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摘要猪圆环病毒是单链环状DNA病毒，有2种不同的血清型：猪圆环病毒1型和猪圆环病毒2型。现有研究表明PCV1暂无致病性，PCV2则被认为是引起猪圆环病毒病的主要病原。许多国家养猪业的经济效益因此受到重大的影响。对PCV病原生物学的研究进展进行了综述。
关键词 猪圆环病毒；病原；基因结构；生物学
中图分类号 S852.65+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-089-03
AbstractThe genome of porcine circovirus consists of circular and single-stranded DNA molecules， which has two kinds of serotype， PCV1 and PCV2. Researches have revealed that PCV1 has no pathogenic， and PCV2 is thought to be the main pathogen of porcine circovirus virus disease.The economic benefits of pig industry suffered a significant influence in many countries. The research progresses of PCV pathogenic biology were summarized in this article.
Key words Porcine circovirus； Pathogeny； Gene structure； Biology
1974年，科学家Tisher等观察几株传代PK15细胞时在显微镜下发现了一种类似细小病毒的圆形颗粒状粒子，这些小粒子并不导致细胞病变，因此被研究人员认为是一种普通的污染物[1]。直到1982年，Tischer等用超速离心机离心后提取了该病毒粒子，通过电镜观察病毒形态，终于发现这并不是普通的细胞污染物，而是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒，并將其命名为猪圆环病毒（Porcine circovirus， PCV）。此后，在德国、加拿大、英国、北爱尔兰、新西兰、美国等国家的猪群中PCV抗体血清均检测呈阳性，但人工感染该PCV病毒后并不会造成猪只临床症状和病理上的变化[2-4]。1991年，Clark等在加拿大某些猪场中首次发现1种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome， PMWS）的传染病，被感染的仔猪生长受阻、呼吸急迫、体型也出现消瘦、黄疸、贫血，剖检发现淋巴结肿大、肝脏质地变硬、间质性肺炎。该病在世界范围内迅速蔓延，美国、法国、日本、北爱尔兰、韩国、德国、西班牙、意大利等国家相继发现了PMWS的感染[5-8]。我国有学者于2000年利用ELISA方法检测到了该病的存在[9]。基于此，笔者对PCV病原生物学的研究进展进行了综述，以期为今后开展猪圆环病毒的诊断及防控技术研究提供理论依据。
1 猪圆环病毒的病毒学分类
国际病毒分类委员会（ICTV）在第六次学术报告中新命名了圆环病毒科，其中包括圆环病毒属（Circovirus）、矮缩病毒属（Nanovirus）、环病毒属（Gyrovirus）以及最新定名的一个新属Anellovirus。该科病毒都是由单股圆环状的DNA链组成，无囊膜。圆环病毒科除了常见的猪圆环病毒外，还有鸭圆环病毒（Cuck circovirus， DuCV）、鹅圆环病毒（Goose circovirus， GCV）、鸽圆环病毒（Pigeoncircovirus， PiCV）、金丝雀圆环病毒（Canary circovirus， CaCV）、鹦鹉喙羽病病毒（Beak and feather disease virus， BFDV）、鸡贫血病病毒（Chicken anaemia virus， CAV ）等动物病毒。在植物中还发现了椰树叶腐烂病毒（Coconutfoliar decay virus， CFDV）、地三叶草侏儒病毒（Subterranean clover stunt virus， SCSV）、香蕉簇顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）等植物病毒[10-13]。PCV和该属其他不同成员都有2个最大的主要开放阅读框，分别负责编码病毒复制相关的Rep蛋白和病毒的衣壳结构蛋白Cap蛋白；属内成员之间复制相关的蛋白有很高的氨基酸同源性，约为40%～60%；这2种蛋白都具有环柄序列基元，这与病毒复制的启动有一定的关系[14]。
2 猪圆环病毒的形态结构与理化性质
PCV病毒粒子无囊膜、二十面对称球形，直径14～25 nm，平均直径17 nm[15]，单链闭合结构，是目前为止动物体内发现的最小的病毒之一。PCV病毒粒子是由一条多肽分子链的衣壳蛋白和核酸组成，其中衣壳蛋白分子量大约为3.6×104 Da；核酸是一个环状的DNA单链，长度为1 767或1 768 bp[16]。PCV在CsCl中浮密度为1.33～1.37 g/cm3，沉降系数约52S。PCV对不良环境有很强的抵抗力，在70 ℃高温环境中可以生存15 min[17]，56 ℃不能使其失去活性[18]。它可以在pH 3的酸性环境中长时间生存，而不被灭活。一般的消毒剂（如碘酒、酒精等）对其无效，但对氢氧化钠、次氯酸钠、季铵盐混合物、酚混合物的耐受力较弱，相对比较敏感[19]，PCV不存在血凝作用[20]。
3 PCV的体外培养
PCV可以在PK15细胞和Vero细胞中生长增殖，在动物的外周血液、肺洗液的单核细胞和巨噬细胞、骨髓、淋巴结中也可以增殖[21]，其最佳的体外培养场所是PK-15细胞，PCV病毒的复制依靠S期的细胞表达蛋白。Tischer等[22]研究发现，用DMEM处理细胞培养物后可以促进病毒在细胞内的复制，并且在细胞内形成包涵体。感染PCV病毒的PK-15培养细胞主要是以胞浆内包涵体的形式存在的，少数感染细胞内还会含有核内包涵体。 4 PCV的分子生物学特征
PCV为环状的DNA分子，只有1条单链，PCV1的全基因组长1 759 bp，其中能够编码蛋白且蛋白大于5 kD的开放阅读框有7个[23]。PCV2的全长为1 767 bp或1 768 bp，通过软件分析其全长序列，判断其中可能含有11个开放阅读框，也有人认为其实只有6个，这些开放阅读框之间大小有很大的差异[24-25]。
同种基因型的PCV基因组有较高的同源性，达到95%，而不同基因型的PCV基因组的同源性只有76%。ORF1位于病毒正链，编码病毒复制相关的Rep蛋白，它的核酸和氨基酸的同源性分别为83%和86%，差异较小。ORF2位于病毒负链，编码病毒的衣壳蛋白Cap蛋白，ORF2的差异较大，核酸和氨基酸同源性分别为67%和65%[26-27]。
在Rep蛋白和Cap蛋白之间有1段111 bp长的DNA（728～838 nt）片段，病毒复制的起始点就在这里，若发生突变将会对病毒的复制产生严重的影响[23]。研究发现，在PCV 2个主要蛋白基因之间有一条回文序列，形成茎环结构（Stemloop structure），它的顶部有一保守的九聚体结构（5’TAGTATTAC3’），而CGGCAGCGG/TCAG在这段序列中重复出现了2次，据此可以判断这段序列是启动复制蛋白的结合位点[28]。
5 PCV主要蛋白的研究进展
5.1 Rep蛋白的研究进展
Rep蛋白与病毒的复制有关，由ORF1编码[29]。PCV1的Rep蛋白为35.6 kD，由312个AA组成。PCV2的Rep蛋白为35.8 kD，由314个AA组成[24]。ORF1是一个保守的开放阅读框，这就导致不同PCV株的Rep蛋白的抗原性非常接近，氨基酸同源率达86%。正是这个原因导致了2种血清型的PCV之间存在着交叉感染。在Rep基因中存在3个与基因复制相关的保守基序 Ⅰ （FTLNN）、Ⅱ （HLQG）、Ⅲ（YCSK）及结合dNTPs的P环（Ploop）结构（序列GGKS）[30]。Rep蛋白的功能靠该结构维持，若发生突变或者缺失，都会给病毒的复制造成影响。
Rep蛋白具有很高的保守性，PCV Rep蛋白与植物的Nanovirus和Geminivirus的Rep蛋白同源性很高。根据生物进化规律及物种间亲缘关系分析表明，圆环病毒的Rep蛋白可能是Nanovirus与嵌杯样病毒之类的小RNA病毒的RNA结合蛋白或者原核生物的解旋酶发生了重组的结果[31-33]。据此推断，PCV很有可能是联系动植物病毒之间的一座桥梁。
5.2 Cap蛋白的研究进展
ORF2开放阅读框编码病毒的Cap蛋白，它是由234个氨基酸组成，分子量大小约为28 kD，是病毒入侵细胞之后在细胞内各种酶的作用下形成的病毒的核衣壳，是病毒的结构蛋白[24]。PCV感染细胞后6～12 h可以检测到细胞中Cap蛋白的存在，12 h后可以在细胞核中定位出来[34]。与ORF1有很高的保守性不同，ORF2的变异则较大，不同基因型的PCV ORF2同源性约70%。有研究人员利用软件预测PCV全序列中的抗原位点，发现PCV中存在的抗原位点共有5个，只有一个在ORF1上，其余4个全部位于ORF2中[35]。分析PCV高免血清同Cap蛋白的结合位点发现，在Cap蛋白的第169～183位氨基酸片段中，PCV1与PCV2的Cap蛋白都能与2种基因型的PCV高免血清发生特异性结合，有交叉反应性。在PCV2 Cap蛋白上有3个是针对PCV2血清型的抗原位点，分别位于氨基酸序列的65～87位、112～139位、193～207位，它们只与PCV2高免血清特异性反应，和其他血清型的高免血清没有作用。这表明在Cap蛋白的这3个区域里面有PCV2型特异性的抗原位点，其中112～139位是PCV2感染的特征，可以依此为标志建立血清学方法检测PCV2的感染[36]。有学者在研究PCV单克隆抗体的过程中发现，在PCV的Cap蛋白中存在着一个中和抗原表位[37]。将PCV2 ORF2基因和它的连续缺失产物，与PCV1 ORF2相交换，在PCV1的基础上构建了带有PCV2 ORF2基因片段的PCV1/PCV2重组嵌合病毒。再通过PCV2的特异性单克隆抗体来研究不同类型嵌合病毒的免疫反应性的差别，定位PCV2的Cap蛋白表位，结果表明在PCV2的Cap蛋白的第47～233位的氨基酸序列中，至少存在5个优势表位。在230～233位区域内，PCV2阳性血清和嵌合病毒结合于Cap蛋白氨基酸区域内，分别定位在63～85以及165～185位。在Cap蛋白N端部分含有丰富碱性氨基酸，在装配阶段和DNA结合，这部分氨基酸可能与病毒衣壳的内表面形成有一定的关系[38]。
2001年，Liu等[39]用原核表達系统表达出ORF2基因，并且证明了表达出来的蛋白有很强的免疫原性。也有学者利用真核表达出了PCV ORF2蛋白，通过对表达产物的分析发现，其中至少存在着2个糖基化位点；Westernblot分析表明，表达产物的片段大小和PCV病毒的核衣壳大小十分相近，将该产物纯化染色后在电子显微镜下观察，其形态与PCV病毒粒子非常相似，直径为17 nm，有些颗粒由于中心浓染而类似于空衣壳，结果证实了表达出的蛋白可以在体外环境中组装成病毒样粒子。在细胞中表达的Cap蛋白可以被定位于核周，进一步研究发现其中对定位信号起到决定作用的是12～18和34～41位区域内的碱性氨基酸[40]。用大肠杆菌表达系统表达基因定位域缺失的ORF2 rCap蛋白，结果表明该蛋白的单克隆抗体同样保留Cap蛋白的反应原性，并且同时保持了对PCV2的中和活性[41]。
PCV2毒力的大小与ORF2基因有很大的关系，不同地区分离到的PCV2毒株之所以毒力不同，很可能是由于ORF2基因发生了变异造成的，并且ORF2基因还可能影响病毒在细胞中的增殖滴度。Fenaux等将PCV1和PCV2的ORF2基因互相调换，构建了2株嵌合型病毒，分别是PCV1为基础导入PCV2 ORF2的PCV12和以PCV2为基础导入PCV1 ORF2的PCV21。在导入PCV1 ORF2置换后，PCV2的毒力大大降低[42]。将PCV2感染PK15细胞，经过120代连续传代后，可以发现病毒的增殖滴度第1代为102.83TCID50/ml，第120代病毒的增殖滴度可升高到103.75TCID50/ml，经过连续传代的病毒的毒力也大大减弱。收集各个代次的病毒，分别将全基因组测序，通过对比发现在120代病毒的ORF2中出现了2个位点的突变，其中1个为110位P变为A，另1个是第191位由R变成S。这说明这2个位点的突变可能造成了病毒毒力的改变。 参考文献
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关键词 猪圆环病毒；病原；基因结构；生物学
中图分类号 S852.65+1 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）22-089-03
AbstractThe genome of porcine circovirus consists of circular and single-stranded DNA molecules， which has two kinds of serotype， PCV1 and PCV2. Researches have revealed that PCV1 has no pathogenic， and PCV2 is thought to be the main pathogen of porcine circovirus virus disease.The economic benefits of pig industry suffered a significant influence in many countries. The research progresses of PCV pathogenic biology were summarized in this article.
Key words Porcine circovirus； Pathogeny； Gene structure； Biology
1974年，科学家Tisher等观察几株传代PK15细胞时在显微镜下发现了一种类似细小病毒的圆形颗粒状粒子，这些小粒子并不导致细胞病变，因此被研究人员认为是一种普通的污染物[1]。直到1982年，Tischer等用超速离心机离心后提取了该病毒粒子，通过电镜观察病毒形态，终于发现这并不是普通的细胞污染物，而是一类没有囊膜的单链环状DNA病毒，并將其命名为猪圆环病毒（Porcine circovirus， PCV）。此后，在德国、加拿大、英国、北爱尔兰、新西兰、美国等国家的猪群中PCV抗体血清均检测呈阳性，但人工感染该PCV病毒后并不会造成猪只临床症状和病理上的变化[2-4]。1991年，Clark等在加拿大某些猪场中首次发现1种被称为断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wasting syndrome， PMWS）的传染病，被感染的仔猪生长受阻、呼吸急迫、体型也出现消瘦、黄疸、贫血，剖检发现淋巴结肿大、肝脏质地变硬、间质性肺炎。该病在世界范围内迅速蔓延，美国、法国、日本、北爱尔兰、韩国、德国、西班牙、意大利等国家相继发现了PMWS的感染[5-8]。我国有学者于2000年利用ELISA方法检测到了该病的存在[9]。基于此，笔者对PCV病原生物学的研究进展进行了综述，以期为今后开展猪圆环病毒的诊断及防控技术研究提供理论依据。
1 猪圆环病毒的病毒学分类
国际病毒分类委员会（ICTV）在第六次学术报告中新命名了圆环病毒科，其中包括圆环病毒属（Circovirus）、矮缩病毒属（Nanovirus）、环病毒属（Gyrovirus）以及最新定名的一个新属Anellovirus。该科病毒都是由单股圆环状的DNA链组成，无囊膜。圆环病毒科除了常见的猪圆环病毒外，还有鸭圆环病毒（Cuck circovirus， DuCV）、鹅圆环病毒（Goose circovirus， GCV）、鸽圆环病毒（Pigeoncircovirus， PiCV）、金丝雀圆环病毒（Canary circovirus， CaCV）、鹦鹉喙羽病病毒（Beak and feather disease virus， BFDV）、鸡贫血病病毒（Chicken anaemia virus， CAV ）等动物病毒。在植物中还发现了椰树叶腐烂病毒（Coconutfoliar decay virus， CFDV）、地三叶草侏儒病毒（Subterranean clover stunt virus， SCSV）、香蕉簇顶病毒（Banana bunchy top virus，BBTV）等植物病毒[10-13]。PCV和该属其他不同成员都有2个最大的主要开放阅读框，分别负责编码病毒复制相关的Rep蛋白和病毒的衣壳结构蛋白Cap蛋白；属内成员之间复制相关的蛋白有很高的氨基酸同源性，约为40%～60%；这2种蛋白都具有环柄序列基元，这与病毒复制的启动有一定的关系[14]。
2 猪圆环病毒的形态结构与理化性质
PCV病毒粒子无囊膜、二十面对称球形，直径14～25 nm，平均直径17 nm[15]，单链闭合结构，是目前为止动物体内发现的最小的病毒之一。PCV病毒粒子是由一条多肽分子链的衣壳蛋白和核酸组成，其中衣壳蛋白分子量大约为3.6×104 Da；核酸是一个环状的DNA单链，长度为1 767或1 768 bp[16]。PCV在CsCl中浮密度为1.33～1.37 g/cm3，沉降系数约52S。PCV对不良环境有很强的抵抗力，在70 ℃高温环境中可以生存15 min[17]，56 ℃不能使其失去活性[18]。它可以在pH 3的酸性环境中长时间生存，而不被灭活。一般的消毒剂（如碘酒、酒精等）对其无效，但对氢氧化钠、次氯酸钠、季铵盐混合物、酚混合物的耐受力较弱，相对比较敏感[19]，PCV不存在血凝作用[20]。
3 PCV的体外培养
PCV可以在PK15细胞和Vero细胞中生长增殖，在动物的外周血液、肺洗液的单核细胞和巨噬细胞、骨髓、淋巴结中也可以增殖[21]，其最佳的体外培养场所是PK-15细胞，PCV病毒的复制依靠S期的细胞表达蛋白。Tischer等[22]研究发现，用DMEM处理细胞培养物后可以促进病毒在细胞内的复制，并且在细胞内形成包涵体。感染PCV病毒的PK-15培养细胞主要是以胞浆内包涵体的形式存在的，少数感染细胞内还会含有核内包涵体。 4 PCV的分子生物学特征
PCV为环状的DNA分子，只有1条单链，PCV1的全基因组长1 759 bp，其中能够编码蛋白且蛋白大于5 kD的开放阅读框有7个[23]。PCV2的全长为1 767 bp或1 768 bp，通过软件分析其全长序列，判断其中可能含有11个开放阅读框，也有人认为其实只有6个，这些开放阅读框之间大小有很大的差异[24-25]。
同种基因型的PCV基因组有较高的同源性，达到95%，而不同基因型的PCV基因组的同源性只有76%。ORF1位于病毒正链，编码病毒复制相关的Rep蛋白，它的核酸和氨基酸的同源性分别为83%和86%，差异较小。ORF2位于病毒负链，编码病毒的衣壳蛋白Cap蛋白，ORF2的差异较大，核酸和氨基酸同源性分别为67%和65%[26-27]。
在Rep蛋白和Cap蛋白之间有1段111 bp长的DNA（728～838 nt）片段，病毒复制的起始点就在这里，若发生突变将会对病毒的复制产生严重的影响[23]。研究发现，在PCV 2个主要蛋白基因之间有一条回文序列，形成茎环结构（Stemloop structure），它的顶部有一保守的九聚体结构（5’TAGTATTAC3’），而CGGCAGCGG/TCAG在这段序列中重复出现了2次，据此可以判断这段序列是启动复制蛋白的结合位点[28]。
5 PCV主要蛋白的研究进展
5.1 Rep蛋白的研究进展
Rep蛋白与病毒的复制有关，由ORF1编码[29]。PCV1的Rep蛋白为35.6 kD，由312个AA组成。PCV2的Rep蛋白为35.8 kD，由314个AA组成[24]。ORF1是一个保守的开放阅读框，这就导致不同PCV株的Rep蛋白的抗原性非常接近，氨基酸同源率达86%。正是这个原因导致了2种血清型的PCV之间存在着交叉感染。在Rep基因中存在3个与基因复制相关的保守基序 Ⅰ （FTLNN）、Ⅱ （HLQG）、Ⅲ（YCSK）及结合dNTPs的P环（Ploop）结构（序列GGKS）[30]。Rep蛋白的功能靠该结构维持，若发生突变或者缺失，都会给病毒的复制造成影响。
Rep蛋白具有很高的保守性，PCV Rep蛋白与植物的Nanovirus和Geminivirus的Rep蛋白同源性很高。根据生物进化规律及物种间亲缘关系分析表明，圆环病毒的Rep蛋白可能是Nanovirus与嵌杯样病毒之类的小RNA病毒的RNA结合蛋白或者原核生物的解旋酶发生了重组的结果[31-33]。据此推断，PCV很有可能是联系动植物病毒之间的一座桥梁。
5.2 Cap蛋白的研究进展
ORF2开放阅读框编码病毒的Cap蛋白，它是由234个氨基酸组成，分子量大小约为28 kD，是病毒入侵细胞之后在细胞内各种酶的作用下形成的病毒的核衣壳，是病毒的结构蛋白[24]。PCV感染细胞后6～12 h可以检测到细胞中Cap蛋白的存在，12 h后可以在细胞核中定位出来[34]。与ORF1有很高的保守性不同，ORF2的变异则较大，不同基因型的PCV ORF2同源性约70%。有研究人员利用软件预测PCV全序列中的抗原位点，发现PCV中存在的抗原位点共有5个，只有一个在ORF1上，其余4个全部位于ORF2中[35]。分析PCV高免血清同Cap蛋白的结合位点发现，在Cap蛋白的第169～183位氨基酸片段中，PCV1与PCV2的Cap蛋白都能与2种基因型的PCV高免血清发生特异性结合，有交叉反应性。在PCV2 Cap蛋白上有3个是针对PCV2血清型的抗原位点，分别位于氨基酸序列的65～87位、112～139位、193～207位，它们只与PCV2高免血清特异性反应，和其他血清型的高免血清没有作用。这表明在Cap蛋白的这3个区域里面有PCV2型特异性的抗原位点，其中112～139位是PCV2感染的特征，可以依此为标志建立血清学方法检测PCV2的感染[36]。有学者在研究PCV单克隆抗体的过程中发现，在PCV的Cap蛋白中存在着一个中和抗原表位[37]。将PCV2 ORF2基因和它的连续缺失产物，与PCV1 ORF2相交换，在PCV1的基础上构建了带有PCV2 ORF2基因片段的PCV1/PCV2重组嵌合病毒。再通过PCV2的特异性单克隆抗体来研究不同类型嵌合病毒的免疫反应性的差别，定位PCV2的Cap蛋白表位，结果表明在PCV2的Cap蛋白的第47～233位的氨基酸序列中，至少存在5个优势表位。在230～233位区域内，PCV2阳性血清和嵌合病毒结合于Cap蛋白氨基酸区域内，分别定位在63～85以及165～185位。在Cap蛋白N端部分含有丰富碱性氨基酸，在装配阶段和DNA结合，这部分氨基酸可能与病毒衣壳的内表面形成有一定的关系[38]。
2001年，Liu等[39]用原核表達系统表达出ORF2基因，并且证明了表达出来的蛋白有很强的免疫原性。也有学者利用真核表达出了PCV ORF2蛋白，通过对表达产物的分析发现，其中至少存在着2个糖基化位点；Westernblot分析表明，表达产物的片段大小和PCV病毒的核衣壳大小十分相近，将该产物纯化染色后在电子显微镜下观察，其形态与PCV病毒粒子非常相似，直径为17 nm，有些颗粒由于中心浓染而类似于空衣壳，结果证实了表达出的蛋白可以在体外环境中组装成病毒样粒子。在细胞中表达的Cap蛋白可以被定位于核周，进一步研究发现其中对定位信号起到决定作用的是12～18和34～41位区域内的碱性氨基酸[40]。用大肠杆菌表达系统表达基因定位域缺失的ORF2 rCap蛋白，结果表明该蛋白的单克隆抗体同样保留Cap蛋白的反应原性，并且同时保持了对PCV2的中和活性[41]。
PCV2毒力的大小与ORF2基因有很大的关系，不同地区分离到的PCV2毒株之所以毒力不同，很可能是由于ORF2基因发生了变异造成的，并且ORF2基因还可能影响病毒在细胞中的增殖滴度。Fenaux等将PCV1和PCV2的ORF2基因互相调换，构建了2株嵌合型病毒，分别是PCV1为基础导入PCV2 ORF2的PCV12和以PCV2为基础导入PCV1 ORF2的PCV21。在导入PCV1 ORF2置换后，PCV2的毒力大大降低[42]。将PCV2感染PK15细胞，经过120代连续传代后，可以发现病毒的增殖滴度第1代为102.83TCID50/ml，第120代病毒的增殖滴度可升高到103.75TCID50/ml，经过连续传代的病毒的毒力也大大减弱。收集各个代次的病毒，分别将全基因组测序，通过对比发现在120代病毒的ORF2中出现了2个位点的突变，其中1个为110位P变为A，另1个是第191位由R变成S。这说明这2个位点的突变可能造成了病毒毒力的改变。 参考文献
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