论文部分内容阅读
摘要：micro RNAs（mi RNAs）是一类广泛存在于真核生物中的长度为 18-25nt 的非编码的小 RNA，具有保守性、时序性和组织特异性，其在生物的生长、发育、分化、凋亡等生物过程中发挥着重要的调控作用。本论文主要综述了近年来在micro RNAs领域的研究进展，并对其生物合成方法予以综述。
关键词：micro RNAs； 生物合成； 分子遗传学
引言
RNA 组学是遗传学的一门新兴分支学科，主要研究细胞内非编码核糖核酸的结构、功能及加工过程。而 micro RNA 组学是 RNA 组学的一个分支，主要研究小分子 RNA 调节子的生物合成过程与机制，以及它们在生长发育、分化、细胞增殖、细胞凋亡、染色体分离和代谢等过程中所发挥的作用。自 Rosalind C. Lee 等 1993 年在秀丽隐杆线虫中发现首个 micro RNA 以来，已先后在植物、动物、病毒等中发现了数以千计的 micro RNAs，micro RNA 的研究也已成为热点之一。目前识别 micro RNA 的方法主要有实验方法（遗传筛选、直接克隆）和生物信息学方法。由于 micro RNA 在某些真核生物中表达丰度较低，而且其表达受组织和时序特异性限制，用实验方法直接发现新的 micro RNA 有时存在很大困难。而基于 micro RNA 高度保守性的生物信息学方法则可以避免这种问题，从而成为了当前发现和鉴定 micro RNA 的一个重要手段。生物信息学方法通过计算机手段对生物学数据进行分析和处理，从而在各种生物已有的基因序列库中寻找未知 micro RNA 及其靶基因，大大提高了人们发现 micro RNA 的效率。
一 micro RNA发现及其研究历程
1993 年，哈佛大学的 Rosalind C. Lee 及他的同事们在线虫鉴定出第一个非编码的 micro RNA 序列。几乎与此同时，Bruce Wightman 等人证明了 lin-14是首个 micro RNA 的靶基因。这两个重大发现共同确认了一种新的转录后基因调节机制。但是直到 RNA 干扰技术的发现和 2000 年第二个 micro RNA——let-7的鉴定，micro RNA 研究才飞速发展起来了。let-7 的高度保守性吸引了众多目光，此后，研究者们先后在多种生物（从原生动物到人类）中发现了 micro RNA的存在。人们对于 micro RNA 的多样性、进化、生物合成、表达、功能及分子机制的研究也取得了显著的进展。这种小分子 RNA 可以调控几乎所有重要的生命活动，如基因转录及转录后加工、细胞分化及凋亡、个体发育、遗传及表观遗传等。目前已经发现一些 micro RNA 与许多复杂疾病有关，其变异可能导致细胞发育异常或癌变。这些重大发现引起了全世界的关注，micro RNA 的鉴定及功能分析已经成为生命科学研究的热点与前沿问题。
2002 年，美国《科学》杂志评选的年度十大科技突破中，micro RNA 的发现名列榜首。自 1993 年首个 micro RNA 和 2000 年第二個 micro RNA 的发现以来，真正专注于 micro RNA 的研究才进行了十多年，但这种小分子已经不断给我们带来惊喜。micro RNA 似乎无处不在，参与调节各种各样的生物反应及几乎所有的生物学过程，例如细胞生命周期调控、形态发生、分化、胁迫等。关于 micro RNA各方面的研究正在全球各地的研究机构中如火如荼地开展着，越来越多的研究发现揭示了其在生物中多样而显著的作用，而且 micro RNA 研究也已经越来越多与已有的生命科学、化学手段等结合起来。在分子及基因层面对 micro RNA 的研究也很好的解释了很多宏观层面的问题，例如花周期变化、肿瘤细胞增殖等。采用经典遗传学方法确定首个 micro RNA 及其功能后不久，Lagos-Quintana M.等通过实验方法发现了大量 micro RNAs。但是实验方法常常受限于 micro RNA 表达的低通量及不确定性，要清楚地阐释 micro RNA 的功能仍存在困难，对于那些组织特异性强的 micro RNA 更是如此。有人认为高通量的 micro RNA 实验鉴定方法能很好解决问题，可是这样的方法并不存在。因此，计算机方法应运而生。近十多年来，micro RNA 相关的信息呈现出了爆炸似的增长，如基因形式、生物合成、作用机制、调控功能等。要想有效查询和利用这些信息，计算方法已必不可少。
二 micro RNA计算方法及其应用进展
最初鉴定 micro RNA 的计算方法出现于 2003 年，用于线虫和果蝇。此后，很快出现了可运用于植物、人类及其他生物的计算机方法。相应地，最初的靶基因预测程序发表于 2003 年年底到 2004 年年初，主要是预测人类及果蝇的micro RNA 靶基因。目前，预测动物、植物 micro RNA 靶基因的预测算法都已有公布，并供公开使用，大大促进了计算机预测方法的发展。研究者们通过计算机方法已在人类、老鼠、牛、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等生物中获得了大量可能的 micro RNA 及其靶基因，部分已经通过实验验证。这些都给了 micro RNA 研究者极大的信心，因为不只是获得了序列，许多 micro RNA都已被证明与动植物生长发育、胁迫响应、新陈代谢、信号转导及人类肿瘤、癌症等多种疾病相关。
micro RNA 的计算机方法通常都是 micro RNA 预测与靶标预测相结合，以某生物的全基因组数据库或者 EST、GSS 等数据库作基础，与已公布的 micro RNA 做BLAST 比较，然后再进行严格筛选，以作靶标预测，最后再做功能分析。目前主要的生物学数据库包括 NCBI Gen Bank、EMBL、Swiss-Prot and Tr EMBL、 PDB（Protein Data Bank）、Uniprot Universal Protein Resource、mi RBase、PMRD、OWL Composite Protein Sequence Database、TRANSFAC、TIGERFAMS、db EST c DNA Fragments 等。micro RNA 及其靶基因计算机预测的相关程序有 NCBI Blast、EMBOSS 、 Ex PASy tools 、 Bioedit 、 Mi RAlign 、 mi RFinder、mi RScan、Target Scanhuman、Mfold、Vienna RNAfold、RNAstructure、RNAfold、RNAhybrid等。另一方面，研究者们将计算机方法与实验方法有机结合起来，在二者的结果序列中寻找契合的以证明预测结果的准确性，或者从预测结果中挑出部分进行克隆验证。现在，更多的研究者把目光投向于那些有着特异性调控功能的micro RNA，专注于深入挖掘其作用机制及影响因子，从而试图寻找到能改善动植物生长发育及治疗人类疾病的良方。micro RNA 研究已经与免疫学、心脏病学、肿瘤学、植物学等学科紧密联系在一起了。现在，仍然可以这样形容， micro RNA世界发展的速度之快，几乎连遗传学的雷达也无法监测到。 三 Micro RNA 的生物合成
micro RNA 首先由 RNA 聚合酶Ⅱ转录成为长度为几百到几千个核苷酸的micro RNA 初始转录物（pri-micro RNA）。大多数 micro RNA 在染色体上与之前注释的编码蛋白质序列不同的区域上转录。一些 micro RNA 编码位点与其他micro RNA 较远，可能说明了它们拥有了自己的转录元件；其他一些成群存在且拥有相似的表达模式，揭示了它们被转录为多顺反子转录本。在哺乳动物的已知 micro RNA 中，大约一半在蛋白质编码基因的内含子区域，或者在非编码 RNA的内含子或外显子区域，而不是在它们独特的转录元件。内含子 micro RNAs 通常与它们的 m RNA 前体拥有一样的定位并同等表达，即它们共享单一的初始转录本。很少 micro RNA 存在于蛋白质编码 m RNA 的非翻译区，似乎这些转录本能通过单一m RNA 产生 micro RNA 或者蛋白质。
虽然动植物 micro RNA 生物合成的第一步都是由 RNA 聚合酶Ⅱ转录，且都包含 micro RNA 前体转录、micro RNA 加工和 micro RNA 输出三个主要步骤，但二者之间还是存在差异的。深入了解 micro RNA 的生物合成过程，有助于更好研究其在生物体生物发育及胁迫响应等方面发挥作用的机制，从而更好地利用micro RNA 造福生命。动物 micro RNA 的生物合成过程已经研究得比较清楚。
成熟 micro RNA 形成的每一步都会被 RNase Ⅲ家族的核酸内切酶及双链 RNA 结合域（ds RBD）蛋白共同催化。 首先，micro RNA 由 RNA 聚合酶Ⅱ转录为 pri-micro RNA，然后 pri-micro RNA在细胞核内被 RNase Ⅲ家族的 Drosha 加工释放出大约 70nt 的 micro RNA 前体（pre-micro RNA）。 Drosha 对 pri-micro RNA 加工的有效性取决于如下因素：茎环结构末端不少于 10nt 的终止环；比 pre-micro RNA 的茎区（略多于两个螺旋）还多一个螺旋茎区；能在 pre-micro RNA 基础上延伸的 3’和 5’单链。Drosha对 pri-micro RNA 精确有效的加工需要 ds RBD 蛋白的参与。形成的 pre-micro RNA含有 5’磷酸和 3’羟基末端，且在 3’端有 2-3nt 的突出末端，这些都是 RNase Ⅲ家族剪接双链 RNA 的特征。Drosha 剪接确立了成熟 micro RNA 在 pre-micro RNA的位置（3’或者 5’端）。
四 结论与展望
micro RNA 是一类广泛存在于真核生物中调控基因表达的单链非编码小分子RNA。首个 micro RNA（lin-4）是关于线虫的，于 1993 年由 Victor Ambros 的实验室研究发现。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。
参考文献
[1]岑俊威，曾骏成，周宇.miRNA-126與消化系统疾病关系的研究进展[J].新医学，2015（10）.
[2]管刚云，曾四平.miRNA-129与肿瘤研究进展[J].临床合理用药杂志，2015（32）.
[3]李琪儿，叶国良，郭俊明.lncRNA：肿瘤分子诊断中的一颗新星[J].中国生物化学与分子生物学报，2014（03）.
[4]夏海滨，李星.miRNA在肿瘤发生、诊断及治疗中的研究进展[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2013（05）.
[5]陈勇，徐兴祥，陈龙邦.靶向miRNA的肿瘤干细胞治疗策略[J].肿瘤，2013（01）.
[6]薛逸荃，曹雪涛.RNA异常与肿瘤调控研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013（01）.
[7]王建军，汤立军.miRNA在白血病中的研究进展[J].生命科学研究，2011（05）.
关键词：micro RNAs； 生物合成； 分子遗传学
引言
RNA 组学是遗传学的一门新兴分支学科，主要研究细胞内非编码核糖核酸的结构、功能及加工过程。而 micro RNA 组学是 RNA 组学的一个分支，主要研究小分子 RNA 调节子的生物合成过程与机制，以及它们在生长发育、分化、细胞增殖、细胞凋亡、染色体分离和代谢等过程中所发挥的作用。自 Rosalind C. Lee 等 1993 年在秀丽隐杆线虫中发现首个 micro RNA 以来，已先后在植物、动物、病毒等中发现了数以千计的 micro RNAs，micro RNA 的研究也已成为热点之一。目前识别 micro RNA 的方法主要有实验方法（遗传筛选、直接克隆）和生物信息学方法。由于 micro RNA 在某些真核生物中表达丰度较低，而且其表达受组织和时序特异性限制，用实验方法直接发现新的 micro RNA 有时存在很大困难。而基于 micro RNA 高度保守性的生物信息学方法则可以避免这种问题，从而成为了当前发现和鉴定 micro RNA 的一个重要手段。生物信息学方法通过计算机手段对生物学数据进行分析和处理，从而在各种生物已有的基因序列库中寻找未知 micro RNA 及其靶基因，大大提高了人们发现 micro RNA 的效率。
一 micro RNA发现及其研究历程
1993 年，哈佛大学的 Rosalind C. Lee 及他的同事们在线虫鉴定出第一个非编码的 micro RNA 序列。几乎与此同时，Bruce Wightman 等人证明了 lin-14是首个 micro RNA 的靶基因。这两个重大发现共同确认了一种新的转录后基因调节机制。但是直到 RNA 干扰技术的发现和 2000 年第二个 micro RNA——let-7的鉴定，micro RNA 研究才飞速发展起来了。let-7 的高度保守性吸引了众多目光，此后，研究者们先后在多种生物（从原生动物到人类）中发现了 micro RNA的存在。人们对于 micro RNA 的多样性、进化、生物合成、表达、功能及分子机制的研究也取得了显著的进展。这种小分子 RNA 可以调控几乎所有重要的生命活动，如基因转录及转录后加工、细胞分化及凋亡、个体发育、遗传及表观遗传等。目前已经发现一些 micro RNA 与许多复杂疾病有关，其变异可能导致细胞发育异常或癌变。这些重大发现引起了全世界的关注，micro RNA 的鉴定及功能分析已经成为生命科学研究的热点与前沿问题。
2002 年，美国《科学》杂志评选的年度十大科技突破中，micro RNA 的发现名列榜首。自 1993 年首个 micro RNA 和 2000 年第二個 micro RNA 的发现以来，真正专注于 micro RNA 的研究才进行了十多年，但这种小分子已经不断给我们带来惊喜。micro RNA 似乎无处不在，参与调节各种各样的生物反应及几乎所有的生物学过程，例如细胞生命周期调控、形态发生、分化、胁迫等。关于 micro RNA各方面的研究正在全球各地的研究机构中如火如荼地开展着，越来越多的研究发现揭示了其在生物中多样而显著的作用，而且 micro RNA 研究也已经越来越多与已有的生命科学、化学手段等结合起来。在分子及基因层面对 micro RNA 的研究也很好的解释了很多宏观层面的问题，例如花周期变化、肿瘤细胞增殖等。采用经典遗传学方法确定首个 micro RNA 及其功能后不久，Lagos-Quintana M.等通过实验方法发现了大量 micro RNAs。但是实验方法常常受限于 micro RNA 表达的低通量及不确定性，要清楚地阐释 micro RNA 的功能仍存在困难，对于那些组织特异性强的 micro RNA 更是如此。有人认为高通量的 micro RNA 实验鉴定方法能很好解决问题，可是这样的方法并不存在。因此，计算机方法应运而生。近十多年来，micro RNA 相关的信息呈现出了爆炸似的增长，如基因形式、生物合成、作用机制、调控功能等。要想有效查询和利用这些信息，计算方法已必不可少。
二 micro RNA计算方法及其应用进展
最初鉴定 micro RNA 的计算方法出现于 2003 年，用于线虫和果蝇。此后，很快出现了可运用于植物、人类及其他生物的计算机方法。相应地，最初的靶基因预测程序发表于 2003 年年底到 2004 年年初，主要是预测人类及果蝇的micro RNA 靶基因。目前，预测动物、植物 micro RNA 靶基因的预测算法都已有公布，并供公开使用，大大促进了计算机预测方法的发展。研究者们通过计算机方法已在人类、老鼠、牛、果蝇、线虫、拟南芥、水稻、小麦、玉米、大豆等生物中获得了大量可能的 micro RNA 及其靶基因，部分已经通过实验验证。这些都给了 micro RNA 研究者极大的信心，因为不只是获得了序列，许多 micro RNA都已被证明与动植物生长发育、胁迫响应、新陈代谢、信号转导及人类肿瘤、癌症等多种疾病相关。
micro RNA 的计算机方法通常都是 micro RNA 预测与靶标预测相结合，以某生物的全基因组数据库或者 EST、GSS 等数据库作基础，与已公布的 micro RNA 做BLAST 比较，然后再进行严格筛选，以作靶标预测，最后再做功能分析。目前主要的生物学数据库包括 NCBI Gen Bank、EMBL、Swiss-Prot and Tr EMBL、 PDB（Protein Data Bank）、Uniprot Universal Protein Resource、mi RBase、PMRD、OWL Composite Protein Sequence Database、TRANSFAC、TIGERFAMS、db EST c DNA Fragments 等。micro RNA 及其靶基因计算机预测的相关程序有 NCBI Blast、EMBOSS 、 Ex PASy tools 、 Bioedit 、 Mi RAlign 、 mi RFinder、mi RScan、Target Scanhuman、Mfold、Vienna RNAfold、RNAstructure、RNAfold、RNAhybrid等。另一方面，研究者们将计算机方法与实验方法有机结合起来，在二者的结果序列中寻找契合的以证明预测结果的准确性，或者从预测结果中挑出部分进行克隆验证。现在，更多的研究者把目光投向于那些有着特异性调控功能的micro RNA，专注于深入挖掘其作用机制及影响因子，从而试图寻找到能改善动植物生长发育及治疗人类疾病的良方。micro RNA 研究已经与免疫学、心脏病学、肿瘤学、植物学等学科紧密联系在一起了。现在，仍然可以这样形容， micro RNA世界发展的速度之快，几乎连遗传学的雷达也无法监测到。 三 Micro RNA 的生物合成
micro RNA 首先由 RNA 聚合酶Ⅱ转录成为长度为几百到几千个核苷酸的micro RNA 初始转录物（pri-micro RNA）。大多数 micro RNA 在染色体上与之前注释的编码蛋白质序列不同的区域上转录。一些 micro RNA 编码位点与其他micro RNA 较远，可能说明了它们拥有了自己的转录元件；其他一些成群存在且拥有相似的表达模式，揭示了它们被转录为多顺反子转录本。在哺乳动物的已知 micro RNA 中，大约一半在蛋白质编码基因的内含子区域，或者在非编码 RNA的内含子或外显子区域，而不是在它们独特的转录元件。内含子 micro RNAs 通常与它们的 m RNA 前体拥有一样的定位并同等表达，即它们共享单一的初始转录本。很少 micro RNA 存在于蛋白质编码 m RNA 的非翻译区，似乎这些转录本能通过单一m RNA 产生 micro RNA 或者蛋白质。
虽然动植物 micro RNA 生物合成的第一步都是由 RNA 聚合酶Ⅱ转录，且都包含 micro RNA 前体转录、micro RNA 加工和 micro RNA 输出三个主要步骤，但二者之间还是存在差异的。深入了解 micro RNA 的生物合成过程，有助于更好研究其在生物体生物发育及胁迫响应等方面发挥作用的机制，从而更好地利用micro RNA 造福生命。动物 micro RNA 的生物合成过程已经研究得比较清楚。
成熟 micro RNA 形成的每一步都会被 RNase Ⅲ家族的核酸内切酶及双链 RNA 结合域（ds RBD）蛋白共同催化。 首先，micro RNA 由 RNA 聚合酶Ⅱ转录为 pri-micro RNA，然后 pri-micro RNA在细胞核内被 RNase Ⅲ家族的 Drosha 加工释放出大约 70nt 的 micro RNA 前体（pre-micro RNA）。 Drosha 对 pri-micro RNA 加工的有效性取决于如下因素：茎环结构末端不少于 10nt 的终止环；比 pre-micro RNA 的茎区（略多于两个螺旋）还多一个螺旋茎区；能在 pre-micro RNA 基础上延伸的 3’和 5’单链。Drosha对 pri-micro RNA 精确有效的加工需要 ds RBD 蛋白的参与。形成的 pre-micro RNA含有 5’磷酸和 3’羟基末端，且在 3’端有 2-3nt 的突出末端，这些都是 RNase Ⅲ家族剪接双链 RNA 的特征。Drosha 剪接确立了成熟 micro RNA 在 pre-micro RNA的位置（3’或者 5’端）。
四 结论与展望
micro RNA 是一类广泛存在于真核生物中调控基因表达的单链非编码小分子RNA。首个 micro RNA（lin-4）是关于线虫的，于 1993 年由 Victor Ambros 的实验室研究发现。miRNA在细胞分化，生物发育及疾病发生发展过程中发挥巨大作用，越来越多的引起研究人员的关注。随着对于miRNA作用机理的进一步的深入研究，以及利用最新的例如miRNA芯片等高通量的技术手段对于miRNA和疾病之间的关系进行研究，将会使人们对于高等真核生物基因表达调控的网络理解提高到一个新的水平。这也将使miRNA可能成为疾病诊断的新的生物学标记，还可能使得这一分子成为药靶，或是模拟这一分子进行新药研发，这将可能会给人类疾病的治疗提供一种新的手段。
参考文献
[1]岑俊威，曾骏成，周宇.miRNA-126與消化系统疾病关系的研究进展[J].新医学，2015（10）.
[2]管刚云，曾四平.miRNA-129与肿瘤研究进展[J].临床合理用药杂志，2015（32）.
[3]李琪儿，叶国良，郭俊明.lncRNA：肿瘤分子诊断中的一颗新星[J].中国生物化学与分子生物学报，2014（03）.
[4]夏海滨，李星.miRNA在肿瘤发生、诊断及治疗中的研究进展[J].陕西师范大学学报（自然科学版），2013（05）.
[5]陈勇，徐兴祥，陈龙邦.靶向miRNA的肿瘤干细胞治疗策略[J].肿瘤，2013（01）.
[6]薛逸荃，曹雪涛.RNA异常与肿瘤调控研究进展[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2013（01）.
[7]王建军，汤立军.miRNA在白血病中的研究进展[J].生命科学研究，2011（05）.