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【摘要】目的: 研究瘦素和MMP-2在非酒精脂肪肝大鼠模型肝脏组织中的表达，以探讨在非酒精性脂肪肝发生中的作用，为脂肪肝的临床监测与治疗提供新思路。方法: 建立正常大鼠模型（30只），非酒精性脂肪肝模型大鼠（30只），采用免疫组化SABC法测定两组模型肝脏组织中瘦素和MMP-2的表达。实验数据的统计方法：计量资料采用单因素方差分析和t检验；计数资料采用χ2检验。结果: 在非酒精性脂肪肝大鼠模型肝脏组织中瘦素和MMP-2的阳性率高于正常模型肝脏组织，差异有统计学意义（P<0.01）。结论: 非酒精性脂肪肝模型大鼠肝脏组织中瘦素和MMP-2的表达增加，提示瘦素和MMP-2和TGF-β1与非酒精性脂肪肝的发生有关。
【关键词】瘦素；MMP-2；非酒精性脂肪肝
【中图分类号】R653【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0014-02
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是遗传- 环境- 代谢相关性疾病, 包括单纯性脂肪肝及由其进展而来的脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。它是指无过度饮酒史, 与脂质及糖代谢紊乱有关的肝脏疾病。西方国家普通人群中NAFLD的发病率为15%-30%, 我国NAFLD的发病率也呈逐年上升趋势, 已成为最常见的肝病之一。NAFLD各种病因引发脂质代谢异常，FFA和甘油三酯在肝内沉积，通过线粒体和过氧化物酶体β氧化及微粒体ω氧化等途径触发氧应激反应，脂质过氧化反应通过上述机制损伤线粒体，激发机体释放炎症介质和细胞因子，导致肝细胞发生变性，凋亡，坏死和纤维化的发生。而瘦素是目前已知较强的促肝纤维化的细胞因子及纤维化形成过程中重要的始动刺激因子之一[1]。HSC活化是肝纤维化发生发展的中心环节, 瘦素可能通过诱导HSC活化, 促进HSC的增殖和抑制其凋亡, 进而促进ECM成分的大量合成，最终导致肝纤维化的形成。 MMP-2和MMP-9也是通过调节细胞外基质的生成和介导炎症反应从而在NAFLD的发生、发展中扮演着重要角色。瘦素可以促进MMP-2,9的合成和表达活性，而MMP-2,9的过度表达会破坏HSC的基质环境导致HSC的激活，激活的HSC大量表达并分泌具有致纤维化作用的细胞因子和粘附分子，合成大量的细胞外基质，从而促进肝纤维化的形成和发展。本实验者在探讨瘦素，MMP-2在非酒精性脂肪肝模型大鼠的表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源:实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180－220g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 实验方法:
1.2.1 实验分组造模：Wistar雄性大鼠60只，随机分为两组，正常组30只,模型组30只。对照组：饲以普通饲料和自来水；模型组：采用高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝：高脂饮食配方：普通饲料84％、猪油14％、胆固醇2％；分别在第8、10周末每组各取6只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检,12周取18只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检(预试验表明瘦素和MMP-2和TGF-β1在8,10周肝组织中表达不明显)。
1.2．2 肝脏组织HE染色及脂肪肝判断标准：取部分肝右叶放于10％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，5μm切片，并HE染色后在显微镜下观察。
1.3 标本处理:所有标本连续切片5张，厚为4μm，置于经多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin）处理过的玻片上，58℃烤片2h后4℃保存。再各取石蜡标本10μm 3张，置于1.0ml无菌Eppendorf管中，4℃保存备用。
1.4 瘦素和MMP-2和TGF-β1的免疫组化检测:采用免疫组织化学方法,将组织切片与兔抗鼠瘦素和MMP-2抗体共孵化,4 ℃过夜,生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G( IgG) 处理后,滴加SABC ,DAB 显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。瘦素和MMP-2表达免疫组化阳性信号为棕黄色,结果判断标准:在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。
1.5 结果判断：细胞浆内含有棕黄色颗粒者为瘦素和MMP-2和TGF-β1阳性表达。在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。6 统计方法
采用SPSS13.0系统软件包，计量资料结果以±S表示，采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为显著性差异指标。对所采集数据用Excell2003软件手工辅助进行制图。
2 结果
2.1两组模型的阳性表达:
2.1.1 非酒精性脂肪肝病模型大鼠的瘦素的阳性表达高于正常模型大鼠的瘦素的阳性表达，两组比较有统计学意义( P = 0.0057, P < 0.01)。
2.1.2 非酒精性脂肪肝病模型大鼠的MMP-2的阳性表达高于正常模型大鼠的MMP-2的阳性表达，两组比较有统计学意义 ( P = 0. 0320, P< 0.05)。
3 討论
3.1 瘦素与非酒精性脂肪肝的关系:瘦素主要由白色脂肪组织产生， 进人血液后，透过血脑屏障与其长型受体结合双向激活Janus酪氨酸蛋白激酶或信号转导和转录激活蛋白途径， 影响神经肽Y分泌增加，引起食欲下降及机体耗能增加，使体质下降。但是， 它不能作为一种减肥药，因为大多数存在瘦素抵抗的肥胖患者瘦素水平均增高。在肝脏，瘦素通过降低肝细胞类固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)的表达达到抗脂质效应[4]。 在严重脂肪营养障碍的患者， 重组体瘦素显著降低肝脂变、甘油三酯、转氨酶活性及非酒精性脂肪肝的损伤[5]。 瘦素也参与纤维化的形成， 并且在先天性和获得性免疫中都起了重要作用[6]。瘦素还具有调节血管增生、创伤修复及胰岛素敏感性的作用[7-8]。
目前的研究认为在NAFLD的发病过程中，由脂代谢异常引起机体释放大量的活性氧和氧自由基，脂质过氧化的终产物和蛋白质结合成复合物，激活机体产生免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化[9]。肝纤维化是由肝毒性因素如酒精、病毒、免疫和先天性代谢性疾病等导致的慢性或复发性肝损伤的结果。无论是静止的还是激活的肝星状细胞(HSC)， 在肝纤维化过程中都起到了重要的作用。 HSC活化是肝纤维化发生发展的中心环节， 瘦素可能通过诱导HSC活化，促进HSC的增殖和抑制其凋亡，进而促进ECM成分的大量合成，最终导致肝纤维化的形成[9]。本实验的研究结果提示在非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝脏组织中瘦素的表达水平较正常对照组增高，差异有统计学意义。
3.2 MMPs与非酒精性脂肪肝的关系:目前发现，MMPs各种类型之间的结构具有高度的恒定性；而且不同细胞来源的MMPs有高度的同源性。而且各型MMPs在功能和结构上具有一些共同特性，表现在：MMPs为蛋白水解酶，至少可降解一种细胞外基质成分；MMPs以酶原形式分泌，其活化需要进行蛋白水解；均含有2个锌离子，为锌依赖性蛋白酶，其中位于催化活性中心的一个锌离子为活化酶原所必需的辅助因子；均含有钙离子，MMPs通常在中性条件下即可发挥酶活性，但钙离子的参与可使MMPs发挥最大的酶活性，并且钙离子能稳定MMPs的活性；酶原的激活伴随着分子量的减小；MMPs的酶活性能为相应的天然特异性抑制因子所抑制；MMPs的活性能被鏊合剂所抑制，但不受丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶类抑制剂的影响；均为内肽酶，能从肽链中间裂解底物，激活的MMPs可降解一种或多种ECM成分。
MMP-2,MMP-9主要降解变性的胶原如明胶和基底膜的成份，正常情况下它们的表达对基底膜基质的正常代谢起作用。MMP-2的激活在细胞表面进行，一旦MMP-2激活，即可降解细胞周围的基底膜基质，打破细胞与ECM之间的正常关系，对于HSC而言，就等于破坏了维持HSC于静止状态所需要的基底膜样的基质环境。有研究表明，在肝纤维化的发生发展过程中，尤其是纤维化早期，MMP-2mRNA的表达和活性都随着研究时间的延长而增加，从而有利于促进HSC的活化。本实验的研究结果提示在非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝脏组织中MMP-2的表达水平均较正常对照组增高，差异有统计学意义。
参考文献
[1] 宋振河 , 高孝忠等.瘦素在肝病发生中作用机制的研究进展［J］.实用肝脏病杂志 , 2005, 8 (4) : 2392 2431
[2] Wang XB, Liu P, Tang ZP, et al. The role of changes of MMP-2,9 activity in the development of liver fibrosis in rats. Zhonghua Ganzangbing Zazhi,2004,12:267-270.(in Chinese)
[3] Considine RV. Human leptin: an adipocyte hormone with weight-regulatory and endocrine functions. Semin Vasc Med 2005; 5: 15-24
[4] 钟岚，范建高.非酒精性脂肪肝动物模型.国外医学消化系统疾病分册，1999，19（3）:175－178
[5] 孙大裕.脂肪肝动物模的研究进展.中华消化杂志2002，22（5）：305－306
[6] 钟岚，范建高，王国良，等，肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立.实验动物科学与管理.2000，17(2)：16-20
作者单位：030001 山西医科大学第一临床医院1
046000 山西长治医学院附属和济医院2
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【关键词】瘦素；MMP-2；非酒精性脂肪肝
【中图分类号】R653【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)04-0014-02
非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是遗传- 环境- 代谢相关性疾病, 包括单纯性脂肪肝及由其进展而来的脂肪性肝炎和脂肪性肝硬化。它是指无过度饮酒史, 与脂质及糖代谢紊乱有关的肝脏疾病。西方国家普通人群中NAFLD的发病率为15%-30%, 我国NAFLD的发病率也呈逐年上升趋势, 已成为最常见的肝病之一。NAFLD各种病因引发脂质代谢异常，FFA和甘油三酯在肝内沉积，通过线粒体和过氧化物酶体β氧化及微粒体ω氧化等途径触发氧应激反应，脂质过氧化反应通过上述机制损伤线粒体，激发机体释放炎症介质和细胞因子，导致肝细胞发生变性，凋亡，坏死和纤维化的发生。而瘦素是目前已知较强的促肝纤维化的细胞因子及纤维化形成过程中重要的始动刺激因子之一[1]。HSC活化是肝纤维化发生发展的中心环节, 瘦素可能通过诱导HSC活化, 促进HSC的增殖和抑制其凋亡, 进而促进ECM成分的大量合成，最终导致肝纤维化的形成。 MMP-2和MMP-9也是通过调节细胞外基质的生成和介导炎症反应从而在NAFLD的发生、发展中扮演着重要角色。瘦素可以促进MMP-2,9的合成和表达活性，而MMP-2,9的过度表达会破坏HSC的基质环境导致HSC的激活，激活的HSC大量表达并分泌具有致纤维化作用的细胞因子和粘附分子，合成大量的细胞外基质，从而促进肝纤维化的形成和发展。本实验者在探讨瘦素，MMP-2在非酒精性脂肪肝模型大鼠的表达情况。
1 材料与方法
1.1 标本来源:实验动物：清洁级雄性Wistar大鼠60只，体重180－220g，由山西医科大学实验动物中心提供。
1.2 实验方法:
1.2.1 实验分组造模：Wistar雄性大鼠60只，随机分为两组，正常组30只,模型组30只。对照组：饲以普通饲料和自来水；模型组：采用高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝：高脂饮食配方：普通饲料84％、猪油14％、胆固醇2％；分别在第8、10周末每组各取6只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检,12周取18只隔夜禁食处死大鼠采集标本，留取肝组织待检(预试验表明瘦素和MMP-2和TGF-β1在8,10周肝组织中表达不明显)。
1.2．2 肝脏组织HE染色及脂肪肝判断标准：取部分肝右叶放于10％中性福尔马林液中固定，石蜡包埋，5μm切片，并HE染色后在显微镜下观察。
1.3 标本处理:所有标本连续切片5张，厚为4μm，置于经多聚赖氨酸（Poly-L-Lysin）处理过的玻片上，58℃烤片2h后4℃保存。再各取石蜡标本10μm 3张，置于1.0ml无菌Eppendorf管中，4℃保存备用。
1.4 瘦素和MMP-2和TGF-β1的免疫组化检测:采用免疫组织化学方法,将组织切片与兔抗鼠瘦素和MMP-2抗体共孵化,4 ℃过夜,生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G( IgG) 处理后,滴加SABC ,DAB 显色,苏木素轻度复染,脱水、透明、封片。瘦素和MMP-2表达免疫组化阳性信号为棕黄色,结果判断标准:在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。
1.5 结果判断：细胞浆内含有棕黄色颗粒者为瘦素和MMP-2和TGF-β1阳性表达。在放大400 倍下,每张切片随机选取10 个视野,通过灰度计算阳性面积以及阳性面积占总面积的百分比（即阳性率）。6 统计方法
采用SPSS13.0系统软件包，计量资料结果以±S表示，采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为显著性差异指标。对所采集数据用Excell2003软件手工辅助进行制图。
2 结果
2.1两组模型的阳性表达:
2.1.1 非酒精性脂肪肝病模型大鼠的瘦素的阳性表达高于正常模型大鼠的瘦素的阳性表达，两组比较有统计学意义( P = 0.0057, P < 0.01)。
2.1.2 非酒精性脂肪肝病模型大鼠的MMP-2的阳性表达高于正常模型大鼠的MMP-2的阳性表达，两组比较有统计学意义 ( P = 0. 0320, P< 0.05)。
3 討论
3.1 瘦素与非酒精性脂肪肝的关系:瘦素主要由白色脂肪组织产生， 进人血液后，透过血脑屏障与其长型受体结合双向激活Janus酪氨酸蛋白激酶或信号转导和转录激活蛋白途径， 影响神经肽Y分泌增加，引起食欲下降及机体耗能增加，使体质下降。但是， 它不能作为一种减肥药，因为大多数存在瘦素抵抗的肥胖患者瘦素水平均增高。在肝脏，瘦素通过降低肝细胞类固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)的表达达到抗脂质效应[4]。 在严重脂肪营养障碍的患者， 重组体瘦素显著降低肝脂变、甘油三酯、转氨酶活性及非酒精性脂肪肝的损伤[5]。 瘦素也参与纤维化的形成， 并且在先天性和获得性免疫中都起了重要作用[6]。瘦素还具有调节血管增生、创伤修复及胰岛素敏感性的作用[7-8]。
目前的研究认为在NAFLD的发病过程中，由脂代谢异常引起机体释放大量的活性氧和氧自由基，脂质过氧化的终产物和蛋白质结合成复合物，激活机体产生免疫反应而参与肝损害，诱导细胞死亡、炎症和纤维化[9]。肝纤维化是由肝毒性因素如酒精、病毒、免疫和先天性代谢性疾病等导致的慢性或复发性肝损伤的结果。无论是静止的还是激活的肝星状细胞(HSC)， 在肝纤维化过程中都起到了重要的作用。 HSC活化是肝纤维化发生发展的中心环节， 瘦素可能通过诱导HSC活化，促进HSC的增殖和抑制其凋亡，进而促进ECM成分的大量合成，最终导致肝纤维化的形成[9]。本实验的研究结果提示在非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝脏组织中瘦素的表达水平较正常对照组增高，差异有统计学意义。
3.2 MMPs与非酒精性脂肪肝的关系:目前发现，MMPs各种类型之间的结构具有高度的恒定性；而且不同细胞来源的MMPs有高度的同源性。而且各型MMPs在功能和结构上具有一些共同特性，表现在：MMPs为蛋白水解酶，至少可降解一种细胞外基质成分；MMPs以酶原形式分泌，其活化需要进行蛋白水解；均含有2个锌离子，为锌依赖性蛋白酶，其中位于催化活性中心的一个锌离子为活化酶原所必需的辅助因子；均含有钙离子，MMPs通常在中性条件下即可发挥酶活性，但钙离子的参与可使MMPs发挥最大的酶活性，并且钙离子能稳定MMPs的活性；酶原的激活伴随着分子量的减小；MMPs的酶活性能为相应的天然特异性抑制因子所抑制；MMPs的活性能被鏊合剂所抑制，但不受丝氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸蛋白酶类抑制剂的影响；均为内肽酶，能从肽链中间裂解底物，激活的MMPs可降解一种或多种ECM成分。
MMP-2,MMP-9主要降解变性的胶原如明胶和基底膜的成份，正常情况下它们的表达对基底膜基质的正常代谢起作用。MMP-2的激活在细胞表面进行，一旦MMP-2激活，即可降解细胞周围的基底膜基质，打破细胞与ECM之间的正常关系，对于HSC而言，就等于破坏了维持HSC于静止状态所需要的基底膜样的基质环境。有研究表明，在肝纤维化的发生发展过程中，尤其是纤维化早期，MMP-2mRNA的表达和活性都随着研究时间的延长而增加，从而有利于促进HSC的活化。本实验的研究结果提示在非酒精性脂肪肝病大鼠模型肝脏组织中MMP-2的表达水平均较正常对照组增高，差异有统计学意义。
参考文献
[1] 宋振河 , 高孝忠等.瘦素在肝病发生中作用机制的研究进展［J］.实用肝脏病杂志 , 2005, 8 (4) : 2392 2431
[2] Wang XB, Liu P, Tang ZP, et al. The role of changes of MMP-2,9 activity in the development of liver fibrosis in rats. Zhonghua Ganzangbing Zazhi,2004,12:267-270.(in Chinese)
[3] Considine RV. Human leptin: an adipocyte hormone with weight-regulatory and endocrine functions. Semin Vasc Med 2005; 5: 15-24
[4] 钟岚，范建高.非酒精性脂肪肝动物模型.国外医学消化系统疾病分册，1999，19（3）:175－178
[5] 孙大裕.脂肪肝动物模的研究进展.中华消化杂志2002，22（5）：305－306
[6] 钟岚，范建高，王国良，等，肥胖、高脂血症性脂肪性肝炎模型的建立.实验动物科学与管理.2000，17(2)：16-20
作者单位：030001 山西医科大学第一临床医院1
046000 山西长治医学院附属和济医院2
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