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【摘要】目的 探讨胆汁中胆汁纳米细菌的培养与鉴定。方法 对40例胆结石患者胆汁标本进行了纳米细菌培养，观察生长情况。结果40例胆结石患者胆汁标本纳米细菌培养为阳性。扫描电镜能谱分析显示，纳米细菌外壳含有钙、磷和镁等元素，其钙/磷比值为1.60。结论 胆囊结石患者胆汁中存在纳米细菌感染。钙染色对纳米细菌的鉴定有重要参考价值。
【关键词】胆汁；纳米；细菌；培养；鉴定
【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）10-0294-02
纳米细菌是在胎牛的血清中发现的一种直径在80-500nm的特殊生物微粒。纳米细菌广泛存在于生物体和矿物质中，是一种会感染人和动物的致病原。相关的学者已经在国内部分人的血清中发现了纳米细菌，并且发现其的感染与年龄有关系。
1对象与方法
1.1 对象
选取了本医院中手术前无急性胆囊炎发作病史，本次住院未进行抗菌治疗，并且拟结束腹腔镜胆囊切除的胆囊结石患者40例，男的24例，女16例，年龄在38-65岁之间。
手术前将患者的胆汁标本统一留取。术中由腹腔中完整取出胆囊后，立即用无菌注射器穿刺胆囊，无菌操作抽取胆汁5ml。
1.2主要试剂
高糖DMEM培养基，GIBCO公司，美国； 射线照射过的胎牛血清（ -FBS），中美合资兰州民海生物工程有限公司，中国；鼠抗纳米细菌单克隆抗体，Nanobac OY公司，芬兰；FTTC 标记荧光抗体，Dako Cytomation公司，丹麦。
1.3方法
1.3.1 纳米细菌培养
将胆汁样本通过一次性输液器滤膜过滤2次后，依次经0.45 m和0.22 m一次性正压滤器过滤，将滤液0.1ml注入含DMEM培养液、10% -FBS和1%HEPES缓冲液的细胞培养瓶中， 37℃、5%CO2条件下培养。以生理盐水替代胆汁重复上述操作作为阴性对照。每周于倒置显微镜下观察其生长情况并记录。
1.3.2纳米细菌的鉴定
间接免疫荧光染色：取含纳米细菌的培养液16000rpm离心45分钟，PBS洗涤沉淀，弃上清，加入无水乙醇职称悬液，将该悬液滴置洁净载玻片上自然晾干后置入95%乙醇和乙醚混合液（1：1）中固定15分钟，制成纳米细菌滴片，之后首先用含10%FBS（经培养证实不含纳米细菌）的PBS封闭20分钟，一抗（100mg/l）室温孵育60分钟，PBS洗涤5分钟持续4次，二抗室温孵育45分钟，PBS洗涤5分钟持续4次，双蒸水洗涤1分钟，50%甘油封片，置于荧光显微镜下观察，以PBS代替8D10抗体作阴性对照。
纳米细菌钙染色：制纳米细菌滴片方法同上，滴加1%硝酸银溶液覆盖滴片，紫外线照射45分钟。蒸馏水充分冲洗，滴加3%硫代硫酸钠溶液覆盖滴片，反应5分钟.蒸馏水充分冲洗后于普通光学显微镜观察染色结果。
透射电镜观察：吸取含纳米细菌的培养液，16000rpm离心45分钟，用PBS洗涤沉淀，2.5%戊二醛4℃固定24小时，双蒸水洗涤5分钟，持续三次，离心后加入0.5ml双蒸水制成混悬液。进行负染色时，将附有碳支持膜的200目铜网浮于上述悬液的液滴上5分钟，用滤纸小心吸除液體，置于10ml/L磷钨酸悬液的液滴上90秒，用滤纸小心吸除液体、晾干，在H-7650透射电镜下观察，工作电压80kV。
纳米细菌超薄切片观察：吸取含纳米细菌的培养液同上，戊二醛4℃固定4小时，PBS冲洗，15分钟，持续2次。1%四氧化锇4℃固定2小时。50%、70%、90%丙酮脱水，每梯度15分钟。100%丙酮脱水2次，每次15分钟。丙酮和环氧树脂一样的数量浸透2小时，纯环氧树脂浸透2h。37℃-40℃条件下入胶囊浸透6-12h，60℃聚合24小时。用钻石刀将纳米细菌样本切成超薄切片，5%醋酸铀染色5分钟，双蒸水洗3分钟 3次，构椽酸铅染色5分钟，双蒸水充分洗涤后干燥。在H-7650透射电镜下观察。
纳米细菌能谱分析：吸取含纳米细菌的培养液同上，用2.5%戊二醛4℃固定4小时，双蒸水洗涤，加入0.5ml无水乙醇制成混悬液。在配有VANTAGE BSI型能谱仪的国产KYKY2800型扫描电镜上，对其进行能谱分析，工作电压200KV。
2 结果
2.1 胆汁纳米细菌培养
40份胆汁标本纳米细菌培养都是阳性。在37℃和5%CO2的细菌培养条件下培养14天，于倒置相差显微镜下可观察到做不规则布朗运动的细微颗粒状物。这些细微颗粒的体积会随着时间的推移慢慢变大，不断增多数量，积聚成团，并逐渐贴附于培养瓶底部，形成细菌集落。在第四周时，会看到更多的白色细菌颗粒集贴附在培养瓶底部。镜下观察阴性对照培养液，未见纳米细菌生长。
2.2 胆汁纳米细菌的坚定
间接免疫荧光染色。纳米细菌与8DI0抗体产生特异性结合。阴性对照为观察到绿色荧光。
普通光镜下观察，纳米细菌的矿化外壳被硝酸银染成黑色，视野中布满了黑色小颗粒。
纳米细菌经负染后于透射电镜下观察，其外形呈球形或短棒状颗粒，大小约为80～350mm。超薄透片透射电镜观察，纳米细菌中心电子密度较低，而周围被厚厚的呈黑色电子密度较高的矿化外壳包绕。纳米细菌在37℃恒温、潮湿、5%CO2环境中，可以进行缓慢的分裂增殖。新生成的纳米细菌为50～200nm。
纳米细菌能谱分析显示，纳米细菌含有钙，磷，镁，铝等元素，其钙磷比值是1.62。
3 讨论
纳米细菌不能用传统的微生物理论看，因为体形微小，很难用一般的细菌学检测方法检出，而且侵入生物体内的纳米细菌具有独特的生物矿化作用，很难被彻底清除，所以，纳米细菌一直是医学界的热点问题。
我们对选取的40位患者，在无菌、厌氧条件下留取胆囊结石患者的胆囊胆汁，进行纳米细菌培养。
正常胆汁中存在大量的黏蛋白以及胆砂、胆固醇结晶等多种有形成分，这些成分给胆汁中分离纳米细菌造成麻烦。所以，应该探寻从复杂的胆汁中迅速提取纳米细菌的方法。
本研究显示，在胆囊结石患者的胆汁中确实存在纳米细菌，由人胆汁中培养出的纳米细菌极其微小，在普通光学显微镜下几乎无法观测，但在相差显微镜下却可以比较容易的观测到，而对其细微结构的观察则只能通过分辨率更高的电子显微镜才能实现。
参考文献：
[1]Hjelle JT ，Marcia A Miller-Hjelle MA.Endotoxin and nanobacteria in polycustic disease[J].Kidney Int，2000，57：2360.
[2]Kajander EO.Nanobacteria-propagating calcifying nanoparticles[J].Letters in Applier Microbiology，2006，42：549.
【关键词】胆汁；纳米；细菌；培养；鉴定
【中图分类号】R-1 【文献标识码】B 【文章编号】1671-8801（2014）10-0294-02
纳米细菌是在胎牛的血清中发现的一种直径在80-500nm的特殊生物微粒。纳米细菌广泛存在于生物体和矿物质中，是一种会感染人和动物的致病原。相关的学者已经在国内部分人的血清中发现了纳米细菌，并且发现其的感染与年龄有关系。
1对象与方法
1.1 对象
选取了本医院中手术前无急性胆囊炎发作病史，本次住院未进行抗菌治疗，并且拟结束腹腔镜胆囊切除的胆囊结石患者40例，男的24例，女16例，年龄在38-65岁之间。
手术前将患者的胆汁标本统一留取。术中由腹腔中完整取出胆囊后，立即用无菌注射器穿刺胆囊，无菌操作抽取胆汁5ml。
1.2主要试剂
高糖DMEM培养基，GIBCO公司，美国； 射线照射过的胎牛血清（ -FBS），中美合资兰州民海生物工程有限公司，中国；鼠抗纳米细菌单克隆抗体，Nanobac OY公司，芬兰；FTTC 标记荧光抗体，Dako Cytomation公司，丹麦。
1.3方法
1.3.1 纳米细菌培养
将胆汁样本通过一次性输液器滤膜过滤2次后，依次经0.45 m和0.22 m一次性正压滤器过滤，将滤液0.1ml注入含DMEM培养液、10% -FBS和1%HEPES缓冲液的细胞培养瓶中， 37℃、5%CO2条件下培养。以生理盐水替代胆汁重复上述操作作为阴性对照。每周于倒置显微镜下观察其生长情况并记录。
1.3.2纳米细菌的鉴定
间接免疫荧光染色：取含纳米细菌的培养液16000rpm离心45分钟，PBS洗涤沉淀，弃上清，加入无水乙醇职称悬液，将该悬液滴置洁净载玻片上自然晾干后置入95%乙醇和乙醚混合液（1：1）中固定15分钟，制成纳米细菌滴片，之后首先用含10%FBS（经培养证实不含纳米细菌）的PBS封闭20分钟，一抗（100mg/l）室温孵育60分钟，PBS洗涤5分钟持续4次，二抗室温孵育45分钟，PBS洗涤5分钟持续4次，双蒸水洗涤1分钟，50%甘油封片，置于荧光显微镜下观察，以PBS代替8D10抗体作阴性对照。
纳米细菌钙染色：制纳米细菌滴片方法同上，滴加1%硝酸银溶液覆盖滴片，紫外线照射45分钟。蒸馏水充分冲洗，滴加3%硫代硫酸钠溶液覆盖滴片，反应5分钟.蒸馏水充分冲洗后于普通光学显微镜观察染色结果。
透射电镜观察：吸取含纳米细菌的培养液，16000rpm离心45分钟，用PBS洗涤沉淀，2.5%戊二醛4℃固定24小时，双蒸水洗涤5分钟，持续三次，离心后加入0.5ml双蒸水制成混悬液。进行负染色时，将附有碳支持膜的200目铜网浮于上述悬液的液滴上5分钟，用滤纸小心吸除液體，置于10ml/L磷钨酸悬液的液滴上90秒，用滤纸小心吸除液体、晾干，在H-7650透射电镜下观察，工作电压80kV。
纳米细菌超薄切片观察：吸取含纳米细菌的培养液同上，戊二醛4℃固定4小时，PBS冲洗，15分钟，持续2次。1%四氧化锇4℃固定2小时。50%、70%、90%丙酮脱水，每梯度15分钟。100%丙酮脱水2次，每次15分钟。丙酮和环氧树脂一样的数量浸透2小时，纯环氧树脂浸透2h。37℃-40℃条件下入胶囊浸透6-12h，60℃聚合24小时。用钻石刀将纳米细菌样本切成超薄切片，5%醋酸铀染色5分钟，双蒸水洗3分钟 3次，构椽酸铅染色5分钟，双蒸水充分洗涤后干燥。在H-7650透射电镜下观察。
纳米细菌能谱分析：吸取含纳米细菌的培养液同上，用2.5%戊二醛4℃固定4小时，双蒸水洗涤，加入0.5ml无水乙醇制成混悬液。在配有VANTAGE BSI型能谱仪的国产KYKY2800型扫描电镜上，对其进行能谱分析，工作电压200KV。
2 结果
2.1 胆汁纳米细菌培养
40份胆汁标本纳米细菌培养都是阳性。在37℃和5%CO2的细菌培养条件下培养14天，于倒置相差显微镜下可观察到做不规则布朗运动的细微颗粒状物。这些细微颗粒的体积会随着时间的推移慢慢变大，不断增多数量，积聚成团，并逐渐贴附于培养瓶底部，形成细菌集落。在第四周时，会看到更多的白色细菌颗粒集贴附在培养瓶底部。镜下观察阴性对照培养液，未见纳米细菌生长。
2.2 胆汁纳米细菌的坚定
间接免疫荧光染色。纳米细菌与8DI0抗体产生特异性结合。阴性对照为观察到绿色荧光。
普通光镜下观察，纳米细菌的矿化外壳被硝酸银染成黑色，视野中布满了黑色小颗粒。
纳米细菌经负染后于透射电镜下观察，其外形呈球形或短棒状颗粒，大小约为80～350mm。超薄透片透射电镜观察，纳米细菌中心电子密度较低，而周围被厚厚的呈黑色电子密度较高的矿化外壳包绕。纳米细菌在37℃恒温、潮湿、5%CO2环境中，可以进行缓慢的分裂增殖。新生成的纳米细菌为50～200nm。
纳米细菌能谱分析显示，纳米细菌含有钙，磷，镁，铝等元素，其钙磷比值是1.62。
3 讨论
纳米细菌不能用传统的微生物理论看，因为体形微小，很难用一般的细菌学检测方法检出，而且侵入生物体内的纳米细菌具有独特的生物矿化作用，很难被彻底清除，所以，纳米细菌一直是医学界的热点问题。
我们对选取的40位患者，在无菌、厌氧条件下留取胆囊结石患者的胆囊胆汁，进行纳米细菌培养。
正常胆汁中存在大量的黏蛋白以及胆砂、胆固醇结晶等多种有形成分，这些成分给胆汁中分离纳米细菌造成麻烦。所以，应该探寻从复杂的胆汁中迅速提取纳米细菌的方法。
本研究显示，在胆囊结石患者的胆汁中确实存在纳米细菌，由人胆汁中培养出的纳米细菌极其微小，在普通光学显微镜下几乎无法观测，但在相差显微镜下却可以比较容易的观测到，而对其细微结构的观察则只能通过分辨率更高的电子显微镜才能实现。
参考文献：
[1]Hjelle JT ，Marcia A Miller-Hjelle MA.Endotoxin and nanobacteria in polycustic disease[J].Kidney Int，2000，57：2360.
[2]Kajander EO.Nanobacteria-propagating calcifying nanoparticles[J].Letters in Applier Microbiology，2006，42：549.