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摘要：研究化学抑制剂仲丁灵的抑芽机制，为西瓜省力化栽培提供科学依据。采用稀释70倍的37.3%仲丁灵乳油对西瓜腋芽进行涂抹，研究仲丁灵对西瓜腋芽细胞膜通透性、各种防御酶活性的影响。通过使用化学抑芽剂仲丁灵，西瓜腋芽的细胞膜通透性发生了改变，施药后7 d过氧化物酶（POD）活性（鲜质量）达到最大值，为 5 441.09 U/（g·min），SOD活性（鲜质量）在施药后14 d也达到峰值，为140.49 U/g，PPO、PAL活性（鲜质量）分别在施药后21、14 d达到最大值，分别为596.60 U/（g·min）、86.83 U/（g·h）。4种防御酶活性高峰出现在处理的不同时间，使西瓜腋芽生长得到了一定的抑制。由结果可知，防御酶的活性和细胞膜通透性可作为研究仲丁灵抑制西瓜腋芽生长机制的指标。
关键词：仲丁灵；西瓜腋芽；膜透性；防御酶活性
中图分类号：S482.8 92 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）05-0108-03
在西瓜生产过程中，须要人工摘除腋芽，费时费工。仲丁灵属低毒农药，目前国内较多用于抑制烟草腋芽和芽前土壤除草[1]，由于施药期与作物收获期相隔时间较长，且按推荐剂量施药后60 d在土壤中消解率达90%以上[2]，因此收获时作物或土壤中的仲丁灵残留含量相对较低，且对作物安全。目前，关于仲丁灵对西瓜腋芽生长的抑制机制尚未见报道。本试验采用化学抑芽剂仲丁灵对西瓜腋芽进行处理，对不同时期腋芽的细胞膜通透性和各种防御酶活性進行动态分析，以期为化学抑芽剂仲丁灵抑芽机制的研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
供试西瓜品种选用安徽省农业科学院园艺研究所自主育成的优质西瓜品种秀丽，供试药剂为37.3%仲丁灵乳油，试验于2016年6—7月在安徽省农业科学院园艺研究所蔬菜育种试验地进行。
1.2试验设计
以秀丽西瓜为试验材料，通过浸种、催芽后，采用72孔穴盘基质育苗，于3叶1心时定植。待定植后主蔓开始出现腋芽时，于晴天16：00以后采用笔涂法对西瓜腋芽涂抹37.3%仲丁灵乳油70倍液，每株用药液量10～15 mL，以无菌水为对照。每个处理4次重复，共8个小区，每个小区定植30株，小区面积15 m2，随机区组排列。[LM]
1.3测定项目
1.3.1质膜相对透性施药后1、7、14、21 d分别测定西瓜腋芽细胞膜的通透性。质膜相对透性用相对电导率表示，电导率参照Campos等的方法[3]测定。
1.3.2生理生化指标测定施药后1、7、14、21 d分别测定西瓜腋芽防御酶的鲜质量活性。其中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）光化学还原法[4]，多酚氧化酶（PPO）活性按照Mozzetti等的方法[5]测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[6]测定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性按照孙群等的方法[6]测定。
1.4数据统计分析
采用DPS软件进行方差分析；采用Duncans新复极差法进行差异显著性检验。
2结果与分析
2.1不同时期仲丁灵对西瓜腋芽细胞膜通透性的影响[HT]
可见，随着处理时间的增加，仲丁灵处理后西瓜腋芽的相对电导率呈现逐渐下降的趋势，而对照组的相对电导率变化不明显。其中，施药后1 d西瓜腋芽的相对电导率最大，為49.32%，说明西瓜腋芽经仲丁灵处理后细胞膜出现损伤，导致细胞内电解质外渗[7]，从而引起电导率的改变，根据电导率的大小可以确定膜透性大小及膜受害程度。
2.2仲丁灵对西瓜腋芽POD活性（鲜质量）的影响
可知，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组西瓜腋芽防御酶POD活性呈现先增大后减小的趋势，其中在施药后7 d POD活性达到最大值，为5 441.09 U/（g·min），且处理组的POD活性均明显高于对照组；仲丁灵处理组的POD活性在施药后1、7 d与14、21 d之间存在显著差异（P<0.05），而对照的POD活性从施药后1至14 d变化相对平稳，与21 d之间存在显著差异（P<0.05）；仲丁灵处理组的POD活性与对照相比存在极显著差异（P<0.01）。
2.3仲丁灵对西瓜腋芽SOD活性（鲜质量）的影响
由图3可知，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组与对照组的SOD活性均呈现一致的变化，即先增大后减小，但对照组的活性均高于仲丁灵处理组，其中对照组的活性在14 d时达到峰值，为155.13 U/g，仲丁灵处理组的SOD活性在施药后14 d也达到峰值，为140.49 U/g，二者相比无显著差异；对照组的SOD活性在施药后1、7 d与仲丁灵处理组的1、7、21 d之间无显著差异，而仲丁灵处理组的SOD活性在施药后21 d
与对照组之间有显著差异（P<0.05）。
2.4仲丁灵对西瓜腋芽PPO活性（鲜质量）的影响
由图4所示，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组与对照组的PPO活性均呈现一致的变化，即一直处于增加的趋势，且处理组的活性均高于对照组，其中处理组的PPO活性在施药后 21 d 达到最大值，为596.60 U/（g·min），比对照组高45.96%；仲丁灵处理组的PPO活性在施药后1 d与7、14、21 d 之间有显著差异（P<0.05），对照组的PPO活性在1、7 d 与14 d之间存在显著差异（P<0.05），而与21 d相比有极显著差异（P<0.01）。
2.5仲丁灵对西瓜腋芽PAL活性（鲜质量）的影响
由图5所示，仲丁灵处理组和对照组的PAL活性均表现为先增大后减小的趋势，其中仲丁灵处理组的PAL活性在施药后21 d达到最大值，为86.83 U/（g·h），对照组的PAL活性从施药后7至14 d迅速下降，下降率为87.04%；仲丁灵处理组的PAL活性在施药后1、7、21 d与14 d之间有显著差异（P<0.05），对照组的PAL活性在1、7 d与14、21 d之间有极显著差异（P<0.01）。 3结论与讨论
研究表明，细胞膜透性变化是环境胁迫的重要表现，透性变化比其他生理反应出现得早，透性改变导致细胞微环境变化，酶活失衡，代谢失调[8]。相对电导率的变化可以反映质膜的伤害程度[9]。本研究发现，经37.3%仲丁灵70倍液处理的西瓜腋芽在施药1 d后，相对电导率达到最大值，此后相对电导率逐渐下降，说明外源仲丁灵引起细胞膜透性变化可能是逆境下植物的原初反应，由于它的出现才陆续产生其他生理过程的一系列连锁反应。
研究发现，在植物受到胁迫后产生的活性氧能促进寄主植物膜脂过氧化或膜脱脂作用，从而破坏膜的结构[10]。而过氧化物酶和超氧化物歧化酶是细胞内清除活性氧伤害的保护酶系统[11]，其活性可以间接反映植物体内的活性氧代谢变化。本研究发现，外源仲丁灵可以诱导西瓜腋芽防御途径的关键酶（POD、SOD、PPO和PAL）的活性发生不同程度的变化，说明西瓜腋芽的防御系统在外源仲丁灵的诱导下发挥了防御作用，但酶活性的变化与处理时间有密切关系。
从施药后1～21 d开始，处理的相对电导率呈现逐渐下降的趋势，而SOD活性呈现先上升后下降的趋势，说明施药后1 d细胞内活性氧的浓度达到最大值，细胞膜受到损伤的程度也最大，随着处理时间的增加，SOD清除活性氧的能力逐渐增强，细胞膜的损伤程度逐渐减小，相对电导率也逐渐降低。对POD而言，它不仅参与了木质素的沉积过程，而且在清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]、·OH方面具有重要防御作用。本试验表明，经外源仲丁灵处理后快速诱导POD活性升高，施药后1～14 d 与对照相比有极显著差异（P<0.01）。说明仲丁灵首先刺激膜脂氧化作用，产生大量的 O-2[KG-*2]· [KG-*3]，此时SOD系统还未作出應急反应，积累的活性氧已超出了防御酶的清除能力，因而攻击细胞组成的有机大分子，导致酶损伤，因此表现出SOD活性比对照低。
PPO是细胞抗性酶之一，其作用机制是将细胞代谢产物中的酚类物质氧化为醌类而导致细胞死亡，从而限制外源因子进一步扩展到细胞。本研究发现，仲丁灵处理后西瓜腋芽PPO活性呈现上升的趋势，腋芽由黄色逐渐变为褐色，最终表现为抑制腋芽的生长，而对照组的PPO活性始终低于处理组，可能是腋芽在正常的生长过程中的酚类物质积累较处理组的少，未受到生长抑制，表现为正常长势。
PAL催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，因此它是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。当用仲丁灵处理西瓜腋芽后，细胞受到刺激后启动PAL系统，产生木质素并沉积在细胞壁周围，随着处理时间的增加，PAL活性逐渐增强，到施药后14 d开始回落，可能是此时西瓜腋芽已经被抑制生长。研究发现，PAL的最适反应温度为 40 ℃[12]，而对照的PAL活性从7 d后开始下降，可能与2016年7月份气温较高有关。
综上所述，当植物受到胁迫时，植物的抗氧化系统通过增加抗氧化酶活性起到关键的保护作用。在抗氧化酶中，SOD构成了清除活性氧的第1道防线，而且它是超氧化物的主要清除剂。本研究发现，通过使用化学抑芽剂仲丁灵，西瓜腋芽的细胞膜通透性发生了改变，4种防御酶活性高峰出现在处理的不同时间，说明4种酶相互协调及补充，以维持细胞内部相对的稳定和平衡，同时对西瓜腋芽有一定的抑制作用。防御酶的活性和细胞膜通透性的变化可为仲丁灵抑制西瓜腋芽生长机制的研究提供依据。
[HS2*3][HT8.5H]参考文献：
[1]姚远. 地乐胺在作物中的残留测定及在土壤中的消解动态[J]. 辽宁农业科学，1992（5）：42-44.
[2]张勇，路兴涛，吕爱芹，等. 仲丁灵对辣椒的安全性及除草生物活性[J]. 杂草科学，2015，33（2）：43-47.
[3]Campos P S，Thi A T P. Effect of abscisic pretreatment on membrane leakage and lipid composition of Vigna unguiculata leaf discs subjected to osmotic stress[J]. Plant Science，1997，130（1）：11-18.
[4]Misra H P，Fridovich I. The role of superoxide anion in autooxidation of the epinephrine and a sample assay for superoxide dismutase[J]. Journal of Biological Chemistry，1972，247（10）：3170-3175.
[5]Mozzetti C，Ferraris L，Tamietti G，et al. Variation in enzyme activities in leaves and suspensions as markers of incompatibility in different phytophthora pepper interactions[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，1995，46（2）：95-107.
[6]孫群，胡景江. 植物生理学研究技术[M]. 杨凌：西北农林科技大学出版社，2006.
[7]Burgess P，Huang B R. Effects of sequential application of plant growth regulators and osmoregulants on drought tolerance of creeping bentgrass （Agrostis stolonifera）[J]. Crop Science，2014，54（2）：837-844.
[8]王洪春. 专题讲座——第二十六讲植物抗性生理[J]. 植物生理学通讯，1981（6）：72-81.
[9]陈建白. 电导法在植物抗寒研究中的应用[J]. 热带农业科技，1999，22（1）：26-28.[ZK）]
[10]黄国存，刘鸿先，徐同，等. 干旱对小麦SOD活性和CaM水平的影响[J]. 华北农学报，1995，10（1）：40-44.
[11]Bronson C R，Scheffer R P. Heat and aging-induced tolerance of sorghum and oat tissues to host-seleclive toxins[J]. Phytopathology，1997，77（10）：1232-1238
[12]江柯，卢涛，赵德立，等. 红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究[J]. 四川大学学报（自然科学版），2004，41（4）：865-868.
关键词：仲丁灵；西瓜腋芽；膜透性；防御酶活性
中图分类号：S482.8 92 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2017）05-0108-03
在西瓜生产过程中，须要人工摘除腋芽，费时费工。仲丁灵属低毒农药，目前国内较多用于抑制烟草腋芽和芽前土壤除草[1]，由于施药期与作物收获期相隔时间较长，且按推荐剂量施药后60 d在土壤中消解率达90%以上[2]，因此收获时作物或土壤中的仲丁灵残留含量相对较低，且对作物安全。目前，关于仲丁灵对西瓜腋芽生长的抑制机制尚未见报道。本试验采用化学抑芽剂仲丁灵对西瓜腋芽进行处理，对不同时期腋芽的细胞膜通透性和各种防御酶活性進行动态分析，以期为化学抑芽剂仲丁灵抑芽机制的研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
供试西瓜品种选用安徽省农业科学院园艺研究所自主育成的优质西瓜品种秀丽，供试药剂为37.3%仲丁灵乳油，试验于2016年6—7月在安徽省农业科学院园艺研究所蔬菜育种试验地进行。
1.2试验设计
以秀丽西瓜为试验材料，通过浸种、催芽后，采用72孔穴盘基质育苗，于3叶1心时定植。待定植后主蔓开始出现腋芽时，于晴天16：00以后采用笔涂法对西瓜腋芽涂抹37.3%仲丁灵乳油70倍液，每株用药液量10～15 mL，以无菌水为对照。每个处理4次重复，共8个小区，每个小区定植30株，小区面积15 m2，随机区组排列。[LM]
1.3测定项目
1.3.1质膜相对透性施药后1、7、14、21 d分别测定西瓜腋芽细胞膜的通透性。质膜相对透性用相对电导率表示，电导率参照Campos等的方法[3]测定。
1.3.2生理生化指标测定施药后1、7、14、21 d分别测定西瓜腋芽防御酶的鲜质量活性。其中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定采用氮蓝四唑（NBT）光化学还原法[4]，多酚氧化酶（PPO）活性按照Mozzetti等的方法[5]测定，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法[6]测定，苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性按照孙群等的方法[6]测定。
1.4数据统计分析
采用DPS软件进行方差分析；采用Duncans新复极差法进行差异显著性检验。
2结果与分析
2.1不同时期仲丁灵对西瓜腋芽细胞膜通透性的影响[HT]
可见，随着处理时间的增加，仲丁灵处理后西瓜腋芽的相对电导率呈现逐渐下降的趋势，而对照组的相对电导率变化不明显。其中，施药后1 d西瓜腋芽的相对电导率最大，為49.32%，说明西瓜腋芽经仲丁灵处理后细胞膜出现损伤，导致细胞内电解质外渗[7]，从而引起电导率的改变，根据电导率的大小可以确定膜透性大小及膜受害程度。
2.2仲丁灵对西瓜腋芽POD活性（鲜质量）的影响
可知，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组西瓜腋芽防御酶POD活性呈现先增大后减小的趋势，其中在施药后7 d POD活性达到最大值，为5 441.09 U/（g·min），且处理组的POD活性均明显高于对照组；仲丁灵处理组的POD活性在施药后1、7 d与14、21 d之间存在显著差异（P<0.05），而对照的POD活性从施药后1至14 d变化相对平稳，与21 d之间存在显著差异（P<0.05）；仲丁灵处理组的POD活性与对照相比存在极显著差异（P<0.01）。
2.3仲丁灵对西瓜腋芽SOD活性（鲜质量）的影响
由图3可知，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组与对照组的SOD活性均呈现一致的变化，即先增大后减小，但对照组的活性均高于仲丁灵处理组，其中对照组的活性在14 d时达到峰值，为155.13 U/g，仲丁灵处理组的SOD活性在施药后14 d也达到峰值，为140.49 U/g，二者相比无显著差异；对照组的SOD活性在施药后1、7 d与仲丁灵处理组的1、7、21 d之间无显著差异，而仲丁灵处理组的SOD活性在施药后21 d
与对照组之间有显著差异（P<0.05）。
2.4仲丁灵对西瓜腋芽PPO活性（鲜质量）的影响
由图4所示，随着处理时间的增加，仲丁灵处理组与对照组的PPO活性均呈现一致的变化，即一直处于增加的趋势，且处理组的活性均高于对照组，其中处理组的PPO活性在施药后 21 d 达到最大值，为596.60 U/（g·min），比对照组高45.96%；仲丁灵处理组的PPO活性在施药后1 d与7、14、21 d 之间有显著差异（P<0.05），对照组的PPO活性在1、7 d 与14 d之间存在显著差异（P<0.05），而与21 d相比有极显著差异（P<0.01）。
2.5仲丁灵对西瓜腋芽PAL活性（鲜质量）的影响
由图5所示，仲丁灵处理组和对照组的PAL活性均表现为先增大后减小的趋势，其中仲丁灵处理组的PAL活性在施药后21 d达到最大值，为86.83 U/（g·h），对照组的PAL活性从施药后7至14 d迅速下降，下降率为87.04%；仲丁灵处理组的PAL活性在施药后1、7、21 d与14 d之间有显著差异（P<0.05），对照组的PAL活性在1、7 d与14、21 d之间有极显著差异（P<0.01）。 3结论与讨论
研究表明，细胞膜透性变化是环境胁迫的重要表现，透性变化比其他生理反应出现得早，透性改变导致细胞微环境变化，酶活失衡，代谢失调[8]。相对电导率的变化可以反映质膜的伤害程度[9]。本研究发现，经37.3%仲丁灵70倍液处理的西瓜腋芽在施药1 d后，相对电导率达到最大值，此后相对电导率逐渐下降，说明外源仲丁灵引起细胞膜透性变化可能是逆境下植物的原初反应，由于它的出现才陆续产生其他生理过程的一系列连锁反应。
研究发现，在植物受到胁迫后产生的活性氧能促进寄主植物膜脂过氧化或膜脱脂作用，从而破坏膜的结构[10]。而过氧化物酶和超氧化物歧化酶是细胞内清除活性氧伤害的保护酶系统[11]，其活性可以间接反映植物体内的活性氧代谢变化。本研究发现，外源仲丁灵可以诱导西瓜腋芽防御途径的关键酶（POD、SOD、PPO和PAL）的活性发生不同程度的变化，说明西瓜腋芽的防御系统在外源仲丁灵的诱导下发挥了防御作用，但酶活性的变化与处理时间有密切关系。
从施药后1～21 d开始，处理的相对电导率呈现逐渐下降的趋势，而SOD活性呈现先上升后下降的趋势，说明施药后1 d细胞内活性氧的浓度达到最大值，细胞膜受到损伤的程度也最大，随着处理时间的增加，SOD清除活性氧的能力逐渐增强，细胞膜的损伤程度逐渐减小，相对电导率也逐渐降低。对POD而言，它不仅参与了木质素的沉积过程，而且在清除 O-2[KG-*2]· [KG-*3]、·OH方面具有重要防御作用。本试验表明，经外源仲丁灵处理后快速诱导POD活性升高，施药后1～14 d 与对照相比有极显著差异（P<0.01）。说明仲丁灵首先刺激膜脂氧化作用，产生大量的 O-2[KG-*2]· [KG-*3]，此时SOD系统还未作出應急反应，积累的活性氧已超出了防御酶的清除能力，因而攻击细胞组成的有机大分子，导致酶损伤，因此表现出SOD活性比对照低。
PPO是细胞抗性酶之一，其作用机制是将细胞代谢产物中的酚类物质氧化为醌类而导致细胞死亡，从而限制外源因子进一步扩展到细胞。本研究发现，仲丁灵处理后西瓜腋芽PPO活性呈现上升的趋势，腋芽由黄色逐渐变为褐色，最终表现为抑制腋芽的生长，而对照组的PPO活性始终低于处理组，可能是腋芽在正常的生长过程中的酚类物质积累较处理组的少，未受到生长抑制，表现为正常长势。
PAL催化苯丙氨酸脱氨基后产生肉桂酸并最终转化为木质素，因此它是与细胞内木质素生成和沉积有关的防御酶。当用仲丁灵处理西瓜腋芽后，细胞受到刺激后启动PAL系统，产生木质素并沉积在细胞壁周围，随着处理时间的增加，PAL活性逐渐增强，到施药后14 d开始回落，可能是此时西瓜腋芽已经被抑制生长。研究发现，PAL的最适反应温度为 40 ℃[12]，而对照的PAL活性从7 d后开始下降，可能与2016年7月份气温较高有关。
综上所述，当植物受到胁迫时，植物的抗氧化系统通过增加抗氧化酶活性起到关键的保护作用。在抗氧化酶中，SOD构成了清除活性氧的第1道防线，而且它是超氧化物的主要清除剂。本研究发现，通过使用化学抑芽剂仲丁灵，西瓜腋芽的细胞膜通透性发生了改变，4种防御酶活性高峰出现在处理的不同时间，说明4种酶相互协调及补充，以维持细胞内部相对的稳定和平衡，同时对西瓜腋芽有一定的抑制作用。防御酶的活性和细胞膜通透性的变化可为仲丁灵抑制西瓜腋芽生长机制的研究提供依据。
[HS2*3][HT8.5H]参考文献：
[1]姚远. 地乐胺在作物中的残留测定及在土壤中的消解动态[J]. 辽宁农业科学，1992（5）：42-44.
[2]张勇，路兴涛，吕爱芹，等. 仲丁灵对辣椒的安全性及除草生物活性[J]. 杂草科学，2015，33（2）：43-47.
[3]Campos P S，Thi A T P. Effect of abscisic pretreatment on membrane leakage and lipid composition of Vigna unguiculata leaf discs subjected to osmotic stress[J]. Plant Science，1997，130（1）：11-18.
[4]Misra H P，Fridovich I. The role of superoxide anion in autooxidation of the epinephrine and a sample assay for superoxide dismutase[J]. Journal of Biological Chemistry，1972，247（10）：3170-3175.
[5]Mozzetti C，Ferraris L，Tamietti G，et al. Variation in enzyme activities in leaves and suspensions as markers of incompatibility in different phytophthora pepper interactions[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，1995，46（2）：95-107.
[6]孫群，胡景江. 植物生理学研究技术[M]. 杨凌：西北农林科技大学出版社，2006.
[7]Burgess P，Huang B R. Effects of sequential application of plant growth regulators and osmoregulants on drought tolerance of creeping bentgrass （Agrostis stolonifera）[J]. Crop Science，2014，54（2）：837-844.
[8]王洪春. 专题讲座——第二十六讲植物抗性生理[J]. 植物生理学通讯，1981（6）：72-81.
[9]陈建白. 电导法在植物抗寒研究中的应用[J]. 热带农业科技，1999，22（1）：26-28.[ZK）]
[10]黄国存，刘鸿先，徐同，等. 干旱对小麦SOD活性和CaM水平的影响[J]. 华北农学报，1995，10（1）：40-44.
[11]Bronson C R，Scheffer R P. Heat and aging-induced tolerance of sorghum and oat tissues to host-seleclive toxins[J]. Phytopathology，1997，77（10）：1232-1238
[12]江柯，卢涛，赵德立，等. 红酵母苯丙氨酸解氨酶的分离纯化及性质研究[J]. 四川大学学报（自然科学版），2004，41（4）：865-868.