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摘要：通过生物信息学的方法对绿僵菌HC毒素合成酶基因进行了分析。生物信息学分析表明，它在一级结构、二级结构、三级结构上接近于植物病原真菌，但是其一级结构上并不保守。
关键词：NCBI；蛋白；核酸；生物信息学
中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0071-03
收稿日期：2014-08-30
基金项目：国家自然科学基金（编号：31171897）；河南省教育厅自然科学研究计划（编号：2010B180031）；周口师范学院科研成果孵化专项（编号：2011-zknufh）。
作者简介：张杰（1975—），男，河南太康人，博士研究生，讲师，研究方向为分子生物学与生物工程。E-mail：[email protected]。
通信作者：胡炳义，教授，研究方向为生物技术。E-mail：[email protected]绿僵菌是农业害虫防治的主要病原真菌之一，其致病性主要依赖毒素麻痹宿主的防御。绿僵菌HC毒素是三轮状结构的环状四肽（D-Pro-L-Ala-D-Ala-L-Aeo），Aeo表示2氨基9，10氟环唑8 3-羰基癸酸乙酯[1]。在玉米黑粉病中，HC毒素是黑粉病菌侵染玉米过程中的特异性和毒力的决定性因素[2]。HC毒素是微生物为数不多的第二代谢产物之一。在植物、昆虫和哺乳动物中HC毒素是组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）的抑制因子[3]，然而，昆虫病原真菌侵染宿主时抑制宿主HDACs 致病和生物合成的机制尚不清楚[4-6]。利用生物信息学技术分析HC毒素合成酶的进化 、二级结构、三级结构、跨膜结构域及物理化学性质，可以为生物学功能的进一步研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中的绿僵菌数据库为材料。
1.2方法
1.2.1序列的查找通过NCBI数据库搜索HC毒素合成酶的蛋白序列，再通过绿僵菌数据库NCBI/BLAST/tblastn搜索绿僵菌的核酸序列，进而获得HC毒素合成酶基因的全长序列。
1.2.2序列的生物信息学分析用DNAman软件对HC毒素合成酶蛋白序列运行clustalW、亲水性、疏水性和跨膜结构分析；应用MEGA 5.0构建系统发育树；用The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench和COILS在线分析二级结构，SMART在线分析二级结构及结构域；用swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）数据库在线建模和三级结构分析[7-10]；用SignalP 4.1 Server预测蛋白序列的信号剪切位点；蛋白质结构域的预测用在线SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）；利用KEGG数据库分析其所在的信号通路；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）数据库在线预测其物理和化学性质。
2结果与分析
2.1HC毒素合成酶一级结构和信号肽预测
基于一级结构上的同源性对蛋白序列运行clustalW和系统发育树的构建。由图1-A可知绿僵菌HC毒素合成酶总共有290个氨基酸，在一级结构上保守型极低，在不同的病原菌中只有一个共同的甘氨酸位点 （黑色、蓝色和红色区域分别表示相同性高于90%、75%和50%）。由图1-B可知绿僵菌的HC毒素合成酶与半知菌类的虫生真菌白僵菌具有较高同源性（88%），其次是动物病原菌（53%）。用SignalP 4.1 Server对其一级结构上的信号肽进行预测。由图1-C表明该蛋白序列在第19个氨基酸位置具有信号肽位点，其预测分值为0.8，信号肽序列为MLLSSAAVVLGALQPALG，与swissmodel和SMART在线预测结果相一致，可能是分泌性蛋白。
2.2HC毒素合成酶二、三级结构预测
在一级结构的基础上用COILS在线分析了HC毒素合成酶的二级结构。从图2可以看出，HC毒素合成酶有3个α-螺旋结构，在蛋白中的含量为3.45%；13个β-折叠，其含量为16.55%；无规则卷曲最多，其含量为80%。而在线SMART预测到其内部有2个重复序列及前端的信号肽序列，没有预测到特征性结构域。
2.3HC毒素合成酶亲水性、疏水性、跨膜结构和分子结构的预测
从图3-A可知，HC毒素合成酶最高亲水性分值为194，而最低分值为-1.91，总体亲水性为-0.471；从图3-B可知，HC毒素合成酶疏水性不显著，其疏水性最高分值为303，最低值为-3.28，推测其可能是水溶性蛋白；从图3-C可知，HC毒素合成酶没有跨膜结构。图3-D是预测到的HC毒素合成酶的分子结构，分子式为C1357H2136N390O417S24，分子量为31 355.6。
2.4HC毒素合成酶三维建模
从图4-A和4-B可知，在SWISS-MODEL数据库中搜
索到了HC毒素合成酶的模板，它与靶蛋白的相似性评估得分为37.93%（图4-C），正常的QMEAN4分值为-3.52，靶蛋白与模型氨基酸的对应序列如图4-E所示。建模结果表明该蛋白的三维结构与上述预测结果相一致。
2.5HC毒素合成酶抗原性片段、物理和化学性质分析
用DNAman软件预测到该氨基酸含有17个抗原肽段，其分值和长度（红色字母表示最大分值位点）分别如下：
[1]分值=1.181，长度=21，4-SSAAVVLGALQPALGKPSLLR-24；[2]分值=1.179，长度=16，272-RPALCLIAGEPTCAPV-287；[3]分值=1.172，长度=12，204-DGLFCRHPCGGA-215；[4]分值=1.162，长度=22，246-ERCYKADDCDHGLFCEHQCGGA-267；[5]分值=1.162，长度=13，150-GDGLFCEHQCGGP-162；[6]分值=1.150，长度=7，108-AAFVCED-114；[7]分值=1.147，长度=26，40-AATEIVIDYLAPNPPCGPYSPWVGIW-65；[8]分值=1125，长度=13，119-AWIVSQPFKVDKE-131；[9]分值=1.123，长度=8，195-RCSQVNEC-202；[10]分值=1.123，长度=7，220-SNVCLIG-226；[11]分值=1.110，长度=10，228-EPTCAPVRQE-237；[12]分值=1.106，长度=7，32-NEVVNQR-38；[13]分值=1.090，长度=7，141-ERCYEAD-147；[14]分值=1.089，长度=15，168-SAMCFIAGEPKCRPI-182；[15]分值=1.080，长度=7，79-AWAYVKP-85；[16]分值=1.074，长度=7，67-ADACNSF-73；[17]分值=1.072，长度=14，93-NVKLNLSDLDVGEY-106。 其物理化学性质用ProtParam在线预测，结果表明该蛋白的等电点为5.70，总共有4 324个原子组成，假定所有的半胱氨酸形成二硫键，它们在水中280 nm的消光系数为 33 680 L/（mol·cm）；假定所有的半胱氨酸是还原态，它们在水中 280 nm 的消光系数为32 430 L/（mol·cm）。其氮端起始氨基酸为Met，预测到该蛋白在哺乳动物网状细胞中，离体状态下的半衰期为30 h；在酵母活体中的半衰期为大于20 h；在细菌活体中的半衰期大于10 h。其不稳定性指数为4172，属于不稳定性蛋白。其脂肪族指数为66.69。
3讨论
利用生物信息学的方法对研究的基因进行正确预测是现代分子生物学研究的有效手段之一[11-12]。随着生物信息学算法和蛋白质结构预测研究的深入，生物信息学在生物科学领域的研究非常重要[13]。HC毒素合成酶的同源序列比对及系统进化树的分析结果与Gao等的研究结论[14]一致，说明生物信息学预测是正确的。同软件与在线对信号肽段预测结果相一致，与Nadine等的报道结果[15]一致。HC毒素合成酶的二级结构和三级结构的预测与Jones 等报道的玉米圆斑病菌相似[16]。HC毒素合成酶的物理化学性质及抗原片段尚未有报道。总体来说，绿僵菌HC毒素合成酶结构及功能接近禾本科病原菌，它与植物病原菌的异同尚需试验证明，其物理化学性质也需进一步的验证。表明生物信息学是现代生物学中重要的技术手段，与其他生物学技术相结合是生物学研究的必要途径。
参考文献：
[1]Walton J D. HC-toxin[J]. Phytochemistry，2006，67（14）：1406-1413.
[2]Liesch J M，Sweeley C C，Staffeld G D，et al. Structure of hc-toxin， a cyclic tetrapeptide from helminthosporium-carbonum[J]. Tetrahedron，1982，38（1）：45-48.
[3]Horbach R，Navarro-Quesada A R，Knogge W，et al. When and how to kill a plant cell： infection strategies of plant pathogenic fungi[J]. Journal of Plant Physiology，2011，168（1）：51-62.
[4]Yamane H，Konno K，Sabelis M，et al. Chemical defence and toxins of plants[J]. Chemical Ecology，2010，4：339-385.
[5]Stachelhaus T，Hüser A，Marahiel M A. Biochemical characterization of peptidyl carrier protein （PCP）， the thiolation domain of multifunctional peptide synthetases[J]. Chemistry
关键词：NCBI；蛋白；核酸；生物信息学
中图分类号： Q78文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0071-03
收稿日期：2014-08-30
基金项目：国家自然科学基金（编号：31171897）；河南省教育厅自然科学研究计划（编号：2010B180031）；周口师范学院科研成果孵化专项（编号：2011-zknufh）。
作者简介：张杰（1975—），男，河南太康人，博士研究生，讲师，研究方向为分子生物学与生物工程。E-mail：[email protected]。
通信作者：胡炳义，教授，研究方向为生物技术。E-mail：[email protected]绿僵菌是农业害虫防治的主要病原真菌之一，其致病性主要依赖毒素麻痹宿主的防御。绿僵菌HC毒素是三轮状结构的环状四肽（D-Pro-L-Ala-D-Ala-L-Aeo），Aeo表示2氨基9，10氟环唑8 3-羰基癸酸乙酯[1]。在玉米黑粉病中，HC毒素是黑粉病菌侵染玉米过程中的特异性和毒力的决定性因素[2]。HC毒素是微生物为数不多的第二代谢产物之一。在植物、昆虫和哺乳动物中HC毒素是组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）的抑制因子[3]，然而，昆虫病原真菌侵染宿主时抑制宿主HDACs 致病和生物合成的机制尚不清楚[4-6]。利用生物信息学技术分析HC毒素合成酶的进化 、二级结构、三级结构、跨膜结构域及物理化学性质，可以为生物学功能的进一步研究提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料
以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）数据库中的绿僵菌数据库为材料。
1.2方法
1.2.1序列的查找通过NCBI数据库搜索HC毒素合成酶的蛋白序列，再通过绿僵菌数据库NCBI/BLAST/tblastn搜索绿僵菌的核酸序列，进而获得HC毒素合成酶基因的全长序列。
1.2.2序列的生物信息学分析用DNAman软件对HC毒素合成酶蛋白序列运行clustalW、亲水性、疏水性和跨膜结构分析；应用MEGA 5.0构建系统发育树；用The PSIPRED Protein Sequence Analysis Workbench和COILS在线分析二级结构，SMART在线分析二级结构及结构域；用swissmodel（http：//swissmodel.expasy.org/）数据库在线建模和三级结构分析[7-10]；用SignalP 4.1 Server预测蛋白序列的信号剪切位点；蛋白质结构域的预测用在线SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）；利用KEGG数据库分析其所在的信号通路；利用ProtParam（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam）数据库在线预测其物理和化学性质。
2结果与分析
2.1HC毒素合成酶一级结构和信号肽预测
基于一级结构上的同源性对蛋白序列运行clustalW和系统发育树的构建。由图1-A可知绿僵菌HC毒素合成酶总共有290个氨基酸，在一级结构上保守型极低，在不同的病原菌中只有一个共同的甘氨酸位点 （黑色、蓝色和红色区域分别表示相同性高于90%、75%和50%）。由图1-B可知绿僵菌的HC毒素合成酶与半知菌类的虫生真菌白僵菌具有较高同源性（88%），其次是动物病原菌（53%）。用SignalP 4.1 Server对其一级结构上的信号肽进行预测。由图1-C表明该蛋白序列在第19个氨基酸位置具有信号肽位点，其预测分值为0.8，信号肽序列为MLLSSAAVVLGALQPALG，与swissmodel和SMART在线预测结果相一致，可能是分泌性蛋白。
2.2HC毒素合成酶二、三级结构预测
在一级结构的基础上用COILS在线分析了HC毒素合成酶的二级结构。从图2可以看出，HC毒素合成酶有3个α-螺旋结构，在蛋白中的含量为3.45%；13个β-折叠，其含量为16.55%；无规则卷曲最多，其含量为80%。而在线SMART预测到其内部有2个重复序列及前端的信号肽序列，没有预测到特征性结构域。
2.3HC毒素合成酶亲水性、疏水性、跨膜结构和分子结构的预测
从图3-A可知，HC毒素合成酶最高亲水性分值为194，而最低分值为-1.91，总体亲水性为-0.471；从图3-B可知，HC毒素合成酶疏水性不显著，其疏水性最高分值为303，最低值为-3.28，推测其可能是水溶性蛋白；从图3-C可知，HC毒素合成酶没有跨膜结构。图3-D是预测到的HC毒素合成酶的分子结构，分子式为C1357H2136N390O417S24，分子量为31 355.6。
2.4HC毒素合成酶三维建模
从图4-A和4-B可知，在SWISS-MODEL数据库中搜
索到了HC毒素合成酶的模板，它与靶蛋白的相似性评估得分为37.93%（图4-C），正常的QMEAN4分值为-3.52，靶蛋白与模型氨基酸的对应序列如图4-E所示。建模结果表明该蛋白的三维结构与上述预测结果相一致。
2.5HC毒素合成酶抗原性片段、物理和化学性质分析
用DNAman软件预测到该氨基酸含有17个抗原肽段，其分值和长度（红色字母表示最大分值位点）分别如下：
[1]分值=1.181，长度=21，4-SSAAVVLGALQPALGKPSLLR-24；[2]分值=1.179，长度=16，272-RPALCLIAGEPTCAPV-287；[3]分值=1.172，长度=12，204-DGLFCRHPCGGA-215；[4]分值=1.162，长度=22，246-ERCYKADDCDHGLFCEHQCGGA-267；[5]分值=1.162，长度=13，150-GDGLFCEHQCGGP-162；[6]分值=1.150，长度=7，108-AAFVCED-114；[7]分值=1.147，长度=26，40-AATEIVIDYLAPNPPCGPYSPWVGIW-65；[8]分值=1125，长度=13，119-AWIVSQPFKVDKE-131；[9]分值=1.123，长度=8，195-RCSQVNEC-202；[10]分值=1.123，长度=7，220-SNVCLIG-226；[11]分值=1.110，长度=10，228-EPTCAPVRQE-237；[12]分值=1.106，长度=7，32-NEVVNQR-38；[13]分值=1.090，长度=7，141-ERCYEAD-147；[14]分值=1.089，长度=15，168-SAMCFIAGEPKCRPI-182；[15]分值=1.080，长度=7，79-AWAYVKP-85；[16]分值=1.074，长度=7，67-ADACNSF-73；[17]分值=1.072，长度=14，93-NVKLNLSDLDVGEY-106。 其物理化学性质用ProtParam在线预测，结果表明该蛋白的等电点为5.70，总共有4 324个原子组成，假定所有的半胱氨酸形成二硫键，它们在水中280 nm的消光系数为 33 680 L/（mol·cm）；假定所有的半胱氨酸是还原态，它们在水中 280 nm 的消光系数为32 430 L/（mol·cm）。其氮端起始氨基酸为Met，预测到该蛋白在哺乳动物网状细胞中，离体状态下的半衰期为30 h；在酵母活体中的半衰期为大于20 h；在细菌活体中的半衰期大于10 h。其不稳定性指数为4172，属于不稳定性蛋白。其脂肪族指数为66.69。
3讨论
利用生物信息学的方法对研究的基因进行正确预测是现代分子生物学研究的有效手段之一[11-12]。随着生物信息学算法和蛋白质结构预测研究的深入，生物信息学在生物科学领域的研究非常重要[13]。HC毒素合成酶的同源序列比对及系统进化树的分析结果与Gao等的研究结论[14]一致，说明生物信息学预测是正确的。同软件与在线对信号肽段预测结果相一致，与Nadine等的报道结果[15]一致。HC毒素合成酶的二级结构和三级结构的预测与Jones 等报道的玉米圆斑病菌相似[16]。HC毒素合成酶的物理化学性质及抗原片段尚未有报道。总体来说，绿僵菌HC毒素合成酶结构及功能接近禾本科病原菌，它与植物病原菌的异同尚需试验证明，其物理化学性质也需进一步的验证。表明生物信息学是现代生物学中重要的技术手段，与其他生物学技术相结合是生物学研究的必要途径。
参考文献：
[1]Walton J D. HC-toxin[J]. Phytochemistry，2006，67（14）：1406-1413.
[2]Liesch J M，Sweeley C C，Staffeld G D，et al. Structure of hc-toxin， a cyclic tetrapeptide from helminthosporium-carbonum[J]. Tetrahedron，1982，38（1）：45-48.
[3]Horbach R，Navarro-Quesada A R，Knogge W，et al. When and how to kill a plant cell： infection strategies of plant pathogenic fungi[J]. Journal of Plant Physiology，2011，168（1）：51-62.
[4]Yamane H，Konno K，Sabelis M，et al. Chemical defence and toxins of plants[J]. Chemical Ecology，2010，4：339-385.
[5]Stachelhaus T，Hüser A，Marahiel M A. Biochemical characterization of peptidyl carrier protein （PCP）， the thiolation domain of multifunctional peptide synthetases[J]. Chemistry