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摘要：【目的】鑒定油棕（Elaeis guineensis）脱落酸（ABA）受体PYR/PYL/RCARs（PYL）基因家族成员，分析其表达特性，为探究ABA信号通路在油棕果肉成熟过程中的功能研究提供理论依据。【方法】以拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作为参考序列，通过BLASTp比对及保守结构域预测分析从油棕基因组中鉴定出PYL基因家族成员，利用生物信息学软件对其染色体定位、基因结构、启动子顺式作用元件及编码蛋白的理化性质、保守结构域、进化关系进行分析，并采用实时荧光定量PCR对PYL家族基因在不同组织、不同发育期果实及外源ABA处理下的表达特性进行检测。【结果】从油棕基因组中共鉴定出12个油棕PYL基因家族成员（EgPYL1～EgPYL112），分布在8条染色体和1个Scaffolds上，含有1～3个外显子，开放阅读框（ORF）为564～765 bp，编码187～254个氨基酸，蛋白分子量为20.95～28.33 kD，等电点（pI）为5.26～7.95，不稳定指数为32.67～52.87，脂溶指数为73.87～87.60，总平均亲水性为-0.68～-0.17。12个PYL家族蛋白均含有特征结构域PYR/PYL/RCAR，分为3个亚族。EgPYL1和EgPYL6基因具有共线性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11基因具有共线性。EgPYLs基因的启动子上含有大量植物激素响应元件、逆境胁迫响应元件和光响应元件。EgPYLs基因在根、茎尖、叶、花和果肉中均有表达，但表达量差异较明显。EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表达量随果肉成熟度增加逐渐升高，在23周达峰值。11个EgPYLs基因均受外源ABA诱导表达。【结论】大多数PYL基因家族成员参与油棕对ABA的响应，且部分成员（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果实发育中发挥重要的调控作用。
关键词： 油棕;PYR/PYL/RCARs（PYL）基因家族;脱落酸;生物信息学;基因表达
Abstract：【Objective】In this research，the oil palm（Elaeis guineensis） abscisic acid receptor PYR/PYL/RCARs（PYL） gene family members were identified，and their expression characteristics during fruit development and abscisic acid（ABA） treatment were analyzed，which provided evidence for researching the mechanism of ABA signaling pathway in fruit maturation of oil palm. 【Method】The amino acid sequences of Arabidopsis and rice PYL protein were query sequences， identified PYL gene family members from oil palm genome via BLASTp and conservative domain prediction analysis. The chromosomal location，gene structure，promoter cis-acting elements， protein physicochemical properties，conserved functional domains and evolutionary relationships were analyzed through bioinformatics softwares. The expression characteristics of PYL family gene in different，mesocarp at different stages and ABA treatment were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】 The results showed that 12 PLY （EgPYL1-EgPYL12） gene family members were identified form oil palm genome and were distributed on 8 chromosomes and 1 Scaffolds. The extrons numbers of EgPYL family members were between 1 and 3，the open reading frames（ORF） length were between 564 and 765 pb and encoded amino acid numbers were between 187 and 254. The molecular weights were between 20.95 and 28.33 kD，the isoelectric points were between 5.26 and 7.95，the instability indexes were between 32.67 and 52.87，the aliphatic indexes were between 73.87 and 87.60，the total hydrophilicity was between -0.68 and -0.17. Twelve PYL family protein contained PYR/PYL/RCAR functional domain and were divided into 3 groups based on phylogenetic relationships. Collinearity analysis showed that collinearity existed between EgPYL1 gene and EgPYL6 gene，EgPYL4 gene，EgPYL5 gene，EgPYL9 gene and EgPYL11 gene. A large number of plant hormone responses，stress responses and light responses elements were identified on promoters of EgPYLs gene. Expression analysis of different tissues showed that the EgPYLs gene expressed in roots，shoots，leaves，flowers and fruits， with great difference. During fruit maturation，the expressions of EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes increased gradually and reached the peak at 23 weeks after anthesis. Eleven EgPYLs were induced by exogenous ABA treatment. 【Conclusion】Most PYL gene family members are involved in responding to abscisic acid，among them EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes might play important roles in regulating oil palm mesocarp development. 0 引言
【研究意义】油棕（Elaeis guineensis）是世界上产油效率最高的作物之一，果肉含油率高达50%，每公顷产油量高达4.27 t，是花生的7～8倍、大豆的9～10倍（雷新涛等，2012）。从油棕果实压榨的棕榈油广泛应用于食品加工业、日用化工业、机械润滑和生物柴油等诸多领域（Mahlia et al.，2019）。油棕果实的含油量随果实成熟度的增加而增加，成熟期含油量较未成熟期含油量增加79%～95%（殷振华等，2016）。研究发现，油棕果实中ABA含量从花后16周开始迅速上升，到花后21周达到峰值，在花后22周含量略微降低，ABA合成基因NCED1也呈相同的表达特征，表明ABA在油棕果实发育中起着重要的调控作用（Teh et al.，2014;刘艳菊等，2020）。虽然已证实PYR/PYL/RCARs（缩写为PYL）是ABA信号传导途径中最重要的受体蛋白，主要功能是识别ABA信号和启动信号的传递。但对PYL在油棕ABA信号传导中的作用机制尚不清楚，通过生物信息学方法对油棕PYL基因家族成员进行鉴定，明确其在油棕果实发育及ABA处理下的表达特征，对探究ABA信号通路在油棕成熟过程中的功能及培育高含油量油棕品种具有重要意义。【前人研究进展】ABA是植物响应逆境胁迫、调控气孔关闭和果实成熟等多个生物学过程的重要激素之一，在植物果实发育中发挥重要的调控作用（Leng et al.，2014;李红霞，2019;牟望舒，2019）。在无ABA存在的情况下，蛋白磷酸酶2C（PP2C）通过物理相互作用和磷酸酶活性抑制SNF1相关激酶（SnRK2）的活性，使SnRK2s无法启动下游基因的表达;在ABA存在的情况下，ABA与PYL受体结合导致受体的结构改变，激活PYL与PP2C的相互作用，进而破坏PP2C和SnRK2之间的相互作用，促使SnRK2s启动下游基因的表达（Ma et al.，2009;Melcher et al.，2009）。可见，PYL受体发挥识别传递ABA信号的关键功能（Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。Li等（2018）研究发现，拟南芥的AtRCAR12和AtRCAR13基因参与植株对干旱胁迫的应答，即二者过表达可诱导胁迫响应相关基因的表达，提高植株水分利用效率，增强对干旱胁迫的耐受性。Zhang等（2019）研究发现，AtRCAR12和AtRCAR13基因参与对低温和高温胁迫的应答，即在高温胁迫下二者过表达可诱导热激蛋白HSP18.2和HSP70基因表达，以提高对高温胁迫的耐受性;在低温胁迫下二者通过诱导低温响应转录因子基因CBFs的表达提高对低温胁迫的耐受性。Dittrich等（2019）研究发现，拟南芥的6个PYL家族基因均在保卫细胞中表达，其中，AtPYL2是ABA诱导气孔关闭的受体，而AtPYL4和AtPYL5是CO2调控气孔开合的受体。此外，大量研究发现，PYL参与调控植物果实成熟，如香蕉中PYL-PP2C-SnRK2介导的ABA信号通路正向调控香蕉果实成熟（Hu et al.，2017）;在草莓中FaPYL9基因的表达量随果实成熟迅速升高，抑制FaPYL9基因表达则会延迟果实成熟（颜志明等，2015）;番茄中SlPYL9基因过表达可促进果实成熟，抑制SlPYL9基因则延迟果实成熟（Kai et al.，2019）。【本研究切入点】随着越来越多植物基因组测序完成，在番茄（Sun et al.，2011;González-Guzmán et al.，2014）、拟南芥（Gonzalez-Guzman et al.，2012）、甜橙（Romero et al.，2012）、油棕（Singh et al.，2013）、棉花（Zhang et al.，2017）、油菜（Di et al.，2018）、烟草（Bai et al.，2019）、水稻（Yadav et al.，2020）等物种中鉴定出PYL基因家族成员，但目前未见有关油棕PYL基因家族成员鉴定分析及其在油棕果肉发育中的表达特性的研究报道。【拟解决的关键问题】从油棕基因组中鉴定出PYL基因家族成员，分析其染色体定位、基因结构、启动子顺式作用元件及其编码蛋白的理化性质、保守结构域、进化关系，并采用实时荧光定量PCR检测其在不同组织、果肉果实发育期及外源ABA处理下的表达特征，为探究PYL家族基因在油棕生长发育、ABA响应机制中的调控作用及油棕分子育种提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试品种为薄壳种热油4号油棕，种植于国家热带棕榈种质资源圃（东经110°46′，北纬19°33′）。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒（DP432）购自北京天根生化科技有限公司;HiScript II One Step RT-PCR Kit试剂盒（P611）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;实时荧光定量PCR的SYBR? Select Master Mix（4472908）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;ABA（S18006）购自上海源叶生物科技有限公司。主要仪器：移液器（Eppendorf，德国）、NanoDrop分光光度计（Thermo，美国）、高速冷冻离心机（Thermo，美国）、Labcycler PCR儀（SensoQuest，德国）、水平电泳槽（DYCP-32B，北京六一仪器厂）、电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）、QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统（Thermo，美国）。
1. 2 样品处理及采集
采集5年生薄壳种热油4号油棕的根、茎尖、叶、花（开花期的雄花和雌花）及花后15、17、21和23周的果肉，用于后续PYL家族基因表达组织特性分析。由于前期研究发现100 μmol/L的ABA能有效增强油棕幼苗的抗寒性，故选用100 μmol/L的ABA对幼苗进行外源ABA处理：选取3月龄生长旺盛且无病虫害的幼苗，喷施100 μmol/L的ABA溶液（其中添加0.5%吐温20），分别采集0（对照）、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h的新叶叶片。样品采集后液氮速冻，于-80 ℃冰箱中保存以备RNA提取。 1. 3 油棕PYL基因家族的挖掘与鉴定
从NCBI数据库中下载油棕全基因组数据（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2669）;从TAIR数据库（https：//www.arabidopsis.org/）中下载拟南芥PYL蛋白氨基酸序列;从NCBI数据库中下载水稻PYL蛋白氨基酸序列。以拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作为参考序列，通过BLASTp在油棕基因组数据中进行比对，并将获得的蛋白氨基酸序列提交至NCBI数据库的保守结构域数据库，利用Batch Web CD-search Tool进行保守结构域分析（Lu et al.，2020），最终确定PYL基因家族成员。采用ExPASy在线工具分析油棕PYL家族蛋白的分子量、等电点、蛋白不稳定指数、脂溶指数和总平均亲水性等理化性质。
1. 4 油棕PYL家族基因核苷酸序列分析
采用Tbtool对油棕PYL家族基因的染色体定位、基因结构、共线性分析及保守结构域分析进行可视化（Chen et al.，2020）;采用ClustalW对油棕、拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列进行多重比对（Edgar and Batzoglou，2006）;采用MEGA 6.0的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2018;周丽霞和曹红星，2020），校验值Bootstrap设置为1000。
1. 5 油棕PYL家族基因启动子顺式作用元件分析
从NCBI数据库中下载油棕PYL家族基因编码区上游2000 bp的启动子序列。利用PlantCare在线工具对启动子顺式作用元件进行鉴定（Lescot et al.，2002）。
1. 6 油棕PYL家族基因的表达分析
采用植物总RNA提取试剂盒提取油棕不同组织和外源ABA处理样品的总RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA;采用SYBR? Select Master Mix进行实时荧光定量PCR检测，以β-actin作为内参基因，引物如表1所示。上述具体步骤均参照试剂盒说明进行。
1. 7 数据分析
采用SPSS 13.0进行数据分析，用Duncan检测法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 油棕PYL基因家族成员鉴定及染色体定位结果
通过BLASTp比对分析及保守结构域预测，从油棕基因组中共鉴定出12个油棕PYL基因家族成员（EgPYLs），根据其在染色体上位置进行命名，依次命名为EgPYL1～EgPYL12，12个基因的开放阅读框（ORF）长度为564～765 bp，编码的氨基酸数量为187～257个（表1）。由图1可知，12个PYL基因家族成员分布在8条染色体和1个Scaffolds上。其中，EgPYL1和EgPYL2基因在Chr1上，EgPYL3基因在Chr3上，EgPYL4和EgPYL5基因在Chr5上，EgPYL6基因在Chr6上，EgPYL7和EgPYL8基因在Chr7上，EgPYL9基因在Chr10上，EgPYL10基因在Chr11上，EgPYL11基因在Chr14上，EgPYL12基因未能定位到染色体上，而是定位于1条Scaffolds（即NW_011565705.1）上。
2. 2 油棕PYL家族蛋白的理化性质预测结果
由表2可知，12个EgPYLs蛋白的氨基酸数目为187～254个，平均为216个;分子量为20.95～28.33 kD，平均为23.58 kD;等电点（pI）为5.26～7.95，平均为6.81;蛋白不稳定指数为32.67～52.87，平均为43.92，其中，有6个是稳定蛋白（不稳定指数<40.00），有6个是不稳定蛋白（不稳定指数>40.00）;脂溶系数为73.87～87.60，平均为81.53;总平均亲水性为-0.68～ -0.17，平均為-0.36，均为负值，表明12个EgPYLs蛋白均表现为亲水性。
2. 3 油棕PYL家族基因结构及其编码蛋白保守结构域和进化关系分析
12个EgPYLs基因的外显子和内含子差异较大，其中EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8基因有3个外显子，2个内含子，而其余基因均含有1个外显子，无内含子（图2-A）。12个EgPYLs蛋白均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守结构域（图2-B）。为了分析油棕PYL家族基因的系统发育进化关系，将EgPYLs蛋白与拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列进行多重比对并构建系统发育进化树，结果（图3）显示，可将3个物种的PYL蛋白分成3个亚族：AtPYL2～AtPYL6、OsPYL2～OsPYL6、EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9和EgPYL11为I亚族，AtPYL7～AtPYL13、OsPYL7～OsPYL13、EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8为II亚族，AtPYL1、AtPYR1、OsPYL1、EgPYL2、EgPYL10和EgPYL12为III亚族。基因共线分析结果显示，EgPYL1和EgPYL6共线性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共线性（图4）。
2. 4 油棕PYL基因家族的启动子顺式作用元件的鉴定
在油棕PYL基因家族成员的启动子中鉴定出大量的顺式作用元件，包括生长素响应元件1个、脱落酸响应元件31个、赤霉素响应元件10个、茉莉酸甲酯响应元件20个、水杨酸响应元件8个、低温响应元件15个、光响应元件48个、防卫和逆境响应元件4个及MYB结合位点14个（表3）;除EgPYL5基因外，其他11个油棕PYL基因家族成员的启动子均含有脱落酸响应元件，表明EgPYLs基因参与植物激素和环境刺激的应答。 2. 5 油棕PYL家族基因的表达分析结果
由图5可知，EgPYLs基因在不同组织中的表达量差异较明显，其中EgPYL5和EgPYL12基因在根中的表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量（P<0.05，下同）;EgPYL1、EgPYL3、EgPYL4、EgPYL6、EgPYL8、EgPYL9和EgPYL11基因在叶中表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量;EgPYL2、EgPYL7和EgPYL10基因在花中表达量最高，其中EgPYL7和EgPYL10基因在花中表达量显著高于在其他组织中的表达量;EgPYL2基因在果肉（15、17、21和23周的果肉混合样）中表达量也较高，与在花中表达量无显著差异（P>0.05），均显著高于在其他组织中的表达量，表明EgPYLs基因在油棕的根、叶、花和果实发育过程中起重要调控作用。
由图6可知，花后15周，油棕果实完成细胞分裂和膨胀，进入成熟阶段;花后17周，油棕果皮开始转色;花后21周，油棕果实进入内含物的快速积累期;花后23周，油棕果实进入完熟期，内含物积累达到峰值。对这4个时期的EgPYLs基因进行表达分析，结果（图7）显示，EgPYL1、EgPYL2、EgPYL5和EgPYL11基因在果肉成熟前期（花后15、17和21周）的表达量显著低于果实成熟后期（花后23周），在油棕果肉成熟过程中，EgPYL4基因的表达量呈先增加后降低的表达趋势，在花后21周达到峰值;EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表达量逐渐增高，在花后23周达到峰值，表明EgPYLs基因在油棕果肉成熟过程中发挥重要调控作用。
由图8可知，外源ABA处理下，有11个EgPYLs基因均被诱导表达，其中EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9、EgPYL10和EgPYL12基因表达量逐渐升高，在处理1.0 h达峰值，然后逐渐降低趋于平缓，表明这11个EgPYLs基因参与外源ABA的响应。
3 讨论
随着测序技术的快速发展，植物的全基因组测序相继完成，为植物基因的挖掘和功能鉴定打下基础。油棕已于2013年完成全基因组测序，基因组大小为1.53 GB，共预测出34802个基因（Singh et al.，2013）。本研究利用序列比对在油棕基因组中鉴定出12个与拟南芥和水稻PYL家族蛋白氨基酸序列高度相似的序列，且均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守结构域，表明其为油棕PYL家族蛋白，采用生物信息学方法对其氨基酸数目、分子量和等电点等基本理化特征进行分析，结果发现其与水稻PLY蛋白（Yadav et al.，2020）的研究结果相似，如油棕PLY蛋白与水稻PLY蛋白的氨基酸序列较相似，且氨基酸数目均为200个左右，等电点在酸碱范围均有分布，分子量均为20 kD左右，表明油棕PYL蛋白可能具有与水稻PYL蛋白相似的功能。此外，本研究基因共线分析结果显示，EgPYL1和EgPYL6共线性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共线性，推测这些共线性基因是由基因复制产生。基因复制事件能导致植物基因组中形成大量的重复基因，重复基因的存在可促进基因新功能的进化，增强植物对环境变化的适应性（Panchy et al.，2016）。而ABA是植物应对逆境胁迫最重要的激素（Verma et al.，2016），故推测PYL家族基因复制可能是油棕作为一个古老物种适应环境变化的一种进化机制。
ABA参与植物各种生理活动，包括促进种子休眠、气孔关闭、器官脱落和果实成熟、参与响应外界生物和非生物胁迫（Nakashima and Yamaguchi-Shinozaki，2013;Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。PYL受体是ABA信号传导路径中的一个核心组分，其基因表达强弱直接影响到ABA的作用。本研究发现，EgPYLs基因在油棕的根、茎尖、叶、花和果實中均有表达（图6），表明EgPYLs基因在油棕生长发育中发挥重要的信号传导作用。ABA作为调控植物果实成熟的重要激素，在番茄和柑橘果实成熟过程中大量积累（Sun et al.，2011;Romero et al.，2012），且外源ABA处理也可促进葡萄、草莓和柿子等植物果实成熟（Rodrigo et al.，2006;Jia et al.，2011，2013），表明PYL在ABA调控果实成熟中发挥关键作用。Kai等（2019）研究发现，超量表达SlPYL9基因促进果实成熟，抑制SlPYL9基因表达则延迟果实成熟。Teh等（2014）对油棕果实发育过程中的ABA含量进行测定，结果发现ABA在油棕果实成熟期迅速积累。本研究也发现，大多数EgPYLs基因的表达量随油棕果实成熟度的增加而逐渐增加，在花后23周达到峰值，表明EgPYLs在内源ABA调控果肉成熟的过程中发挥重要的信号传递作用。此外，本研究用外源ABA处理油棕幼苗，结果发现11个EgPLYs基因的表达受外源ABA处理的诱导，表明EgPYLs基因可能参与油棕对逆境胁迫的响应。进一步证实油棕PYL家族基因不仅参与植物内源ABA的信号传导，还参与植物对外源ABA的响应。
本研究对EgPLYs基因启动子顺式作用元件进行预测分析，结果显示，除了EgPYL5基因以外，11个EgPYLs的启动子区域含有大量的ABA响应元件，进一步说明EgPLYs基因参与油棕对逆境胁迫的响应。水稻OsPYLs基因启动子上也发现大量ABA响应元件（约占32%）（Yadav et al.，2020）。这进一步解释了EgPYLs基因受ABA诱导表达上调的原因。由于油棕遗传转化技术的限制，未对其进行功能验证，今后可通过诱导或抑制EgPYLs基因表达，进一步研究其在油棕果实发育和ABA响应中的调控机制。
4 结论 大多数PYL基因家族成员参与油棕对逆境胁迫的响应，且部分成员（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果实发育中发挥重要的调控作用。
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（責任编辑 陈 燕）
关键词： 油棕;PYR/PYL/RCARs（PYL）基因家族;脱落酸;生物信息学;基因表达
Abstract：【Objective】In this research，the oil palm（Elaeis guineensis） abscisic acid receptor PYR/PYL/RCARs（PYL） gene family members were identified，and their expression characteristics during fruit development and abscisic acid（ABA） treatment were analyzed，which provided evidence for researching the mechanism of ABA signaling pathway in fruit maturation of oil palm. 【Method】The amino acid sequences of Arabidopsis and rice PYL protein were query sequences， identified PYL gene family members from oil palm genome via BLASTp and conservative domain prediction analysis. The chromosomal location，gene structure，promoter cis-acting elements， protein physicochemical properties，conserved functional domains and evolutionary relationships were analyzed through bioinformatics softwares. The expression characteristics of PYL family gene in different，mesocarp at different stages and ABA treatment were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR. 【Result】 The results showed that 12 PLY （EgPYL1-EgPYL12） gene family members were identified form oil palm genome and were distributed on 8 chromosomes and 1 Scaffolds. The extrons numbers of EgPYL family members were between 1 and 3，the open reading frames（ORF） length were between 564 and 765 pb and encoded amino acid numbers were between 187 and 254. The molecular weights were between 20.95 and 28.33 kD，the isoelectric points were between 5.26 and 7.95，the instability indexes were between 32.67 and 52.87，the aliphatic indexes were between 73.87 and 87.60，the total hydrophilicity was between -0.68 and -0.17. Twelve PYL family protein contained PYR/PYL/RCAR functional domain and were divided into 3 groups based on phylogenetic relationships. Collinearity analysis showed that collinearity existed between EgPYL1 gene and EgPYL6 gene，EgPYL4 gene，EgPYL5 gene，EgPYL9 gene and EgPYL11 gene. A large number of plant hormone responses，stress responses and light responses elements were identified on promoters of EgPYLs gene. Expression analysis of different tissues showed that the EgPYLs gene expressed in roots，shoots，leaves，flowers and fruits， with great difference. During fruit maturation，the expressions of EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes increased gradually and reached the peak at 23 weeks after anthesis. Eleven EgPYLs were induced by exogenous ABA treatment. 【Conclusion】Most PYL gene family members are involved in responding to abscisic acid，among them EgPYL7，EgPYL8 and EgPYL9 genes might play important roles in regulating oil palm mesocarp development. 0 引言
【研究意义】油棕（Elaeis guineensis）是世界上产油效率最高的作物之一，果肉含油率高达50%，每公顷产油量高达4.27 t，是花生的7～8倍、大豆的9～10倍（雷新涛等，2012）。从油棕果实压榨的棕榈油广泛应用于食品加工业、日用化工业、机械润滑和生物柴油等诸多领域（Mahlia et al.，2019）。油棕果实的含油量随果实成熟度的增加而增加，成熟期含油量较未成熟期含油量增加79%～95%（殷振华等，2016）。研究发现，油棕果实中ABA含量从花后16周开始迅速上升，到花后21周达到峰值，在花后22周含量略微降低，ABA合成基因NCED1也呈相同的表达特征，表明ABA在油棕果实发育中起着重要的调控作用（Teh et al.，2014;刘艳菊等，2020）。虽然已证实PYR/PYL/RCARs（缩写为PYL）是ABA信号传导途径中最重要的受体蛋白，主要功能是识别ABA信号和启动信号的传递。但对PYL在油棕ABA信号传导中的作用机制尚不清楚，通过生物信息学方法对油棕PYL基因家族成员进行鉴定，明确其在油棕果实发育及ABA处理下的表达特征，对探究ABA信号通路在油棕成熟过程中的功能及培育高含油量油棕品种具有重要意义。【前人研究进展】ABA是植物响应逆境胁迫、调控气孔关闭和果实成熟等多个生物学过程的重要激素之一，在植物果实发育中发挥重要的调控作用（Leng et al.，2014;李红霞，2019;牟望舒，2019）。在无ABA存在的情况下，蛋白磷酸酶2C（PP2C）通过物理相互作用和磷酸酶活性抑制SNF1相关激酶（SnRK2）的活性，使SnRK2s无法启动下游基因的表达;在ABA存在的情况下，ABA与PYL受体结合导致受体的结构改变，激活PYL与PP2C的相互作用，进而破坏PP2C和SnRK2之间的相互作用，促使SnRK2s启动下游基因的表达（Ma et al.，2009;Melcher et al.，2009）。可见，PYL受体发挥识别传递ABA信号的关键功能（Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。Li等（2018）研究发现，拟南芥的AtRCAR12和AtRCAR13基因参与植株对干旱胁迫的应答，即二者过表达可诱导胁迫响应相关基因的表达，提高植株水分利用效率，增强对干旱胁迫的耐受性。Zhang等（2019）研究发现，AtRCAR12和AtRCAR13基因参与对低温和高温胁迫的应答，即在高温胁迫下二者过表达可诱导热激蛋白HSP18.2和HSP70基因表达，以提高对高温胁迫的耐受性;在低温胁迫下二者通过诱导低温响应转录因子基因CBFs的表达提高对低温胁迫的耐受性。Dittrich等（2019）研究发现，拟南芥的6个PYL家族基因均在保卫细胞中表达，其中，AtPYL2是ABA诱导气孔关闭的受体，而AtPYL4和AtPYL5是CO2调控气孔开合的受体。此外，大量研究发现，PYL参与调控植物果实成熟，如香蕉中PYL-PP2C-SnRK2介导的ABA信号通路正向调控香蕉果实成熟（Hu et al.，2017）;在草莓中FaPYL9基因的表达量随果实成熟迅速升高，抑制FaPYL9基因表达则会延迟果实成熟（颜志明等，2015）;番茄中SlPYL9基因过表达可促进果实成熟，抑制SlPYL9基因则延迟果实成熟（Kai et al.，2019）。【本研究切入点】随着越来越多植物基因组测序完成，在番茄（Sun et al.，2011;González-Guzmán et al.，2014）、拟南芥（Gonzalez-Guzman et al.，2012）、甜橙（Romero et al.，2012）、油棕（Singh et al.，2013）、棉花（Zhang et al.，2017）、油菜（Di et al.，2018）、烟草（Bai et al.，2019）、水稻（Yadav et al.，2020）等物种中鉴定出PYL基因家族成员，但目前未见有关油棕PYL基因家族成员鉴定分析及其在油棕果肉发育中的表达特性的研究报道。【拟解决的关键问题】从油棕基因组中鉴定出PYL基因家族成员，分析其染色体定位、基因结构、启动子顺式作用元件及其编码蛋白的理化性质、保守结构域、进化关系，并采用实时荧光定量PCR检测其在不同组织、果肉果实发育期及外源ABA处理下的表达特征，为探究PYL家族基因在油棕生长发育、ABA响应机制中的调控作用及油棕分子育种提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试品种为薄壳种热油4号油棕，种植于国家热带棕榈种质资源圃（东经110°46′，北纬19°33′）。主要试剂：植物总RNA提取试剂盒（DP432）购自北京天根生化科技有限公司;HiScript II One Step RT-PCR Kit试剂盒（P611）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司;实时荧光定量PCR的SYBR? Select Master Mix（4472908）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司;ABA（S18006）购自上海源叶生物科技有限公司。主要仪器：移液器（Eppendorf，德国）、NanoDrop分光光度计（Thermo，美国）、高速冷冻离心机（Thermo，美国）、Labcycler PCR儀（SensoQuest，德国）、水平电泳槽（DYCP-32B，北京六一仪器厂）、电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）、QuantStudio 6 Flex实时荧光定量PCR系统（Thermo，美国）。
1. 2 样品处理及采集
采集5年生薄壳种热油4号油棕的根、茎尖、叶、花（开花期的雄花和雌花）及花后15、17、21和23周的果肉，用于后续PYL家族基因表达组织特性分析。由于前期研究发现100 μmol/L的ABA能有效增强油棕幼苗的抗寒性，故选用100 μmol/L的ABA对幼苗进行外源ABA处理：选取3月龄生长旺盛且无病虫害的幼苗，喷施100 μmol/L的ABA溶液（其中添加0.5%吐温20），分别采集0（对照）、0.5、1.0、3.0、6.0、12.0和24.0 h的新叶叶片。样品采集后液氮速冻，于-80 ℃冰箱中保存以备RNA提取。 1. 3 油棕PYL基因家族的挖掘与鉴定
从NCBI数据库中下载油棕全基因组数据（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/2669）;从TAIR数据库（https：//www.arabidopsis.org/）中下载拟南芥PYL蛋白氨基酸序列;从NCBI数据库中下载水稻PYL蛋白氨基酸序列。以拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列作为参考序列，通过BLASTp在油棕基因组数据中进行比对，并将获得的蛋白氨基酸序列提交至NCBI数据库的保守结构域数据库，利用Batch Web CD-search Tool进行保守结构域分析（Lu et al.，2020），最终确定PYL基因家族成员。采用ExPASy在线工具分析油棕PYL家族蛋白的分子量、等电点、蛋白不稳定指数、脂溶指数和总平均亲水性等理化性质。
1. 4 油棕PYL家族基因核苷酸序列分析
采用Tbtool对油棕PYL家族基因的染色体定位、基因结构、共线性分析及保守结构域分析进行可视化（Chen et al.，2020）;采用ClustalW对油棕、拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列进行多重比对（Edgar and Batzoglou，2006）;采用MEGA 6.0的邻接法（Neighbor-joining）构建系统发育进化树（Kumar et al.，2018;周丽霞和曹红星，2020），校验值Bootstrap设置为1000。
1. 5 油棕PYL家族基因启动子顺式作用元件分析
从NCBI数据库中下载油棕PYL家族基因编码区上游2000 bp的启动子序列。利用PlantCare在线工具对启动子顺式作用元件进行鉴定（Lescot et al.，2002）。
1. 6 油棕PYL家族基因的表达分析
采用植物总RNA提取试剂盒提取油棕不同组织和外源ABA处理样品的总RNA，采用HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis试剂盒合成cDNA;采用SYBR? Select Master Mix进行实时荧光定量PCR检测，以β-actin作为内参基因，引物如表1所示。上述具体步骤均参照试剂盒说明进行。
1. 7 数据分析
采用SPSS 13.0进行数据分析，用Duncan检测法进行差异显著性分析。
2 结果与分析
2. 1 油棕PYL基因家族成员鉴定及染色体定位结果
通过BLASTp比对分析及保守结构域预测，从油棕基因组中共鉴定出12个油棕PYL基因家族成员（EgPYLs），根据其在染色体上位置进行命名，依次命名为EgPYL1～EgPYL12，12个基因的开放阅读框（ORF）长度为564～765 bp，编码的氨基酸数量为187～257个（表1）。由图1可知，12个PYL基因家族成员分布在8条染色体和1个Scaffolds上。其中，EgPYL1和EgPYL2基因在Chr1上，EgPYL3基因在Chr3上，EgPYL4和EgPYL5基因在Chr5上，EgPYL6基因在Chr6上，EgPYL7和EgPYL8基因在Chr7上，EgPYL9基因在Chr10上，EgPYL10基因在Chr11上，EgPYL11基因在Chr14上，EgPYL12基因未能定位到染色体上，而是定位于1条Scaffolds（即NW_011565705.1）上。
2. 2 油棕PYL家族蛋白的理化性质预测结果
由表2可知，12个EgPYLs蛋白的氨基酸数目为187～254个，平均为216个;分子量为20.95～28.33 kD，平均为23.58 kD;等电点（pI）为5.26～7.95，平均为6.81;蛋白不稳定指数为32.67～52.87，平均为43.92，其中，有6个是稳定蛋白（不稳定指数<40.00），有6个是不稳定蛋白（不稳定指数>40.00）;脂溶系数为73.87～87.60，平均为81.53;总平均亲水性为-0.68～ -0.17，平均為-0.36，均为负值，表明12个EgPYLs蛋白均表现为亲水性。
2. 3 油棕PYL家族基因结构及其编码蛋白保守结构域和进化关系分析
12个EgPYLs基因的外显子和内含子差异较大，其中EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8基因有3个外显子，2个内含子，而其余基因均含有1个外显子，无内含子（图2-A）。12个EgPYLs蛋白均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守结构域（图2-B）。为了分析油棕PYL家族基因的系统发育进化关系，将EgPYLs蛋白与拟南芥和水稻的PYL蛋白氨基酸序列进行多重比对并构建系统发育进化树，结果（图3）显示，可将3个物种的PYL蛋白分成3个亚族：AtPYL2～AtPYL6、OsPYL2～OsPYL6、EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9和EgPYL11为I亚族，AtPYL7～AtPYL13、OsPYL7～OsPYL13、EgPYL1、EgPYL3、EgPYL6和EgPYL8为II亚族，AtPYL1、AtPYR1、OsPYL1、EgPYL2、EgPYL10和EgPYL12为III亚族。基因共线分析结果显示，EgPYL1和EgPYL6共线性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共线性（图4）。
2. 4 油棕PYL基因家族的启动子顺式作用元件的鉴定
在油棕PYL基因家族成员的启动子中鉴定出大量的顺式作用元件，包括生长素响应元件1个、脱落酸响应元件31个、赤霉素响应元件10个、茉莉酸甲酯响应元件20个、水杨酸响应元件8个、低温响应元件15个、光响应元件48个、防卫和逆境响应元件4个及MYB结合位点14个（表3）;除EgPYL5基因外，其他11个油棕PYL基因家族成员的启动子均含有脱落酸响应元件，表明EgPYLs基因参与植物激素和环境刺激的应答。 2. 5 油棕PYL家族基因的表达分析结果
由图5可知，EgPYLs基因在不同组织中的表达量差异较明显，其中EgPYL5和EgPYL12基因在根中的表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量（P<0.05，下同）;EgPYL1、EgPYL3、EgPYL4、EgPYL6、EgPYL8、EgPYL9和EgPYL11基因在叶中表达量最高，显著高于在其他组织中的表达量;EgPYL2、EgPYL7和EgPYL10基因在花中表达量最高，其中EgPYL7和EgPYL10基因在花中表达量显著高于在其他组织中的表达量;EgPYL2基因在果肉（15、17、21和23周的果肉混合样）中表达量也较高，与在花中表达量无显著差异（P>0.05），均显著高于在其他组织中的表达量，表明EgPYLs基因在油棕的根、叶、花和果实发育过程中起重要调控作用。
由图6可知，花后15周，油棕果实完成细胞分裂和膨胀，进入成熟阶段;花后17周，油棕果皮开始转色;花后21周，油棕果实进入内含物的快速积累期;花后23周，油棕果实进入完熟期，内含物积累达到峰值。对这4个时期的EgPYLs基因进行表达分析，结果（图7）显示，EgPYL1、EgPYL2、EgPYL5和EgPYL11基因在果肉成熟前期（花后15、17和21周）的表达量显著低于果实成熟后期（花后23周），在油棕果肉成熟过程中，EgPYL4基因的表达量呈先增加后降低的表达趋势，在花后21周达到峰值;EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9基因的表达量逐渐增高，在花后23周达到峰值，表明EgPYLs基因在油棕果肉成熟过程中发挥重要调控作用。
由图8可知，外源ABA处理下，有11个EgPYLs基因均被诱导表达，其中EgPYL4、EgPYL5、EgPYL7、EgPYL9、EgPYL10和EgPYL12基因表达量逐渐升高，在处理1.0 h达峰值，然后逐渐降低趋于平缓，表明这11个EgPYLs基因参与外源ABA的响应。
3 讨论
随着测序技术的快速发展，植物的全基因组测序相继完成，为植物基因的挖掘和功能鉴定打下基础。油棕已于2013年完成全基因组测序，基因组大小为1.53 GB，共预测出34802个基因（Singh et al.，2013）。本研究利用序列比对在油棕基因组中鉴定出12个与拟南芥和水稻PYL家族蛋白氨基酸序列高度相似的序列，且均含有PYL家族蛋白特有的PYR/PYL/RCAR保守结构域，表明其为油棕PYL家族蛋白，采用生物信息学方法对其氨基酸数目、分子量和等电点等基本理化特征进行分析，结果发现其与水稻PLY蛋白（Yadav et al.，2020）的研究结果相似，如油棕PLY蛋白与水稻PLY蛋白的氨基酸序列较相似，且氨基酸数目均为200个左右，等电点在酸碱范围均有分布，分子量均为20 kD左右，表明油棕PYL蛋白可能具有与水稻PYL蛋白相似的功能。此外，本研究基因共线分析结果显示，EgPYL1和EgPYL6共线性，EgPYL4、EgPYL5、EgPYL9和EgPYL11共线性，推测这些共线性基因是由基因复制产生。基因复制事件能导致植物基因组中形成大量的重复基因，重复基因的存在可促进基因新功能的进化，增强植物对环境变化的适应性（Panchy et al.，2016）。而ABA是植物应对逆境胁迫最重要的激素（Verma et al.，2016），故推测PYL家族基因复制可能是油棕作为一个古老物种适应环境变化的一种进化机制。
ABA参与植物各种生理活动，包括促进种子休眠、气孔关闭、器官脱落和果实成熟、参与响应外界生物和非生物胁迫（Nakashima and Yamaguchi-Shinozaki，2013;Leng et al.，2014;García-Andrade et al.，2020）。PYL受体是ABA信号传导路径中的一个核心组分，其基因表达强弱直接影响到ABA的作用。本研究发现，EgPYLs基因在油棕的根、茎尖、叶、花和果實中均有表达（图6），表明EgPYLs基因在油棕生长发育中发挥重要的信号传导作用。ABA作为调控植物果实成熟的重要激素，在番茄和柑橘果实成熟过程中大量积累（Sun et al.，2011;Romero et al.，2012），且外源ABA处理也可促进葡萄、草莓和柿子等植物果实成熟（Rodrigo et al.，2006;Jia et al.，2011，2013），表明PYL在ABA调控果实成熟中发挥关键作用。Kai等（2019）研究发现，超量表达SlPYL9基因促进果实成熟，抑制SlPYL9基因表达则延迟果实成熟。Teh等（2014）对油棕果实发育过程中的ABA含量进行测定，结果发现ABA在油棕果实成熟期迅速积累。本研究也发现，大多数EgPYLs基因的表达量随油棕果实成熟度的增加而逐渐增加，在花后23周达到峰值，表明EgPYLs在内源ABA调控果肉成熟的过程中发挥重要的信号传递作用。此外，本研究用外源ABA处理油棕幼苗，结果发现11个EgPLYs基因的表达受外源ABA处理的诱导，表明EgPYLs基因可能参与油棕对逆境胁迫的响应。进一步证实油棕PYL家族基因不仅参与植物内源ABA的信号传导，还参与植物对外源ABA的响应。
本研究对EgPLYs基因启动子顺式作用元件进行预测分析，结果显示，除了EgPYL5基因以外，11个EgPYLs的启动子区域含有大量的ABA响应元件，进一步说明EgPLYs基因参与油棕对逆境胁迫的响应。水稻OsPYLs基因启动子上也发现大量ABA响应元件（约占32%）（Yadav et al.，2020）。这进一步解释了EgPYLs基因受ABA诱导表达上调的原因。由于油棕遗传转化技术的限制，未对其进行功能验证，今后可通过诱导或抑制EgPYLs基因表达，进一步研究其在油棕果实发育和ABA响应中的调控机制。
4 结论 大多数PYL基因家族成员参与油棕对逆境胁迫的响应，且部分成员（如EgPYL7、EgPYL8和EgPYL9）在油棕果实发育中发挥重要的调控作用。
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（責任编辑 陈 燕）