为水溶性药物，通常为片剂，患者口服后常会产生腹泻、呕吐等不良反应，其被吸收入血后不易到达病灶而且血药浓度超过一定浓度还会产生严重的毒副作用，因此如何将其有效成分安全高效地送至靶器官是一个极有意义的研究方向。脂质体的靶向性、两亲性、缓释性等特性使其成为一种理想的药物载体，因此本实验欲通过制备利奈唑胺脂质体来实现利奈唑胺的肺部直接给药[1-3]。
1 材料与仪器
紫外分光光度计（UV-6000PC），郑州宝京科技有限公司;旋转蒸发仪（QA-205B），济宁瑞德仪器设备有限公司;LS13320型激光粒度分析仪（江苏荣华仪器制造有限公司）;倒置荧光显微镜（U-LH100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺原料药（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陕西澄明科技有限公司;胆固醇（20180228），江苏百得科技有限公司;磷脂膜荧光剂（20190310），SIGMAALDRICH。
2 方法与结果
2.1 最大吸收波长的选择
50 mL容量瓶中加入1 mg利奈唑胺，以 pH值为6.5的缓冲液定容，得20 μg/mL药物溶液，紫外分光光度法在200～400 nm范围内每隔10 nm测定吸光度，考察最大吸收波长并绘制曲线。移取空白脂质体混悬液2 mL至50 mL容量瓶中，同法测定。最终确定利奈唑胺最大吸收波长为289 nm，空白脂质体在此波长处无干扰。见图1、2。
2.2 利奈唑胺的含量测定
标准曲线的建立及方法学考察：10 mg利奈唑胺置50mL容量瓶中定容，得溶液浓度为200 μg/mL。移取0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL置25 mL容量瓶中定容，以PBS溶液为空白对照，得到标准曲线A=0.01C 0.0516，R2=0.9998。线性范围为1～24 μg/mL，考察其精密度RSD为0.32%，平均回收率为99.7%，24 h内稳定性0.15%，均低于2%，符合制备要求。 2.3包封率的测定
（1）游离药物量的测定：取利奈唑胺脂质体混悬液置于离心管中，2500 r/min离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，缓冲液定容，测定吸光度，然后计算游离药物浓度。
（2）总药量的测定：取等量的利奈唑胺脂质体加入甲醇破乳，充分振摇后于2500 r/min下离心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩冲液定容，测定吸光度，然后计算总的药物浓度[4-5]。
（3）计算包封率的公式：包封率=（C总-C游离）/C总×100%。
2.4 逆相蒸发法制备利奈唑胺脂质体
精密称取卵磷脂100 mg和胆固醇50 mg于50 mL烧杯中，加入二氯甲烷5 mL、95%乙醇5 mL、吐温80 0.2 mL，在50℃恒温水浴锅上充分振摇使其完全溶解;10 mg利奈唑胺置50 mL烧杯中，加缓冲液5 mL使溶解;将两溶液混合后超声3～5 min，再于40℃下减压旋转蒸发除去有机溶剂并形成均匀薄膜，加入40 mL 缓冲液，使膜溶解即得利奈唑胺脂质体[6-13]。
2.5 利奈唑胺脂质体制备处方工艺的单因素考察及结果[14]
在固定其他因素不变的前提下，分别对卵磷脂-胆固醇质量比、缓冲液pH、超声时间、旋转蒸发仪转速四个关键制备条件进行单因素考察，选取包封率最大的因素作进一步优化，其结果显示胆卵比（A）、缓冲液pH（B）、超声时间（C）为对包封率影响较大因素，见图3。
2.6 响应面法筛选最佳处方组成[15]
以单因素考察结果上下浮动设置三个梯度，通过Design Expert 8.0.6数据处理软件设计出的17组实验设计如表1所示，其中以利奈唑胺脂质体的包封率（Y）为响应值，其实验结果如表1所示。
2.6.1 显著性实验结果