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摘要：通过比对分析已知昆虫氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）氨基酸序列并结合本实验室的美国白蛾（Hyphantria cunea）中肠iTRAQ结果，设计了hcapn3基因特异引物，获得hcapn3基因片段。通过RACEPCR技术获得美国白蛾中肠氨肽酶N基因（hcapn3）全长序列（GenBank登录号为KJ013598）。Blastp分析表明，获得的氨肽酶属于氨肽酶N3家族，命名为HcAPN3。序列分析显示HcAPN3包括952个氨基酸残基，具有典型的谷氨酸锌化氨肽酶（Gluzincin）结构域和羧基端（ERAP1_C）结构域。利用Bac to Bac表达系统在昆虫细胞中表达108 kDa的 HcAPN3蛋白。在原核表达系统中表达58 kDa 的Gluzincin结构域和49 kDa ERAP1_C的结构域蛋白。Ligand Blot分析结果显示，HcAPN3蛋白及Gluzincin结构域可与Cry1Ac蛋白特异性结合，但ERAP1_C结构域未能与Cry1Ac结合。本研究首次克隆了美国白蛾氨肽酶基因并分析了HcAPN3与Cry1Ac的结合特性，为下一步功能研究提供基础。
关键词：美国白蛾； 氨肽酶N； HcAPN3； Gluzincin结构域； Ligand Blot分析
中图分类号： S 433.4；S 763.3
文献标识码： A
美国白蛾[Hyphantria cunea （Drury）]是一种重要的世界性检疫害虫。适应性强，食性广，繁殖能力强的特点为其大范围传播和为害提供了条件。该虫现已从北美传播至18个欧亚国家和地区[1]。1979年传入我国以来，已迅速扩展至长江以南地区，每年给我国农林业生产造成巨大的损失[12]。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界范围内产量最大、应用范围最广的环境友好型微生物杀虫剂，其杀虫蛋白基因也是目前应用得最为广泛和最有潜力的一类抗虫基因[25]。目前研究者已筛选分离出多种对美国白蛾高毒力的Bt菌株，并对其杀虫晶体蛋白以及基因类型进行了研究，结果表明，对美国白蛾高毒力的Bt菌株中均鉴定出Cry1Ac基因型[2，6]，本研究前期工作证明Cry1Ac蛋白是对美国白蛾高毒力的杀虫晶体蛋白。
Bt Cry蛋白可与昆虫中肠上皮刷状缘膜（BBMV）特异性结合，从而引起昆虫中肠结构及生理发生变化，使昆虫死亡[7]。其在BBMV上的受体主要有4类，分别是类钙黏蛋白（cadherinlike protein）、氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、碱性磷酸脂酶（alkaline phosphatase，ALP）和糖脂（glycolipids）[711]。其中氨肽酶N是研究最多的一种重要的受体蛋白。
氨肽酶N是一种依赖于Zn2 的N端水解酶类[910]，存在于中肠的BBMV上[11]， 是Bt毒素的重要受体之一。Knight等1994年首次从烟草天蛾中分离得到APN1，并证实其为Bt毒素的受体[12]，此后，相继从舞毒蛾[13]、烟芽夜蛾[14]、家蚕[15]、欧洲玉米螟及亚洲玉米螟[1617]、甜菜夜蛾[18]，埃及伊蚊[19]等昆虫中克隆了APN基因，并证实其蛋白为Bt毒素的受体。目前在GenBank中已登记50多种APN基因，关于美国白蛾中肠受体蛋白的研究尚未有报道。本研究首次分离鉴定了美国白蛾中肠APN3蛋白，与Cry1Ac蛋白进行了配体印迹分析，为进一步研究美国白蛾中肠氨肽酶功能，及与Bt杀虫蛋白相互作用机制奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫及细胞
美国白蛾（Hyphantria cunea）幼虫采集自河北省保定市，在室内进行饲养。粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞系BTITn5B14（High Five细胞），由青岛农业大学李国勋教授惠赠。
1.1.2 主要试剂
RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）购自QIAGEN公司；反转录试剂盒购自Promega；凝胶回收试剂盒购自天根有限公司；限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；T4快速连接酶购自Thermo公司；大肠杆菌DH5α、BL21和DH10Bac菌种由本实验室保存并用于制备感受态细胞；Bt（Cry1Ac）菌株由本实验室保存，Cry1Ac蛋白抗体由河北省生物研究所制备；蛋白质定量检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清购自美国Invitrogen公司；昆虫细胞培养基TNMFH insect medium购自Sigma公司；杆状病毒表达系统（BactoBac Baculovirus Expression System）购自美国Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 hcapn3全长基因序列的获得
解剖美国白蛾，提取中肠并将其迅速置于液氮，用研钵研磨至粉末，按试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA质量。按反转录试剂盒说明书将1 μg总RNA 反转录为cDNA。利用美国白蛾中肠iTRAQ结果，经序列比对设计hcapn3基因特异引物，APNF：5′GAACTGGGGAATGGTTAACT3′（NWGMVN）；APNR：5′AGAACAAAACGTCGTTGAC3′（VNDVLF）。
以合成的 cDNA 第一链为模板，用引物APNF和APNR进行 PCR 扩增，其扩增参数为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 45 s，51 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，25个循环；72℃保温 10 min，4 ℃保存。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收，回收产物送北京华大基因测序。根据测序结果分别设计5′RACE及3′RACE引物，APN5F：5′CTAGTGGAGAAGTGGGCAGTGATTGAAGGGAGA3′；APN3R：5′CGCTATACAATCTCCGGGGTTAGGCCAGCTG3′。按照RACE反转录试剂盒说明合成5′RACE和3′RACE模板，并分别进行PCR扩增。扩增参数如下：94 ℃预变性 3 min，74 ℃延伸2 min，5 个循环；94 ℃变性3 min，72 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，5 个循环；94 ℃变性3 min，72 ℃退火 45 s，70 ℃延伸 2 min，25 个循环；4 ℃保存。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，回收产物送北京华大基因公司测序。 1.2.2 hcapn3序列分析
通过CBS Prediction Server预测信号肽序列，糖基化位点，通过GPI Prediction Server分析GPI锚定位点，利用Blastp进行结构域分析，通过DNAMAN 分析开放阅读框，等电点及蛋白分子量。
1.2.3 hcapn3在昆虫细胞系中的表达
设计扩增hcapn3的上下游引物，并引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点。F：5′AAATATGCGGCCGCTACCAACGCCATGATTCTATCGATC3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；R：5′CCGCTCGAGATGGAACAACTGGGCGAATAGTACTGC3′（下画线部分为XhoⅠ酶切位点）。
PCR产物经纯化、酶切后与载体连接。将10 μL连接产物转化至100 μL DH5α感受态细胞，涂布于含有100 mg/L Amp的LB平板上。PCR及酶切方法鉴定阳性重组子，取1 mL菌液送至北京华大基因测序。
鉴定正确的重组子转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，37 ℃，220 r/min培养4 h，涂布于含IPTG （40 μg/mL），Xgal （100 μg/mL），Kan （50 μg/mL），Gen （7 μg/mL），Tet （10 μg/mL）的LB平板上，37 ℃培养48 h，挑取白色单克隆菌落，提取重组Bacmid DNA，进行PCR鉴定。鉴定正确的重组Bacmid DNA按照Bac to Bac 试剂盒说明，利用脂质体CellfectinⅡ reagent转染昆虫High Five细胞，27℃培养72 h，收集上清为第一代病毒株（P1），取P1病毒上清液感染对数生长期的High Five细胞，出现感染迹象后，500 g离心5 min收集上清液，即为扩增后的P2病毒，按此方法扩增P3病毒，病毒滴度达到1×108 pfu/mL后，收集蛋白进行SDSPAGE电泳及Western Blot分析。
1.2.4 HcAPN3结构域的克隆与表达
将获得的hcapn3全长序列进行Blastp分析，分别设计扩增Gluzincin（16～524 aa）和ERAP1_C（517～952 aa）结构域cDNA序列特异引物，并分别在上游和下游引物中引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点，GluF1：5′AAATATGCGGCCGCGCCTTCCCCGATGAAGACTACAGGT3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；GluR1：5′CCGCTCGAGTACAGGATCCAGGGAAGCAAAAACAA3′（下画线部分为XhoⅠ酶切位点）；ERAP1_C F2：5′AAATATGCGGCCGCGTTTTTGCTTCCCTGGATCCTGTA3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；ERAP1_C R2：5′CCGCTCGAGATGGAACAACTGGGCGAATAGTACTGC3′（下画线部分为Xho Ⅰ酶切位点）。
以合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，参数如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，65 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，25个循环；72℃保温10 min，4 ℃保存。
PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，纯化的PCR产物和pET30a载体经NotⅠ和XhoⅠ同时双酶切，回收酶切产物，进行连接。将10 μL连接产物转化至100 μL BL21感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上。PCR及酶切方法鉴定阳性重组子。
鉴定正确的重组子经1 mmol/L IPTG，37 ℃，220 r/min诱导蛋白表达，参照《分子克隆实验指南》[20]进行SDSPAGE电泳，Western Blot 分析。
1.2.5 重组蛋白与Cry1Ac的配体印迹分析
参照Bravo等的方法[10]提取Cry1Ac蛋白，利用蛋白质定量检测试剂盒测定Cry1Ac蛋白浓度。按照Cry1Ac与胰蛋白酶质量比为40∶1，于26 ℃处理4 h，获得有活性的毒素片段。
HcAPN3重组蛋白及结构域蛋白进行SDSPAGE电泳，转至PVDF膜，以1% BSA封闭1 h，与胰蛋白酶消化后的Cry1Ac毒蛋白孵育1 h，洗膜，以Cry1Ac抗体为一抗，以AP偶联的羊抗兔IgG抗体为二抗，进行Ligand Blot分析。
2 结果与分析
2.1 hcapn3基因的克隆
PCR扩增获得922 bp的目的hcapn3基因片段。5′RACE和3′RACE反应分别获得约1.4 kb和1.7 kb的片段（图1），RACE反应产物测序后序列拼接，获得hcapn3的全长序列。设计特异引物进行PCR扩增得到2.9 kb的全长基因片段（图2）。经Blastp分析可知，获得的全长基因编码美国白蛾氨肽酶N3，命名为hcapn3，推导的氨基酸序列与舞毒蛾APN3（GenBank登录号：AAL26894.1）相似性最高，达65.13%。
2.2 hcapn3序列分析
hcapn3基因GenBank登录号为KJ013598，开放阅读框为2 859 bp，编码952个氨基酸残基，预测分子量大小为108.2 kDa，等电点为4.84。推导的氨基酸序列N端具有15个氨基酸的信号肽序列，C末端930，931位氨基酸残基为预测的GPI锚定位点，含有Gluzincin 和ERAP1_C保守结构域，谷氨酸锌化氨肽酶的保守氨基酸序列GAMEN。糖基化位点预测结果显示HcAPN3含有2个O糖基化位点，分别位于414和566位，6个N糖基化位点分别位于133、373、419、641、654、930位。预测的跨膜片段位于227～245位氨基酸残基。 2.3 hcapn3在昆虫细胞系中的表达
重组病毒作为分泌蛋白存在于培养基中，转染High Five细胞后48 h收集培养基，离心取上清，作为P1原代病毒，继续感染对数生长期的High Five细胞，出现感染迹象后，离心收集上清，即为扩增后的P2病毒，继续扩增获取P3病毒，离心取上清进行SDSPAGE及Western Blot分析，结果显示HcAPN3在昆虫细胞系中成功表达108 kDa的蛋白（图3）。
2.4 HcAPN3结构域在大肠杆菌中的表达
HcAPN3结构域表达分析结果表明，37 ℃，以1 mmol/L IPTG进行诱导，Gluzincin 和ERAP1_C 两个结构域重组蛋白得到成功表达，分别表达约58 kDa和 49 kDa的目的蛋白（图4a～b）。
2.5 重组蛋白与Cry1Ac蛋白的配体印迹（Ligand Blot）分析
配体印迹分析结果显示，HcAPN3重组蛋白和Gluzincin结构域能分别与Cry1Ac蛋白结合产生108 kDa和58 kDa条带（图5），表明 HcAPN3重组蛋白和Gluzincin结构域可与Cry1Ac结合，而ERAP1_C结构域重组蛋白未能与Cry1Ac发生结合（图5）。
3 讨论
APN目前已被确认为是Bt毒素的受体[1517]，其作为受体的功能已被广泛研究。然而APN同工酶家族种类较多，其结构特点也不尽相同[17]，尤其在不同的物种中差异较大，不同的 Bt Cry蛋白通过与不同种类的APN互作，从而起到杀虫作用[21]。目前研究认为各类APN在昆虫体内同时表达，并且分子量、酶活性、糖基化特征等相似度高，使其难以分离和纯化[22]，因而分离鉴定APN同工酶的种类对于研究Bt Cry蛋白的杀虫机理以及为APN的分类提供依据等都有着重要的意义。本研究通过PCR及RACEPCR技术首次成功分离鉴定了美国白蛾APN3全长基因序列，并在昆虫细胞系中成功表达HcAPN3全长蛋白。序列分析表明HcAPN3具有的典型氨肽酶结构特征，即属于锌金属肽酶，N末端具有信号肽，C末端含有糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号序列，锌结合位点HEXXH，谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN，含有Gluzincin和ERAP1_C保守结构域。
闫志利等研制的唐海1号Bt制剂2万IU/mg 500～1 500倍液对美国白蛾防效接近100%[5]。徐明等利用Bt悬浮剂与灭幼脲的混剂对美国白蛾进行防治，结果显示混剂对第2～3代幼虫的毒力指数均高于100，防治效果良好[3]。陈颖等利用Bt15A3对美国白蛾的防治试验表明Bt15A3水悬剂防治2～3龄、4～5龄幼虫，200倍液用药后3 d校正防效分别达到100%、98.00%[23]。陈月华等从Bt15A3中鉴定出Cry1Ac基因型[24]，于涛等[2]和赵焕丽等[6]在筛选对美国白蛾高毒力的Bt菌株中均鉴定出Cry1Ac基因型，本试验前期研究证明Cry1Ac蛋白是对美国白蛾高毒力的杀虫晶体蛋白。Wang等发现通过原核表达的棉铃虫APN3蛋白可与Cry1Ac发生结合[25]。本研究通过Ligand Blot分析发现昆虫细胞系表达的HcAPN3重组蛋白可以与Cry1Ac发生特异性结合，推测其可能为Cry1Ac蛋白的结合蛋白。为了进一步验证Cry1Ac蛋白与APN蛋白结合区域，在大肠杆菌中分别克隆和表达了hcapn3保守的Gluzincin 和ERAP1_C结构域。由于昆虫细胞系表达蛋白周期较长，所以我们利用周期较短的原核表达系统对结构域蛋白进行表达。结果显示Gluzincin结构域可与Cry1Ac特异结合，而ERAP1_C结构域则不能与Cry1Ac发生结合，推测Cry1Ac 与 HcAPN3的结合区域位于Gluzincin保守结构域，但HcAPN3是否为Cry1Ac蛋白的受体蛋白以及与Cry1Ac的具体结合位点还需进一步研究。本研究通过分离鉴定新的hcapn3基因，为研究美国白蛾氨肽酶基因的功能，阐明Bt Cry蛋白与受体蛋白的作用机理奠定理论基础。
参考文献
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关键词：美国白蛾； 氨肽酶N； HcAPN3； Gluzincin结构域； Ligand Blot分析
中图分类号： S 433.4；S 763.3
文献标识码： A
美国白蛾[Hyphantria cunea （Drury）]是一种重要的世界性检疫害虫。适应性强，食性广，繁殖能力强的特点为其大范围传播和为害提供了条件。该虫现已从北美传播至18个欧亚国家和地区[1]。1979年传入我国以来，已迅速扩展至长江以南地区，每年给我国农林业生产造成巨大的损失[12]。
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前世界范围内产量最大、应用范围最广的环境友好型微生物杀虫剂，其杀虫蛋白基因也是目前应用得最为广泛和最有潜力的一类抗虫基因[25]。目前研究者已筛选分离出多种对美国白蛾高毒力的Bt菌株，并对其杀虫晶体蛋白以及基因类型进行了研究，结果表明，对美国白蛾高毒力的Bt菌株中均鉴定出Cry1Ac基因型[2，6]，本研究前期工作证明Cry1Ac蛋白是对美国白蛾高毒力的杀虫晶体蛋白。
Bt Cry蛋白可与昆虫中肠上皮刷状缘膜（BBMV）特异性结合，从而引起昆虫中肠结构及生理发生变化，使昆虫死亡[7]。其在BBMV上的受体主要有4类，分别是类钙黏蛋白（cadherinlike protein）、氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）、碱性磷酸脂酶（alkaline phosphatase，ALP）和糖脂（glycolipids）[711]。其中氨肽酶N是研究最多的一种重要的受体蛋白。
氨肽酶N是一种依赖于Zn2 的N端水解酶类[910]，存在于中肠的BBMV上[11]， 是Bt毒素的重要受体之一。Knight等1994年首次从烟草天蛾中分离得到APN1，并证实其为Bt毒素的受体[12]，此后，相继从舞毒蛾[13]、烟芽夜蛾[14]、家蚕[15]、欧洲玉米螟及亚洲玉米螟[1617]、甜菜夜蛾[18]，埃及伊蚊[19]等昆虫中克隆了APN基因，并证实其蛋白为Bt毒素的受体。目前在GenBank中已登记50多种APN基因，关于美国白蛾中肠受体蛋白的研究尚未有报道。本研究首次分离鉴定了美国白蛾中肠APN3蛋白，与Cry1Ac蛋白进行了配体印迹分析，为进一步研究美国白蛾中肠氨肽酶功能，及与Bt杀虫蛋白相互作用机制奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 供试昆虫及细胞
美国白蛾（Hyphantria cunea）幼虫采集自河北省保定市，在室内进行饲养。粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞系BTITn5B14（High Five细胞），由青岛农业大学李国勋教授惠赠。
1.1.2 主要试剂
RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）购自QIAGEN公司；反转录试剂盒购自Promega；凝胶回收试剂盒购自天根有限公司；限制性内切酶购自宝生物工程有限公司；T4快速连接酶购自Thermo公司；大肠杆菌DH5α、BL21和DH10Bac菌种由本实验室保存并用于制备感受态细胞；Bt（Cry1Ac）菌株由本实验室保存，Cry1Ac蛋白抗体由河北省生物研究所制备；蛋白质定量检测试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清购自美国Invitrogen公司；昆虫细胞培养基TNMFH insect medium购自Sigma公司；杆状病毒表达系统（BactoBac Baculovirus Expression System）购自美国Invitrogen公司。
1.2 方法
1.2.1 hcapn3全长基因序列的获得
解剖美国白蛾，提取中肠并将其迅速置于液氮，用研钵研磨至粉末，按试剂盒说明书提取总RNA，检测RNA质量。按反转录试剂盒说明书将1 μg总RNA 反转录为cDNA。利用美国白蛾中肠iTRAQ结果，经序列比对设计hcapn3基因特异引物，APNF：5′GAACTGGGGAATGGTTAACT3′（NWGMVN）；APNR：5′AGAACAAAACGTCGTTGAC3′（VNDVLF）。
以合成的 cDNA 第一链为模板，用引物APNF和APNR进行 PCR 扩增，其扩增参数为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 45 s，51 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 1 min，25个循环；72℃保温 10 min，4 ℃保存。PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后，纯化回收，回收产物送北京华大基因测序。根据测序结果分别设计5′RACE及3′RACE引物，APN5F：5′CTAGTGGAGAAGTGGGCAGTGATTGAAGGGAGA3′；APN3R：5′CGCTATACAATCTCCGGGGTTAGGCCAGCTG3′。按照RACE反转录试剂盒说明合成5′RACE和3′RACE模板，并分别进行PCR扩增。扩增参数如下：94 ℃预变性 3 min，74 ℃延伸2 min，5 个循环；94 ℃变性3 min，72 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 2 min，5 个循环；94 ℃变性3 min，72 ℃退火 45 s，70 ℃延伸 2 min，25 个循环；4 ℃保存。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后按照凝胶回收试剂盒说明书进行纯化回收，回收产物送北京华大基因公司测序。 1.2.2 hcapn3序列分析
通过CBS Prediction Server预测信号肽序列，糖基化位点，通过GPI Prediction Server分析GPI锚定位点，利用Blastp进行结构域分析，通过DNAMAN 分析开放阅读框，等电点及蛋白分子量。
1.2.3 hcapn3在昆虫细胞系中的表达
设计扩增hcapn3的上下游引物，并引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点。F：5′AAATATGCGGCCGCTACCAACGCCATGATTCTATCGATC3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；R：5′CCGCTCGAGATGGAACAACTGGGCGAATAGTACTGC3′（下画线部分为XhoⅠ酶切位点）。
PCR产物经纯化、酶切后与载体连接。将10 μL连接产物转化至100 μL DH5α感受态细胞，涂布于含有100 mg/L Amp的LB平板上。PCR及酶切方法鉴定阳性重组子，取1 mL菌液送至北京华大基因测序。
鉴定正确的重组子转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，37 ℃，220 r/min培养4 h，涂布于含IPTG （40 μg/mL），Xgal （100 μg/mL），Kan （50 μg/mL），Gen （7 μg/mL），Tet （10 μg/mL）的LB平板上，37 ℃培养48 h，挑取白色单克隆菌落，提取重组Bacmid DNA，进行PCR鉴定。鉴定正确的重组Bacmid DNA按照Bac to Bac 试剂盒说明，利用脂质体CellfectinⅡ reagent转染昆虫High Five细胞，27℃培养72 h，收集上清为第一代病毒株（P1），取P1病毒上清液感染对数生长期的High Five细胞，出现感染迹象后，500 g离心5 min收集上清液，即为扩增后的P2病毒，按此方法扩增P3病毒，病毒滴度达到1×108 pfu/mL后，收集蛋白进行SDSPAGE电泳及Western Blot分析。
1.2.4 HcAPN3结构域的克隆与表达
将获得的hcapn3全长序列进行Blastp分析，分别设计扩增Gluzincin（16～524 aa）和ERAP1_C（517～952 aa）结构域cDNA序列特异引物，并分别在上游和下游引物中引入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点，GluF1：5′AAATATGCGGCCGCGCCTTCCCCGATGAAGACTACAGGT3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；GluR1：5′CCGCTCGAGTACAGGATCCAGGGAAGCAAAAACAA3′（下画线部分为XhoⅠ酶切位点）；ERAP1_C F2：5′AAATATGCGGCCGCGTTTTTGCTTCCCTGGATCCTGTA3′（下画线部分为NotⅠ酶切位点）；ERAP1_C R2：5′CCGCTCGAGATGGAACAACTGGGCGAATAGTACTGC3′（下画线部分为Xho Ⅰ酶切位点）。
以合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，参数如下：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性45 s，65 ℃退火45 s，72℃延伸1 min，25个循环；72℃保温10 min，4 ℃保存。
PCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，纯化的PCR产物和pET30a载体经NotⅠ和XhoⅠ同时双酶切，回收酶切产物，进行连接。将10 μL连接产物转化至100 μL BL21感受态细胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上。PCR及酶切方法鉴定阳性重组子。
鉴定正确的重组子经1 mmol/L IPTG，37 ℃，220 r/min诱导蛋白表达，参照《分子克隆实验指南》[20]进行SDSPAGE电泳，Western Blot 分析。
1.2.5 重组蛋白与Cry1Ac的配体印迹分析
参照Bravo等的方法[10]提取Cry1Ac蛋白，利用蛋白质定量检测试剂盒测定Cry1Ac蛋白浓度。按照Cry1Ac与胰蛋白酶质量比为40∶1，于26 ℃处理4 h，获得有活性的毒素片段。
HcAPN3重组蛋白及结构域蛋白进行SDSPAGE电泳，转至PVDF膜，以1% BSA封闭1 h，与胰蛋白酶消化后的Cry1Ac毒蛋白孵育1 h，洗膜，以Cry1Ac抗体为一抗，以AP偶联的羊抗兔IgG抗体为二抗，进行Ligand Blot分析。
2 结果与分析
2.1 hcapn3基因的克隆
PCR扩增获得922 bp的目的hcapn3基因片段。5′RACE和3′RACE反应分别获得约1.4 kb和1.7 kb的片段（图1），RACE反应产物测序后序列拼接，获得hcapn3的全长序列。设计特异引物进行PCR扩增得到2.9 kb的全长基因片段（图2）。经Blastp分析可知，获得的全长基因编码美国白蛾氨肽酶N3，命名为hcapn3，推导的氨基酸序列与舞毒蛾APN3（GenBank登录号：AAL26894.1）相似性最高，达65.13%。
2.2 hcapn3序列分析
hcapn3基因GenBank登录号为KJ013598，开放阅读框为2 859 bp，编码952个氨基酸残基，预测分子量大小为108.2 kDa，等电点为4.84。推导的氨基酸序列N端具有15个氨基酸的信号肽序列，C末端930，931位氨基酸残基为预测的GPI锚定位点，含有Gluzincin 和ERAP1_C保守结构域，谷氨酸锌化氨肽酶的保守氨基酸序列GAMEN。糖基化位点预测结果显示HcAPN3含有2个O糖基化位点，分别位于414和566位，6个N糖基化位点分别位于133、373、419、641、654、930位。预测的跨膜片段位于227～245位氨基酸残基。 2.3 hcapn3在昆虫细胞系中的表达
重组病毒作为分泌蛋白存在于培养基中，转染High Five细胞后48 h收集培养基，离心取上清，作为P1原代病毒，继续感染对数生长期的High Five细胞，出现感染迹象后，离心收集上清，即为扩增后的P2病毒，继续扩增获取P3病毒，离心取上清进行SDSPAGE及Western Blot分析，结果显示HcAPN3在昆虫细胞系中成功表达108 kDa的蛋白（图3）。
2.4 HcAPN3结构域在大肠杆菌中的表达
HcAPN3结构域表达分析结果表明，37 ℃，以1 mmol/L IPTG进行诱导，Gluzincin 和ERAP1_C 两个结构域重组蛋白得到成功表达，分别表达约58 kDa和 49 kDa的目的蛋白（图4a～b）。
2.5 重组蛋白与Cry1Ac蛋白的配体印迹（Ligand Blot）分析
配体印迹分析结果显示，HcAPN3重组蛋白和Gluzincin结构域能分别与Cry1Ac蛋白结合产生108 kDa和58 kDa条带（图5），表明 HcAPN3重组蛋白和Gluzincin结构域可与Cry1Ac结合，而ERAP1_C结构域重组蛋白未能与Cry1Ac发生结合（图5）。
3 讨论
APN目前已被确认为是Bt毒素的受体[1517]，其作为受体的功能已被广泛研究。然而APN同工酶家族种类较多，其结构特点也不尽相同[17]，尤其在不同的物种中差异较大，不同的 Bt Cry蛋白通过与不同种类的APN互作，从而起到杀虫作用[21]。目前研究认为各类APN在昆虫体内同时表达，并且分子量、酶活性、糖基化特征等相似度高，使其难以分离和纯化[22]，因而分离鉴定APN同工酶的种类对于研究Bt Cry蛋白的杀虫机理以及为APN的分类提供依据等都有着重要的意义。本研究通过PCR及RACEPCR技术首次成功分离鉴定了美国白蛾APN3全长基因序列，并在昆虫细胞系中成功表达HcAPN3全长蛋白。序列分析表明HcAPN3具有的典型氨肽酶结构特征，即属于锌金属肽酶，N末端具有信号肽，C末端含有糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定信号序列，锌结合位点HEXXH，谷氨酸锌化氨肽酶的保守结构GAMEN，含有Gluzincin和ERAP1_C保守结构域。
闫志利等研制的唐海1号Bt制剂2万IU/mg 500～1 500倍液对美国白蛾防效接近100%[5]。徐明等利用Bt悬浮剂与灭幼脲的混剂对美国白蛾进行防治，结果显示混剂对第2～3代幼虫的毒力指数均高于100，防治效果良好[3]。陈颖等利用Bt15A3对美国白蛾的防治试验表明Bt15A3水悬剂防治2～3龄、4～5龄幼虫，200倍液用药后3 d校正防效分别达到100%、98.00%[23]。陈月华等从Bt15A3中鉴定出Cry1Ac基因型[24]，于涛等[2]和赵焕丽等[6]在筛选对美国白蛾高毒力的Bt菌株中均鉴定出Cry1Ac基因型，本试验前期研究证明Cry1Ac蛋白是对美国白蛾高毒力的杀虫晶体蛋白。Wang等发现通过原核表达的棉铃虫APN3蛋白可与Cry1Ac发生结合[25]。本研究通过Ligand Blot分析发现昆虫细胞系表达的HcAPN3重组蛋白可以与Cry1Ac发生特异性结合，推测其可能为Cry1Ac蛋白的结合蛋白。为了进一步验证Cry1Ac蛋白与APN蛋白结合区域，在大肠杆菌中分别克隆和表达了hcapn3保守的Gluzincin 和ERAP1_C结构域。由于昆虫细胞系表达蛋白周期较长，所以我们利用周期较短的原核表达系统对结构域蛋白进行表达。结果显示Gluzincin结构域可与Cry1Ac特异结合，而ERAP1_C结构域则不能与Cry1Ac发生结合，推测Cry1Ac 与 HcAPN3的结合区域位于Gluzincin保守结构域，但HcAPN3是否为Cry1Ac蛋白的受体蛋白以及与Cry1Ac的具体结合位点还需进一步研究。本研究通过分离鉴定新的hcapn3基因，为研究美国白蛾氨肽酶基因的功能，阐明Bt Cry蛋白与受体蛋白的作用机理奠定理论基础。
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