【摘 要】
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近年来,CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中.由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM(protospacer adjacent motif)位点NGG的限制,因此理论上CRISPR-Cas9系统可以编辑基因组中任何含NGG的位点或基因,但研究发现该系统对影响微生物生长及代谢的关键靶基因改造时会出现效率降低,甚至是无法获得突变株的现象.前期已有大量研究报道了降低CR
【机 构】
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中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室,北京 100193
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近年来,CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)基因编辑系统已经成功应用于多种微生物中.由于CRISPR-Cas9系统仅受PAM(protospacer adjacent motif)位点NGG的限制,因此理论上CRISPR-Cas9系统可以编辑基因组中任何含NGG的位点或基因,但研究发现该系统对影响微生物生长及代谢的关键靶基因改造时会出现效率降低,甚至是无法获得突变株的现象.前期已有大量研究报道了降低CRISPR-Cas9系统脱靶效应的策略,但依然未能有效解决编辑效率降低的问题.因此,本研究通过使用不同拷贝数的质粒调节Cas9、gRNA的表达和同源臂浓度使其协同发挥基因编辑功能,建立了更加高效的双质粒CRISPR-Cas9系统.试验结果表明,该系统对大肠杆菌pfkA(6-phosphofructokinase isozyme 1)、pfkB(6-phosphofructokinase isozyme 2)、zwf(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)单基因敲除最高效率达到100％;在nagABE基因簇位点通过替换引入甘油激酶基因glpK(glycerol kinase)的效率为10％.相比于单质粒CRISPR-Cas9系统,优化的双质粒系统成功进行了pfkB基因的敲除及glpK基因的整合,且将pfkA、zwf基因的敲除效率分别提升了31％和63％.突变株与野生株之间碳源代谢的差异进一步表明基因敲除效率与基因特殊活性相关.结果证明,过量的靶基因同源臂和gRNA的过表达可以有效提升CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的编辑效率.
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