第一部分 消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的实验研究研究背景和研究目的淋巴水肿是由于淋巴管阻塞后淋巴回流障碍,过多的富含蛋白质的液体积聚于组织间隙所致。它分为原发性和继发性两大类。原发性淋巴水肿大多原因不明,是由淋巴管扩张、瓣膜功能不全或缺如等先天发育不良所致。继发性淋巴水肿的常见病因包括丝虫病、外科手术、放疗、创伤、反复感染和肿瘤浸润转移等。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)淋巴学会近年估计,全世界患淋巴水肿患者达1.4亿,约10%的患者属于先天性淋巴系统缺陷引起的原发性淋巴水肿;其余90%则属于继发性淋巴水肿,其中4500万人为丝虫性淋巴水肿(象皮肿),乳腺癌术后患上肢淋巴水肿者为2000万。淋巴水肿被WHO列为第二大致残疾病,严重危害患者的身心健康。我国曾是丝虫性淋巴水肿最严重的国家之一,但到本世纪初我国已基本消灭了丝虫病,目前已较难见到丝虫性淋巴水肿。然而继发性淋巴水肿的患者并未减少,随着接受外科根治性手术和(或)放疗的恶性肿瘤患者不断增多,继发性淋巴水肿的发病率逐年攀升。有报道称,乳腺癌术后淋巴水肿的发生率在6%～30%,盆腔恶性肿瘤术后的发生率在1%～47%,头颈部肿瘤术后的发生率在22%～56%。以往世界各国虽对上述疾病进行了多方面治疗研究(包括外科手术),但仍无理想治愈的方法。因此探索淋巴水肿、乳糜尿的有效治疗药物仍是目前亟待攻克的关键性问题。山东省寄生虫病防治研究所王培义课题组在长期治疗乳糜尿和淋巴水肿的实践中,根据祖国医学辩证施治和标本兼治的治疗方法,研制应用消肿乳糜清片剂以每人9g/d、3次分服、1个月为1疗程的方法分别治疗乳糜尿315例和肢体淋巴水肿341例,经1～7个疗程治疗后总有效率为100%,其中治愈率分别为98.41%、73.82%。近20年来,该课题组又在安徽、江苏等16个省、自治区,治疗观察淋巴水肿患者达3万余例,均获得了与上述结果大致相同的显著疗效。同时王培义等从中药药理学研究出发,运用现代医学生物学的研究方法和策略,研究发现中药消肿乳糜清片剂具有显著的抗炎、消肿、降低毛细血管通透性、激活并增强网状内皮系统的吞噬功能、对因缺氧受损的淋巴管内皮细胞具有显著的保护作用等多种功效。但受当时各种条件的限制,未能将该药物的作用机制进行深入的研究。我们在本研究中对消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子机制进行探索。由于具有易于获取、成本效益高并可形成稳定的淋巴水肿等特点,啮齿类动物模型受到了极大的欢迎。放疗和手术的结合能有效地促进大鼠和小鼠后肢形成稳定的淋巴水肿。与后肢模型相比,Slavin等报道的啮齿类动物尾部淋巴水肿模型具有解剖和手术操作简单且重复性好的优点,已被广泛用于淋巴水肿的外科治疗、基因治疗和淋巴管生成的分子机制的研究。因此,我们采用鼠尾淋巴水肿模型进行消肿乳糜清片剂治疗外科手术后淋巴水肿的疗效及分子机制的研究。表皮棘细胞层是皮肤中淋巴液循环和物质交换的场所。激光扫描共聚焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope,LSCM)在光学显微镜基础上结合了激光和计算机图象处理技术,把光学显微镜的分辨率提高了 30-40%,其光学切片的性能可观察组织、细胞的三维结构。活体反射共聚焦显微镜技术可以无创性地显示表皮和真皮乳头层,其图像可达组织学分辨力。本研究应用共聚焦显微镜检测皮肤淋巴水肿的状态和程度,并进行定性和定量分析。鉴于继发性淋巴水肿的危害及目前没有根治的方法,本研究通过构建鼠尾淋巴水肿模型,研究激光扫描共聚焦显微镜诊断继发性淋巴水肿的可行性,并探讨中药乳糜消肿片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子作用机制,为中医中药治疗淋巴水肿提供理论依据和实验基础。研究内容1.建立鼠尾淋巴水肿模型并应用激光扫描共聚焦显微镜技术进行评估研究;2.探讨消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效;3.探讨消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的分子机制。研究方法试验一激光共聚焦显微镜技术对鼠尾淋巴水肿模型的评估研究1.动物模型的建立和分组:选用6-8周龄的Wistar大鼠,通过外科手术切断并结扎鼠尾淋巴管建立鼠尾淋巴水肿模型。分为淋巴水肿组、假手术组和空白对照组,共3组,每组6只。2.鼠尾淋巴水肿的评估1)鼠尾直径变化率:分别在术前及术后1、3、5、7、9、11、14、21、28、35、42天观察鼠尾皮肤的变化并用游标卡尺测量距根部20mm处鼠尾直径。鼠尾直径变化率=(术后鼠尾直径-术前鼠尾直径)/术前鼠尾直径。2)利用核素显像检测术后7天各组鼠尾淋巴回流变化。3)利用激光共聚焦显微镜检测术后7天各组鼠尾皮肤变化。利用ImagJ软件测量表皮棘细胞层灰度值,每张图片测量3次后取平均值。4)利用HE染色法观察术后7天各组鼠尾皮肤形态及结构的病理改变。5)利用免疫组化法观察术后7天各组鼠尾皮肤组织中同源异型转录因子(Prospero-related homeobox 1,PROX1)的表达情况。利用 ImagJ软件测量PROX1染色淋巴管面积3次后取平均值。试验二消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子机制研究1.动物模型的建立、分组和药物干预:选用6-8周龄的Wistar大鼠,造模方法同试验一。分为治疗组:(1)低剂量消肿乳糜清片剂组、(2)中剂量消肿乳糜清片剂组、(3)高剂量消肿乳糜清片剂组;对照组:(1)淋巴水肿组、(2)地奥司明组、(3)空白对照组。共6组,每组8只。消肿乳糜清片剂低、中、高剂量组的给药剂量分别为1g/kg、2g/kg、4g/kg。地奥司明组的给药剂量为0.4g/kg。从术后第1天开始,每天1次灌胃给药,连续给药28天,观察疗效。2.干预后鼠尾淋巴水肿的评估1)鼠尾直径变化率:分别在术前及术后1、3、5、7、9、11、14、21、28天观察鼠尾皮肤的变化并用游标卡尺测量距根部20mm处鼠尾直径。鼠尾直径变化率=(术后鼠尾直径-术前鼠尾直径)/术前鼠尾直径。2)利用核素显像检测术后28天各组鼠尾淋巴回流变化。3)利用激光共聚焦显微镜检测术后28天各组大鼠鼠尾皮肤变化。利用ImagJ软件测量表皮棘细胞层灰度值,每张图片测量3次后取平均值。4)利用HE染色法观察术后28天各组鼠尾皮肤形态及结构的病理改变。5)利用免疫组化法观察术后28天鼠尾皮肤组织中同源异型转录因子(Prospero-related homeobox 1,PR0X1)、血管内皮生长因子 C(Vascular endothelial growth factor C,VEGF-C)的表达情况。利用 ImagJ 软件测量PR0X1染色淋巴管面积和VEGF-C染色淋巴管灰度值3次后取平均值。研究结果试验一激光共聚焦显微镜技术对鼠尾淋巴水肿模型的评估研究1.成功建立鼠尾淋巴水肿模型:淋巴水肿组术后第1天鼠尾开始出现肿胀,并逐渐加重,术后第7天达水肿高峰,严重者皮肤可出现水疱。随后鼠尾水肿逐渐消退,术后42天仅有轻度肿胀,伤口瘢痕愈合,但鼠尾皮肤发硬、纤维化。假手术组术后鼠尾轻度肿胀,术后7天伤口自行愈合。2.鼠尾淋巴水肿的评估结果1)鼠尾直径变化率结果:术后第1天,淋巴水肿组的鼠尾直径较正常对照组增加0.188,有统计学差异(P<0.0001);假手术组的鼠尾直径较正常对照组增加0.01,无统计学差异(P=0.5747)。术后第7天,淋巴水肿组的鼠尾直径较正常对照组增加0.595,统计学差异最大(P<0.0001);假手术组的鼠尾直径较正常对照组增加0.012,无统计学差异(P0.78)。2)核素显像结果:淋巴水肿组手术部位及远端皮内、皮下出现大量的示踪剂滞留,近端淋巴链及淋巴结未见显影。正常对照组鼠尾淋巴链显影清晰,盆腔巴结呈圆形或卵圆形,形态清楚。3)共聚焦显微镜结果:正常对照组表皮层次清晰,棘细胞层细胞分布均匀,无扩大。淋巴水肿组表皮层次不清晰,棘细胞层细胞水肿扩大,透光度增加。淋巴水肿组与正常对照组在术前无明显统计学差异(P=0.4315)。术后第7天,淋巴水肿组较正常对照组增加25.32,两组间有显著统计学差异(P<0.0169),假手术组与正常对照组在术后第7天无统计学差异(P>0.5667)。4)HE染色结果:正常对照组真皮与表皮之间的界限存在;表皮与真皮细胞之间没有增加的细胞,没有扩大的细胞核和过度角化。淋巴水肿组的皮肤有明显的急性炎症变化:表皮有水肿、过度角化和海绵化,表皮和真皮连接不均匀,真皮乳头延伸,以及在骨和表皮之间有2-3倍的组织扩张。细胞结构有显著的变化,可观察到大量的成纤维细胞和组织细胞,同时有大量中性粒细胞浸润,在靠近中心的区域可观察到肉芽组织。5)PROX1免疫组化结果:术后第7天,淋巴水肿组平均淋巴管数为4.333 ±0.816,正常对照组为0.833 ±0.408,假手术组为1.000 ± 1.095。淋巴水肿组较正常对照组增加3.5,两组间有显著统计学差异(P<0.0001),假手术组与正常对照组在术后第7天无统计学差异(P=0.7)。淋巴水肿组平均淋巴管面积为0.037± 0.010mm2,正常对照组为0.006 ± 0.004mm2,假手术组为0.007 ± 0.006mm2。淋巴水肿组较正常对照组增加0.031,两组间有显著统计学差异(P<0.00001),假手术组与正常对照组在术后第7天无统计学差异(P=0.70279)。试验二消肿乳糜清片剂治疗继发性淋巴水肿的疗效及分子机制研究1.干预后鼠尾的外观变化:除正常对照组外,余各组术后第1天鼠尾均开始出现肿胀,并逐渐加重,淋巴水肿组肿胀最重,高剂量消肿乳糜清片剂组最轻。术后第7天达水肿高峰,随后鼠尾水肿逐渐消退,术后28天仅有轻度肿胀,伤口瘢痕愈合。2.干预后鼠尾淋巴水肿的评估结果1)鼠尾直径变化率结果:术后第1天,空白对照组鼠尾直径变化率较淋巴水肿组下降0.21(P<0.0001),余各组与淋巴水肿相比无统计学差异。术后第7天,各组鼠尾直径变化率均较淋巴水肿组降低,其中高剂量组降低0.17(P<0.0001),有统计学差异。与淋巴水肿组相比,低剂量药物组鼠尾直径变化率在术后28天降低0.02(P=0.1657)。随着药物浓度的增加,淋巴水肿的程度逐渐减轻,中剂量药物组鼠尾直径变化率在术后28天降低0.04(P=0.01),高剂量组鼠尾直径在术后28天降低0.12(P<0.0001),有统计学差异,未发现阈值饱和效应。2)核素显像结果:术后28天淋巴水肿组、低剂量组:鼠尾远端皮内、皮下出现较多示踪剂滞留,鼠尾淋巴链出现不完全性中断,盆腔淋巴结未见显影。中剂量组、高剂量组、地奥司明组:鼠尾淋巴链显影欠清晰,盆腔淋巴结部分显影。空白对照组:鼠尾淋巴链显影清晰,盆腔淋巴结呈圆形或卵圆形,形态清楚。3)共聚焦显微镜结果:术后28天淋巴水肿组棘细胞层平均灰度值为200.80 ± 8.98,低剂量组为194.30 ± 12.54,中剂量组为192.81 ± 11.09,高剂量组为178.95 ± 11.57,地奥司明组为185.80 ± 11.93及空白对照组为178.50 ± 15.30。低剂量组灰度值在术后28天较淋巴水肿组降低6.5(P=0.2869),无统计学差异。随着药物浓度的增加,淋巴水肿的程度逐渐减轻,高剂量组灰度值在术后28天较淋巴水肿组降低21.85(P0.0008),有统计学差异。4)HE染色结果:术后28天淋巴水肿组、中剂量组及低剂量组鼠尾皮肤的HE染色表现:淋巴水肿表皮有不同程度水肿,表皮和真皮连接不均匀,真皮乳头延伸,以及在骨和表皮之间有组织扩张。细胞结构有变化,观察到成纤维细胞和组织细胞,同时有中性粒细胞浸润,在靠近中心的区域可观察到肉芽组织。空白对照组、地奥司明组及高剂量组鼠尾皮肤的HE染色表现:真皮与表皮之间的界限存在;表皮与真皮细胞之间没有增加的细胞,没有扩大的细胞核和过度角化。5)PR0X1免疫组化结果:PROX1染色的淋巴管高倍镜(400×)表现为具有棕色内皮细胞染色的管腔。术后28天淋巴水肿组平均淋巴管面积为0.127 ±0.052mm2,低剂量组为 0.067 ± 0.059mmm2,中剂量组为 0.048 ± 0.046mm2,高剂量组为0.028 ± 0.017mm2,地奥司明组为0.033 ± 0.019mm2及空白对照组为0.008± 0.003mm2。与淋巴水肿组相比,低剂量组淋巴管面积在术后28天减少0.06(P=0.0036),有统计学差异。随着药物浓度的增加,淋巴水肿的程度逐渐减轻,高剂量组淋巴管面积在术后28天减少0.1(P<0.0001),有统计学差异。6)VEGF-C免疫组化结果:VEGF-C免疫组化阳性的高倍镜(400×)表现为淋巴管内皮细胞胞浆有棕黄色染色,且明显高于背景染色。术后28天淋巴水肿组平均灰度值为89.54 ± 15.24,低剂量组为114.89 ±7.20,中剂量组为116.72 ± 11.60,高剂量组为123.53 ± 12.25,地奥司明组为116.81 ± 13.11及空白对照组为32.87±9.31。与淋巴水肿组相比,低剂量组VEGF-C染色淋巴管平均灰度值在术后28天较淋巴水肿组增加25.3(P<0.0001),有统计学差异。随着药物浓度的增加,淋巴水肿的程度逐渐减轻,高剂量组平均灰度值在术后28天较淋巴水肿组增加33.99(P<0.0001),有统计学差异。结论1.使用切断并结扎鼠尾淋巴管的方法可成功构建鼠尾淋巴水肿模型,激光共聚焦显微镜技术可定性、定量地评估动物模型淋巴水肿的状态和程度。2.低剂量消肿乳糜清片剂对外科手术后鼠尾淋巴水肿有治疗作用,随着药物浓度的增加,对继发性淋巴水肿的治疗作用也逐渐增加,高剂量消肿乳糜清片剂对继发性淋巴水肿的治疗作用最明显。3.消肿乳糜清片剂通过增加淋巴管内皮细胞VEGF-C的表达,促进淋巴管的形成与再生。第二部分MTS继发下肢DVT的回顾性分析研究研究背景和研究目的May-Thurner综合征(May-Thurner syndrome,MTS)又称为髂静脉受压综合征(iliac vein compression syndrome,IVCS)或 Cockett 综合征(Cockett syndrome),是指髂静脉长期受到前方髂动脉和后方第5腰椎的压迫,逐渐出现管腔的狭窄或闭塞,进而导致髂静脉及其以远静脉的回流障碍,并由此引起一系列临床症状的综合征。髂血管胚胎发育的特点和特殊的解剖结构是MTS发病的主要原因。髂和脐血管系统均是胎儿发育过程中的重要血管束。胚胎的静脉系统是由原始静脉系统发育而成的。原始静脉系统包括卵黄、脐带和主静脉系统。随着主静脉系统的不断发育,在第6至10孕周期骶尾部的下腔静脉和髂总静脉先后形成。与髂静脉发育不同,髂动脉系统起源于第5腰椎动脉。在胎儿发育的第5周,双侧脐动脉与髂内动脉建立通路,胎儿通过此通路将乏氧血运回母体。作为胎儿富氧血的主要来源,脐带系统对生命至关重要。考虑到上述特点,进化的压力使得脐血管系统优先于髂血管系统发育。为了首先保证脐血管系统与胎盘相连,髂血管系统在其形态与功能的发育上不得不做出让步。这可能是髂静脉被髂动脉横跨而过的潜在原因。虽然右髂总动脉压迫左髂总静脉是形成静脉嵴的直接原因,但右髂总动脉与腰椎之间的位置关系可能是形成MTS的真正原因。身体的其他部位同样存在动静脉并行,如股动脉与股静脉等。在股鞘中,股动脉的压力平均地转移到股静脉。然而在MTS中,由于紧贴腰椎,来自右髂总动脉的任何压力都可能转变成对左髂总静脉的压迫。MTS常见的临床表现是下肢深静脉血栓形成(deep vein thrombosis,DVT)和下肢慢性静脉功能不全(chronic venous insufficiency,CVI)。下肢深静脉血栓形成通常表现为突发下肢肿胀,腹股沟区、大腿部及腓肠肌区疼痛,皮温升高,严重者可出现股青肿或股白肿。18-49%的左下肢深静脉血栓形成是由左髂静脉受压造成的。如果DVT没有得到及时、有效的诊治,有20%-40%的患者会发生深静脉血栓形成后综合征(postthrombotic syndrome,PTS)。下肢慢性静脉功能不全是由长期下肢静脉高压所致,而PTS是下肢静脉高压的主要原因之一。常见的临床表现如下肢浅静脉曲张、肿胀、疼痛、色素沉着以及溃疡等。在有临床症状的下肢慢性静脉功能不全的患者中,高达55%的患者合并近端血管的狭窄或阻塞,如髂静脉受压等,其中MTS约占所有病因的2%-5%。MTS的治疗包括外科重建和血管腔内手术治疗。在血管腔内手术未广泛开展之前,外科重建手术治疗MTS已经取得了一定的效果。其适应证主要是针对有静脉闭塞症状且经保守或血管腔内治疗失败的病例。相关的外科手术术式包括:(1)Palma-Dale手术;(2)人工血管旁路移植术;(3)右髂动脉后置吻合术;(4)髂动脉悬吊术;(5)髂静脉松解、衬垫减压术。Jost等(2001))通过分析1985年1月至1999年6月因髂静脉的良性狭窄或阻塞接受髂-腔静脉或下腔静脉重建患者的病历资料,指出外科重建手术的初期和3年通畅率分别为54%和62%。由于外科重建手术的创伤大、远期通畅率不高,目前MTS的患者首选血管腔内治疗,治疗失败后再考虑外科手术。对于确诊的MTS患者,通常先予以经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)进行临时扩张,随后置入支架。有研究表示支架置入对治疗原发的髂静脉阻塞效果良好,6年的一期、辅助一期和二期通畅率分别为79、100和100%。MTS的患者通常会合并髂静脉及其以远静脉血栓形成,目前主要通过导管接触溶栓(catheter-directed thromblysis,CDT)或经皮腔内机械碎栓(percutaneous mechanical thrombectomy,PMT)进行治疗。一些研究者已将上述不同的腔内治疗技术进行整合,如CDT联合支架置入、PMT联合支架置入等,取得了不错的效果。来自两个不同研究组的关于支架置入治疗血栓形成后髂静脉阻塞的报告:6年的一期、辅助一期和二期通畅率分别为57、80和86%;10年的一期、辅助一期和二期通畅率分别为83、89 和 93%。本研究的主要目的:(1)了解2014年6月-2016年9月在济宁医学院附属医院诊治的146名急性下肢DVT患者的发病特点,与国内外同类研究结果进行比较,总结出鲁西南地区该疾病的流行病学特点,并期待发现新的规律。(2)探讨CDT和CDT联合髂静脉支架置入两种手术方式治疗MTS继发下肢DVT的疗效差别,并通过随访了解髂静脉支架的近期和中期通畅率。研究方法本研究经济宁医学院附属医院伦理委员会审查通过,收集从2014年6月-2016年9月在济宁医学院附属医院血管外科诊治的146名急性下肢DVT患者的临床资料,并进行回顾性分析。由于本研究为回顾性研究,免除签署患者知情同意书。效应指标包括:性别、年龄、高危因素、发病部位、D-二聚体、下肢静脉彩超、静脉造影、肺动脉CTA、髂血管CTA、导管接触溶栓、髂静脉支架置入及随访结果。利用EmpowerStates软件进行统计分析。研究结果1.MTS并DVT组与非MTS并DVT组性别、年龄相比,两组性别差异有统计学意义(P<0.001),年龄差异无统计学意义(P=0.759)。2.MTS并DVT组与非MTS并DVT组高危因素相比,两组差异无统计学意义(P=0.179)。3.MTS并DVT组与非MTS并DVT组发病时间、部位相比,两组发病时间差异无统计学意义(P=0.460),两组发病部位差异有统计学意义(P<0.001)。4.MTS并DVT组与非MTS并DVT组D-二聚体相比,两组差异有统计学意义(P=0.042)。5.MTS并DVT组与非MTS并DVT组血栓类型相比,两组差异有统计学意义(P<0.001)。6.MTS并DVT组与非MTS并DVT组髂血管CTA诊断MTS病例相比,两组差异有统计学意义(P<0.001)。7.MTS并DVT组与非MTS并DVT组肺栓塞病例相比,两组比较差异有统计学意义(P=0.006)。8.112例行肺动脉CTA的DVT患者分为MTS组与非MTS组,并进行对照分析。单因素回归分析结果发现,MTS(OR0.3,95%CI0.1-0.7;P=0.008)、右下肢DVT(OR 3.93,95%CI 1.1-14.6;P=0.0406)、D-二聚体中三分位组(OR2.8,95%CI 1.1-7.5;P=0.0343)是发生肺栓塞共同的危险因素。多因素回归分析结果显示未调整模型中 MTS 与 PE 呈负相关(OR0.28,95%CI 0.11-0.71;P=0.0075);模型 1中 MTS 与 PE 呈负相关(OR 0,17,95%CI 0.04-0.68;P=0.0125);模型 2 中 MTS与 PE 呈负相关(OR 0.15,95%CI 0.03-0.71;P=0.016)。9.MTS并DVT组行导管接触溶栓治疗(CDT)的患者78例。术后随访时间1-24个月。随访69例,失访9例,随访率88.46%。行CDT+髂静脉支架置入的患者25例,术后随访时间1-24个月。随访25例,失访0例,随访率100%。本组病例术后1月、3月、6月、1年、2年支架一期通畅率均为100%。利用随机效应模型分析CDT组和CDT+Stent组在不同时间点对VDS的影响无明显差异。结论在本研究中,MTS好发于女性患者,容易继发左下肢深静脉血栓形成,以中央型和混合型多见。髂血管CTA诊断MTS的准确性高。合并MTS的急性下肢DVT发生肺栓塞的机率低,MTS是影响肺栓塞发生的独立危险因素。血管腔内治疗合并MTS的下肢DVT近期效果良好,通畅率高。