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摘要 利用作物杂种优势生产杂交种的主要授粉控制系统是细胞质雄性不育及其恢复系统。在杂交品种的选育过程中，优良恢复系的准确选育至关重要。 主要综述了棉花细胞质雄性不育种质及恢复系的利用、遗传方式、生理生化研究，育性恢复基因的遗传定位，棉花细胞质雄性不育及其育性恢复的分子生物学研究，以及棉花育性恢复基因的克隆和PPR基因家族的研究进展。
关键词 棉花；育性恢复基因；遗传定位；PPR基因
中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-001-03
Research Progress on Cotton Cytoplasmic Male Sterility （CMS） and Fertility Restoring Genes
LIU Licai， XING Chaozhu*， WU Jianyong et al
（Institute of Cotton Research of CAAS/State Key Laboratory of Cotton Biology， Anyang， Henan 455000）
Abstract Cytoplasmic male sterility （CMS） and fertility restorer system is the main pollination control system in cotton heterosis usage. In the process of the breeding of hybrids， it is very important to select excellent restorer lines accurately. This article mainly reviewed the usage， the genetics， the physiological and biochemical studies of cotton CMS germplasm and restorer lines； Genetic mapping of fertility restoring genes； The molecular biology study on the cotton CMS and fertility restoration； As well as the cloning of cotton fertility restoration gene and the research progress of PPR gene families.
Key words Cotton； Fertility restoration gene； Genetic mapping； PPR gene
作者简介 刘利彩（1988- ），女，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向：棉花育性恢复基因。*通讯作者，研究员，博士，从事棉花杂种优势研究。
收稿日期 20141225
植物CMS是指植物不能产生正常花粉或只产生没有活力的花粉，导致雄蕊不能正常授粉而雄蕊功能正常的一种母性遗传现象。这种现象广泛存在于高等植物中[1]。由于CMS育性能被恢复基因RF所恢复，是植物杂种优势利用的主要授粉控制系统。它已在水稻、油菜和玉米等主要作物杂交种选育中得到广泛的利用[2]。
棉花具有十分明显的杂种优势，而CMS育性在棉花杂交优势利用中还没有大量应用。
这是因为在棉花中，有应用价值的雄性不育类型很少。由于雄性不育在杂种优势中的利用存在2个问题：一是核基因控制的不育系，其不育不易保持，即尚未找到真正意义上的完全保持系，制种时需要拔除50%的可育植株；二是质核互作的细胞质雄性不育系的恢复系恢复力不够强，导致大量棉铃脱落，并且带有不良性状[3-4]。开展哈克尼西棉细胞质雄性不育育性恢复基因遗传和定位研究，将为分子标记辅助选育优良恢复系和分子检测鉴定“三系”及其杂交种纯度服务，也为进一步研究核质互作的作用机理、克隆恢复基因打下基础。
1 棉花细胞质雄性不育系和恢复系的理论研究
1.1 棉花细胞质雄性不育系及恢复系的利用现状
美国是最早研究棉花CMS的国家。在20世纪60年代，Meyer[5]通过远缘杂交的方法首次实现三系配套。Weaver等[6-7]经过多年研究，发现哈克尼西棉不育胞质会影响棉花产量。但是，经过育种家长期的选育过程，不育胞质对产量的不良影响已消除。在实际生产中，有利用价值的雄性不育系胞质基础主要有哈克尼西棉D2、D8和三裂棉。
我国对棉花CMS的研究开始于20世纪70年代[8]，目前主要有4种类型的细胞质雄性不育系。仅哈克尼西棉、陆地棉、三裂棉胞质的不育系能够稳定表现出稳定的雄性不育特性，在杂交种生产上具有较高的利用价值。其中，陆地棉可以作为哈克尼西棉、陆地棉、三裂棉胞质不育系的保持系[9]。2002年王学德等[10]利用农杆菌介导法，筛选到一个强恢复系，被命名为“浙大强恢”。
国内外已成功选育多个棉花CMS三系配套的三系杂交种，但是三系杂交棉选育进程缓慢。一些专家将其原因归为：①棉花CMS胞质类型单一；②恢复基因来源狭窄；③缺乏简便高效的传粉媒介，三系杂交棉种子生产过程中省略了人工去雄环节，但是授粉程序仍要人工辅助完成；④恢复系的恢复能力受温度的影响。
1.2 棉花细胞质雄性不育育性恢复的遗传方式
在利用不育系进行三系杂交制种时，必须要有恢复系对其育性恢复。恢复系的强恢复能力是至关重要的。因而，近年来加强了对恢复基因的研究，以期创制性状良好、遗传稳定的强恢复系。
Meyer等[11]报道，育性恢复受2对独立遗传基因控制，其中一对是显性基因（F-），另一对是纯合隐性基因（ss）。Kohel等[6]研究则认为，哈克尼西棉CMS育性恢复仅受1对基因Rf控制，并首次发现了一个形态学标记基因Rc与Rf1连锁，重组率为14.0%。王学德等[12]则认为，不育系受2个独立遗传的显性基因Rf1和Rf2控制。2001年，Stewart等[13]研究认为，哈克尼西棉CMS系统受到1对独立显性基因（Rf2）控制，CMSD2Rf系统受到2对独立遗传的显性基因（Rf1，Rf2）控制。李朋波等[14]以晋A为研究材料，发现恢复基因是由一个显性基因控制的。曹秀霞[15]通过田间调查，统计了409株近等基因系群体单株和695株F2群体单株的育性分离情况，其中近等基因系中有223个可育株、186个不育株，F2群体中有502个可育株、193個不育株。经卡方检验，结果表明，近等基因系群体中的可育株与不育株分离比例符合1∶1，在F2群体中分离比例符合3∶1。这说明哈克尼西棉育性恢复基因的遗传是由1对显性基因（Rf1）控制的。冯纯大等[16]均认为不育系育性恢复受1对基因控制。 1.3 棉花细胞质雄性不育的细胞学及生理生化研究
棉花CMS基因的表达时期主要在造孢细胞增殖期和小孢子母细胞减数分裂期，表达部位主要集中在绒毡层细胞和小孢子母细胞。王学德等对国内6个胞质不育系以及哈克尼西棉胞质的败育过程进行细胞学研究，发现这7种不育系的败育原因大致分为2类：一是不育系的造胞细胞在增殖期败育，出现异常不能进行正常的有丝分裂，导致花粉败育；二是造孢细胞在增殖期没有异常，但在减数分裂期败育，而且所有不育系花药的绒毡层细胞停止分裂生长，常常高度液泡化。
裴文锋[17]通过对雄性不育系和保持系制作压片进行细胞学观察比较，发现可以确定哈克尼西棉胞质不育系的败育时期发生在减数分裂活动之前。裴文锋进一步对雄性不育系和保持系进行石蜡切片观察，发现初步判断花粉母细胞减数分裂的粗线期是在花蕾3.1～3.6 mm时期，而不育系花粉母细胞败育时期为粗线期之前，即判定败育的发生期为2～3.1 mm。
与可育花粉相比，不育花药的碳水化合物代谢变化有淀粉积累受阻，淀粉酶和同工酶缺失和酶活性降低，花药细胞中缺少淀粉粒，花药脂肪含量低，蛋白质含量偏低，不育花药中细胞色素氧化酶（COX）含量减少，活性降低。在棉花不育花药的发育过程中，活性氧的积累过程以及花药自身对其清除能力的降低是与小孢子母细胞死亡同步发生的。
2 细胞质雄性不育恢复基因的遗传定位
分子标记由于具有其他标记不可比拟的优越性而被广泛应用。目前在棉花细胞质雄性不育育性恢复基因研究中，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR、ESTSSR、STS、SCAR等。
Wang等[18]利用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR标记技术发现了3个RAPD标记和1个SSR标记，并且推测出Rf1和Rf2都定位在D亚染色体组的LGD08 连锁群（现命名为D5染色体）上。
曹秀霞[15]通过对构建的可育DNA池和不育DNA池进行多态性标记筛选。在8242对SSR引物中共发现13对SSR引物具有明显多态性，用这13对引物再分别对近等基因系群体和F2 群体单株进行扩增，并且分别构建Rf1遗传连锁图谱。通过比较连锁图谱和分析这些标记在棉花染色体上的位置，发现在研究中获得的13个对于Rf1具有连锁的SSR标记中，有7个标记位于第19染色体（又名D5染色体）上，进而推测，与这13个标记连锁的与性恢复基因Rf1可能位于第19染色体上。
大量CMS恢复基因的定位研究表明，恢复基因座极有可能是以复合形式出现的。下面是一些相关研究的文献证明。如，菜豆的恢复基因虽然拥有两套完全不同的恢复机制，但是基因定位于同一基因位点上[19]；水稻中的WA型、BT型以及HL型3种CMS恢复基因均定位于相同位点[20]；同样地，研究油菜育性恢复基因的学者发现油菜的nap和pol型2种CMS恢复基因也定位到同一个基因座上[21]的特殊现象，黑麦P型和G型CMS恢复基因与小麦T型不育恢复基因位于同一区域内。
3 棉花CMS育性恢复的分子机理研究
自20世纪80年代以来，随着分子生物学的发展以及植物基因组计划的推动，越来越多的研究者通过对植物CMS育性恢复基因的分子水平研究，将CMS相关位点定位于线粒体。
线粒体基因组的重排、突变都可能引起植物败育。在一些植物中已经鉴定出与雄性不育有关的DNA片段。关于这些片段导致植物CMS发生的过程有2种观点：一是毒害假说；二是能量假说。
马勇[22]对在哈克尼西棉细胞质不育系、保持系和恢复系间差异表达的256个基因进行AFLP扩增分析，最后对成功克隆、测序的85个差异表达序列片段序列进行Gene Ontology分析，发现这些差异性大片段主要参与能量代谢，防御，蛋白质合成及运输，信号转导，分子伴侣等。而这些序列表达的异常都可能与败育有关。
崔明晖[23]还利用RACE技术克隆不育系和保持系的atpA基因的cDNA全长，保持系序列可以编码498个氨基酸的蛋白质，而不育系序列可以编码492个氨基酸的蛋白质，序列比对相似性高达99.6%，推测其可能是由于个别碱基的突变或重组，导致编码蛋白差异，进而导致雄性不育性的发生。
裴文锋[17]以棉花细胞质雄性不育系和保持系不同发育时期的花蕾为材料，分析miR156和预测的靶基因TBCC（Tublin binding cofactor C）在花蕾中的表达水平、相互关系。结果表明，不育系和保持系花蕾中 miR156表达量随着花药发育进程而显著增加，TBCC在保持系中随着花药发育逐渐降低，而在不育系中该基因的表达水平一直维持在较低水平，推测不育性状可能与TBCC的表达有关。
已证明一些恢复基因可通过改变线粒体不育相关基因的表达，恢复花粉育性。恢复基因的具体作用表现为恢复基因可以影响线粒体CMS基因的转录本稳定性[24]，而且可以表现为组织专一性；恢复基因可以影响线粒体CMS基因的转录加工，影响CMS基因的表达。这是一种常见的Rf基因的作用形式。在玉米[25-26]、高粱[27]、水稻[28-29]细胞质雄性不育的研究中也发现了这种现象。
综上所述，对CMS恢复基因的作用方式可以分为2种。一是恢复基因抑制线粒体CMS基因的表达，二是恢复基因补偿线粒体基因功能的缺陷。要想进一步搞清楚恢复基因的分子本质及其具体的作用机制，就要科研工作者进行更深入地研究。
4 棉花育性恢复基因与PPR基因
4.1 棉花育性恢复基因的克隆
植物细胞质雄性不育育性恢复机理的研究，还要依赖Rf基因的克隆。基因克隆主要有正向遗传学途径和反向遗传学途径2条途径[30]。
克隆恢复基因是一项具有挑战性的工作。由于没有同源序列和蛋白序列的资料，常见的基因克隆策略难以应用；植物的育性恢复表型是通过恢复基因与胞質不育因子共同作用的结果，使得恢复基因的突变分析变得复杂化。到目前为止，已克隆的植物Rf基因有玉米的Rf2基因[30]、矮牵牛的Rf基因[30]、萝卜的Rfo和Rfk基因[31]以及水稻的Rf1基因[31]等。 Brown等[32-33]几乎同时克隆出Rfo基因。在目前已克隆的恢复基因中，除玉米Rf2编码乙醛脱氢酶外，矮牵牛Rfo、萝卜Rfo及水稻的Rfla和Rflb都编码的是由PPR基序串联组成的PPR蛋白。
Klein等[34]发现，高粱的育性恢复基因Rf1也编码PPR蛋白，被命名为PPR家族成员PPR13。PPR13是一个外显子的线粒体靶向蛋白。这个外显子包含一个14 PPR重复序列。该蛋白是E型PPR亚家族成员。
Zhang等[35]通过差异展示技术和反向Northern杂交分析等实验研究，证明磷酸核糖邻氨苯甲酸转移酶（PAT）参与色氨酸合成途径。它在花药中下调表达引起生长素减少，从而导致棉花雄性不育。
4.2 PPR基因家族的研究进展
PPR是由Small等[36]首先发现和命名的，由35个简并氨基酸为重复单位，串联排列组成一个家族。PPR基因家族在不同生物体内分布不同。PPR基因大量存在于植物中，而存在于动物中数目非常少。PPR基因家族是在植物中发现的最大的基因家族之一。拟南芥基因组中含有200个PPR和相关的TPR基因，其编码的蛋白质大部分是以细胞器为靶目标，它们的大多数被预测与线粒体和叶绿体功能相关。PPR基因的遗传学研究毫无疑问地证明了大多数蛋白参与细胞器中RNA的新陈代谢。除了参与RNA的剪接、翻译和翻译后加工、提高RNA稳定性，还参与RNA的编辑功能。
PPR基因家族在同一生物体内不同染色体上分布不同，如PPR基因在拟南芥中均匀地分布在5条染色体上，没有成簇的存在[37-38]。但是，在第1条染色体的长臂约1 M范围内，却出现19个PPR基因和几个可能的PPR拟基因[38]。这些成簇分布的PPR基因大多有相似的功能。最近发现，从矮牵牛（Pentunia）、萝卜（Radish）、水稻（Oryza sativa）中克隆的CMS恢復基因与和拟南芥这一区域的PPR基因有很高的同源性。
PPR蛋白家族在植物细胞器基因表达中扮演很多重要的角色。这一点是没有任何怀疑的。可是，重要的突出问题仍然存在。首先，PPR蛋白怎样通过这种特异性识别大量的RNA靶对象？PPR蛋白家族是最大的RNA结合家族，但还没有发现它的作用结构。用于PPR蛋白复合体与RNA配体结合的单一结构的发现将是一个大的进步。其次，大量陆生植物中PPR蛋白在细胞器基因表达方面，真的存在无与伦比的调控方式吗？或者它们仅仅是一个令人好奇的、历史偶发事件？合成生物学技术将要揭示这些方法中更精确的方法。
5 问题与展望
目前，棉花细胞质雄性不育育性恢复基因的研究还处于探索阶段，Rf基因的表达导致相应的线粒体CMS因子的表达降低，但是这个作用过程还不清楚。因此，今后可以从以下3个方面进行深入研究。第一，对育性恢复基因进行进一步的精细定位，为克隆育性恢复相关基因位点提供有利的条件。第二，要阐明Rf蛋白的作用模型，还需对它的功能进行更多详细的生化研究。拟南芥中缺少CMS，所以就排除这个模式生物的遗传研究。但是，大约鉴别20个Rf同源基因，就会为检测其他功能提供机会。拟南芥和芸薹属植物近属的序列数据将对了解Rf基因簇的进化起重要作用。来自其他植物的序列数据可能很快就会丰富起来，从而检测一个假设，就是单子叶和双子叶植物的Rf基因拥有共同的祖先。这一点明显不同于所有其他PPR基因。清楚了不同的Rf基因是有关联（都像是成簇出现）的这一点，就会促进一个新物种的比对和克隆，从而在育种进程中更好地利用CMS系。第三，对PPR基因的功能继续进行深入研究。为解析单个PPR蛋白的功能，在传统的研究中需寻找更多的突变体，而突变体的筛选和获得很不容易，因为许多突变体是致死的或表型上没有明显的差异。但是，随着不同生物基因组测序工作的完成和生物信息学的发展，将为PPR基因遗传和功能的深入研究提供一个便利的技术平台。
参考文献
[1] 程计华，李云昌.几种农作物细胞质雄性不育恢复基因的定位和分子标记研究进展[J].植物学通报，2006，23（6）：613-624.
[2] 王学德，潘家驹.棉花亲本遗传距离与杂种优势间的相关性研究[J].作物学报，1990，16（1）：32-38.
[3] 王学德.陆地棉品种间杂种一代的产量结构特点[J].中国棉花，1988，15（5）：8-9.
[4] 马小定，邢朝柱.棉花雄性不育研究和应用进展[J].棉花学报，2006，18（5）：309-314.
[5] MEYER V G.Male sterility from Gossypium harknessii[J].Heredity，1975，66：23-27.
[6] WEAVER J B，WEAVER JR JB.Inheritance of pollen fertility restoration in cytoplasmic malesterile upland cotton[J].Crop Sci，1977，17：497-499.
[7] MEYER V G.A study of reciprocal hybrids between upland cotton and experimental lines with cytoplasms from seven other species [J].Crop Sci，1993，3：439-442.
[8] 俞志华，王学德.棉花细胞质雄性不育的研究及改良[J].棉花学报，1999，11（5）：268-274.
[9] 肖松华，刘剑光，吴巧娟，等.棉花细胞质雄性不育与育性恢复的研究与利用[J].江西农业学报，2008，20（9）：8-15.
[10] 王学德，李悦有.细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育[J].中国农业科学，2002，35（2）：137-141. [11] SHEETZ R H，WEAVER JR BJ.Inheritance of a fertility enhancer factor from Pima cotton when transferred into upland cotton with Gossypium harknessii barandegee cytoplasm[J].Crop Sci，1980，20：272-275.
[12] 王学德，张天真，潘家驹.棉花细胞质雄性不育系育性恢复的遗传基础I：恢复基因及其遗传效应[J].中国农业科学，1996，9（5）：32-40.
[13] ZHANG J，STEWART J M.CMSD8 restoration in cotton is conditioned by one dominant gene [J].Crop Sci，2001，41：283-288.
[14] 李朋波，曹美莲，刘慧民，等.棉花晋A细胞质雄性不育恢复基因定位[J].西北植物学报，2007，27（10）：1937-1942.
[15] 曹秀霞.哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因SSR标记定位及利用[D].北京：中国农业科学院，2012.
[16] 冯纯大，张金发，刘金兰，等.棉花雄性不育性研究进展[J].棉花学报，1998，10（4）：169-177.
[17] 裴文锋.哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系花发育不同时期microRNA研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[18] WANG F，STEWART J M，ZHANG J.Molecular markers linked to the Rf2 fertility restorer gene in cotton[J].Genome，2007，50（9）：818-824.
[19] HE S，YU Z H，VALLEJOS C E，et al.Pollen fertility restoration by nuclear gene Fr in CMS common bean：an Fr linkage map and the mode of Fraction[J].Theor Appl Genet，1995，90：1056-1062.
[20] ZHUANG J Y，FAN Y Y，WU J L，et al.Localization of the restorer genes for WACMS in rice[J].Acta Genetica Sinica，2001，28（2）：129-134.
[21] LI X Q，JEAN M，LANDRY B S，et al.Restorergenes for different forms of brassica cytoplasmic male sterility map to a single nuclear locus that modifies transcripts of several mitochondrial genes[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）：10032-10037.
[22] 馬勇.哈克尼西棉细胞质雄性不育系、保持系及恢复系花粉发育差异基因表达分析[D].北京：中国农业科学院，2009.
[23] 崔明晖.棉花细胞质雄性不育相关基因分离及标记转化[D].北京：中国农业科学院，2010.
[24] 徐明良，杨金水.玉米T型胞质感病性及雄性不育的分子基础[J].遗传，1995，17（S1）：24-29.
[25] CUI X Q，WISE R P，SCHNABLE P S.The rf2 nuclear restorer gene of malesterile Tcytoplasm maize[J].Science，1996，272：1334-1336.
[26] KOIZUKA N，IMAI R，FUJIMOTO H，et al.Genetic characterization of a pentatricopeptide repeat protein gene，orf687 that restores fertility in the cytoplasmic malesterile Kosena radish[J].Plant J，2003，34：407-415.
[27] ZABALETA E，MOURAS A，HERNOULD M，et al.Transgenic malesterile plant induced by an unedited atp9 gene is restored to fertility by inhibiting its expression with antisense RNA[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：11259-11263.
[28] JANSKA H，MACKENZIE S.Unusual mitochondrial genome organization in cytoplasmic male sterile common bean and the nature of cytoplasmic reversion to fertility[J].Genetics，1993，135：869-879.
[29] CHASE C D.Expression of CMSunique and flanking mitochondrial DNA sequences in Phaseolus vulgaris L[J].Curr Genet，1994，25：245-251. [30] 杨光圣，傅廷栋，马朝芝，等.油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的筛选与遗传[J].中国农业科学，1996（29）：17-22.
[31] KOMORI T，OHTA S，MURAI N，et al.Mapbased cloning of a fertility restorer gene，Rf1，in rice（Oryza sativa L.）[J].Plant J，2004，37：315-325.
[32] BROWN G G，FORMANOVA N，JIN H，et al.The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats[J].Plant J，2003，35：262-272.
[33] DESLOIRE S，GHERBI H，LALOUI W，et al.Identification of the fertility restoratioin locus，Rfo，in radish，as a member of the pentatricopeptide repeat protein family[J].EMBO Rep，2003，4：588-594.
[34] KLEIN R R，KLEIN P E，MULLET J E，et al.Fertility restorer locus Rf1 of soghum（Soghum bicolor L.）encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in the colinear region of rice chromosome12[J].Theor Appl Genet，2005，111：994-1012.
[35] ZHANG J F，TURLEY R B，STEWART J M.Comparative analysis of gene expression between CMSD8 restored plants and normal nonrestoring fertile plants in cotton by differential display[J].Plant Cell Rep，2008，27：553-561.
[36] SMALL I D，PEETERS N.The PPR motifa TPRrelated motif prevalent in plant organellar proteins[J].Trends Biochem Sci，2000，25：46-47.
[37] AUBOURG S，BOUDET N，KREIS M，et al.In Arabidopsis thaliana，1%of the genome codes for a novel protein family unique to plants[J].Plant Mol Biol，2000，42：603-613.
[38] LURIN C，ANDRS C，AUBOURG S，et al.Genomewide analysis of Arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis[J].Plant Cell，16：2089-2103.
責任编辑 刘月娟 责任校对 李岩
关键词 棉花；育性恢复基因；遗传定位；PPR基因
中图分类号 S562 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2015）05-001-03
Research Progress on Cotton Cytoplasmic Male Sterility （CMS） and Fertility Restoring Genes
LIU Licai， XING Chaozhu*， WU Jianyong et al
（Institute of Cotton Research of CAAS/State Key Laboratory of Cotton Biology， Anyang， Henan 455000）
Abstract Cytoplasmic male sterility （CMS） and fertility restorer system is the main pollination control system in cotton heterosis usage. In the process of the breeding of hybrids， it is very important to select excellent restorer lines accurately. This article mainly reviewed the usage， the genetics， the physiological and biochemical studies of cotton CMS germplasm and restorer lines； Genetic mapping of fertility restoring genes； The molecular biology study on the cotton CMS and fertility restoration； As well as the cloning of cotton fertility restoration gene and the research progress of PPR gene families.
Key words Cotton； Fertility restoration gene； Genetic mapping； PPR gene
作者简介 刘利彩（1988- ），女，河南濮阳人，硕士研究生，研究方向：棉花育性恢复基因。*通讯作者，研究员，博士，从事棉花杂种优势研究。
收稿日期 20141225
植物CMS是指植物不能产生正常花粉或只产生没有活力的花粉，导致雄蕊不能正常授粉而雄蕊功能正常的一种母性遗传现象。这种现象广泛存在于高等植物中[1]。由于CMS育性能被恢复基因RF所恢复，是植物杂种优势利用的主要授粉控制系统。它已在水稻、油菜和玉米等主要作物杂交种选育中得到广泛的利用[2]。
棉花具有十分明显的杂种优势，而CMS育性在棉花杂交优势利用中还没有大量应用。
这是因为在棉花中，有应用价值的雄性不育类型很少。由于雄性不育在杂种优势中的利用存在2个问题：一是核基因控制的不育系，其不育不易保持，即尚未找到真正意义上的完全保持系，制种时需要拔除50%的可育植株；二是质核互作的细胞质雄性不育系的恢复系恢复力不够强，导致大量棉铃脱落，并且带有不良性状[3-4]。开展哈克尼西棉细胞质雄性不育育性恢复基因遗传和定位研究，将为分子标记辅助选育优良恢复系和分子检测鉴定“三系”及其杂交种纯度服务，也为进一步研究核质互作的作用机理、克隆恢复基因打下基础。
1 棉花细胞质雄性不育系和恢复系的理论研究
1.1 棉花细胞质雄性不育系及恢复系的利用现状
美国是最早研究棉花CMS的国家。在20世纪60年代，Meyer[5]通过远缘杂交的方法首次实现三系配套。Weaver等[6-7]经过多年研究，发现哈克尼西棉不育胞质会影响棉花产量。但是，经过育种家长期的选育过程，不育胞质对产量的不良影响已消除。在实际生产中，有利用价值的雄性不育系胞质基础主要有哈克尼西棉D2、D8和三裂棉。
我国对棉花CMS的研究开始于20世纪70年代[8]，目前主要有4种类型的细胞质雄性不育系。仅哈克尼西棉、陆地棉、三裂棉胞质的不育系能够稳定表现出稳定的雄性不育特性，在杂交种生产上具有较高的利用价值。其中，陆地棉可以作为哈克尼西棉、陆地棉、三裂棉胞质不育系的保持系[9]。2002年王学德等[10]利用农杆菌介导法，筛选到一个强恢复系，被命名为“浙大强恢”。
国内外已成功选育多个棉花CMS三系配套的三系杂交种，但是三系杂交棉选育进程缓慢。一些专家将其原因归为：①棉花CMS胞质类型单一；②恢复基因来源狭窄；③缺乏简便高效的传粉媒介，三系杂交棉种子生产过程中省略了人工去雄环节，但是授粉程序仍要人工辅助完成；④恢复系的恢复能力受温度的影响。
1.2 棉花细胞质雄性不育育性恢复的遗传方式
在利用不育系进行三系杂交制种时，必须要有恢复系对其育性恢复。恢复系的强恢复能力是至关重要的。因而，近年来加强了对恢复基因的研究，以期创制性状良好、遗传稳定的强恢复系。
Meyer等[11]报道，育性恢复受2对独立遗传基因控制，其中一对是显性基因（F-），另一对是纯合隐性基因（ss）。Kohel等[6]研究则认为，哈克尼西棉CMS育性恢复仅受1对基因Rf控制，并首次发现了一个形态学标记基因Rc与Rf1连锁，重组率为14.0%。王学德等[12]则认为，不育系受2个独立遗传的显性基因Rf1和Rf2控制。2001年，Stewart等[13]研究认为，哈克尼西棉CMS系统受到1对独立显性基因（Rf2）控制，CMSD2Rf系统受到2对独立遗传的显性基因（Rf1，Rf2）控制。李朋波等[14]以晋A为研究材料，发现恢复基因是由一个显性基因控制的。曹秀霞[15]通过田间调查，统计了409株近等基因系群体单株和695株F2群体单株的育性分离情况，其中近等基因系中有223个可育株、186个不育株，F2群体中有502个可育株、193個不育株。经卡方检验，结果表明，近等基因系群体中的可育株与不育株分离比例符合1∶1，在F2群体中分离比例符合3∶1。这说明哈克尼西棉育性恢复基因的遗传是由1对显性基因（Rf1）控制的。冯纯大等[16]均认为不育系育性恢复受1对基因控制。 1.3 棉花细胞质雄性不育的细胞学及生理生化研究
棉花CMS基因的表达时期主要在造孢细胞增殖期和小孢子母细胞减数分裂期，表达部位主要集中在绒毡层细胞和小孢子母细胞。王学德等对国内6个胞质不育系以及哈克尼西棉胞质的败育过程进行细胞学研究，发现这7种不育系的败育原因大致分为2类：一是不育系的造胞细胞在增殖期败育，出现异常不能进行正常的有丝分裂，导致花粉败育；二是造孢细胞在增殖期没有异常，但在减数分裂期败育，而且所有不育系花药的绒毡层细胞停止分裂生长，常常高度液泡化。
裴文锋[17]通过对雄性不育系和保持系制作压片进行细胞学观察比较，发现可以确定哈克尼西棉胞质不育系的败育时期发生在减数分裂活动之前。裴文锋进一步对雄性不育系和保持系进行石蜡切片观察，发现初步判断花粉母细胞减数分裂的粗线期是在花蕾3.1～3.6 mm时期，而不育系花粉母细胞败育时期为粗线期之前，即判定败育的发生期为2～3.1 mm。
与可育花粉相比，不育花药的碳水化合物代谢变化有淀粉积累受阻，淀粉酶和同工酶缺失和酶活性降低，花药细胞中缺少淀粉粒，花药脂肪含量低，蛋白质含量偏低，不育花药中细胞色素氧化酶（COX）含量减少，活性降低。在棉花不育花药的发育过程中，活性氧的积累过程以及花药自身对其清除能力的降低是与小孢子母细胞死亡同步发生的。
2 细胞质雄性不育恢复基因的遗传定位
分子标记由于具有其他标记不可比拟的优越性而被广泛应用。目前在棉花细胞质雄性不育育性恢复基因研究中，常用的分子标记有RFLP、RAPD、SSR、ESTSSR、STS、SCAR等。
Wang等[18]利用RAPD、AFLP、STS、CAPS和SSR标记技术发现了3个RAPD标记和1个SSR标记，并且推测出Rf1和Rf2都定位在D亚染色体组的LGD08 连锁群（现命名为D5染色体）上。
曹秀霞[15]通过对构建的可育DNA池和不育DNA池进行多态性标记筛选。在8242对SSR引物中共发现13对SSR引物具有明显多态性，用这13对引物再分别对近等基因系群体和F2 群体单株进行扩增，并且分别构建Rf1遗传连锁图谱。通过比较连锁图谱和分析这些标记在棉花染色体上的位置，发现在研究中获得的13个对于Rf1具有连锁的SSR标记中，有7个标记位于第19染色体（又名D5染色体）上，进而推测，与这13个标记连锁的与性恢复基因Rf1可能位于第19染色体上。
大量CMS恢复基因的定位研究表明，恢复基因座极有可能是以复合形式出现的。下面是一些相关研究的文献证明。如，菜豆的恢复基因虽然拥有两套完全不同的恢复机制，但是基因定位于同一基因位点上[19]；水稻中的WA型、BT型以及HL型3种CMS恢复基因均定位于相同位点[20]；同样地，研究油菜育性恢复基因的学者发现油菜的nap和pol型2种CMS恢复基因也定位到同一个基因座上[21]的特殊现象，黑麦P型和G型CMS恢复基因与小麦T型不育恢复基因位于同一区域内。
3 棉花CMS育性恢复的分子机理研究
自20世纪80年代以来，随着分子生物学的发展以及植物基因组计划的推动，越来越多的研究者通过对植物CMS育性恢复基因的分子水平研究，将CMS相关位点定位于线粒体。
线粒体基因组的重排、突变都可能引起植物败育。在一些植物中已经鉴定出与雄性不育有关的DNA片段。关于这些片段导致植物CMS发生的过程有2种观点：一是毒害假说；二是能量假说。
马勇[22]对在哈克尼西棉细胞质不育系、保持系和恢复系间差异表达的256个基因进行AFLP扩增分析，最后对成功克隆、测序的85个差异表达序列片段序列进行Gene Ontology分析，发现这些差异性大片段主要参与能量代谢，防御，蛋白质合成及运输，信号转导，分子伴侣等。而这些序列表达的异常都可能与败育有关。
崔明晖[23]还利用RACE技术克隆不育系和保持系的atpA基因的cDNA全长，保持系序列可以编码498个氨基酸的蛋白质，而不育系序列可以编码492个氨基酸的蛋白质，序列比对相似性高达99.6%，推测其可能是由于个别碱基的突变或重组，导致编码蛋白差异，进而导致雄性不育性的发生。
裴文锋[17]以棉花细胞质雄性不育系和保持系不同发育时期的花蕾为材料，分析miR156和预测的靶基因TBCC（Tublin binding cofactor C）在花蕾中的表达水平、相互关系。结果表明，不育系和保持系花蕾中 miR156表达量随着花药发育进程而显著增加，TBCC在保持系中随着花药发育逐渐降低，而在不育系中该基因的表达水平一直维持在较低水平，推测不育性状可能与TBCC的表达有关。
已证明一些恢复基因可通过改变线粒体不育相关基因的表达，恢复花粉育性。恢复基因的具体作用表现为恢复基因可以影响线粒体CMS基因的转录本稳定性[24]，而且可以表现为组织专一性；恢复基因可以影响线粒体CMS基因的转录加工，影响CMS基因的表达。这是一种常见的Rf基因的作用形式。在玉米[25-26]、高粱[27]、水稻[28-29]细胞质雄性不育的研究中也发现了这种现象。
综上所述，对CMS恢复基因的作用方式可以分为2种。一是恢复基因抑制线粒体CMS基因的表达，二是恢复基因补偿线粒体基因功能的缺陷。要想进一步搞清楚恢复基因的分子本质及其具体的作用机制，就要科研工作者进行更深入地研究。
4 棉花育性恢复基因与PPR基因
4.1 棉花育性恢复基因的克隆
植物细胞质雄性不育育性恢复机理的研究，还要依赖Rf基因的克隆。基因克隆主要有正向遗传学途径和反向遗传学途径2条途径[30]。
克隆恢复基因是一项具有挑战性的工作。由于没有同源序列和蛋白序列的资料，常见的基因克隆策略难以应用；植物的育性恢复表型是通过恢复基因与胞質不育因子共同作用的结果，使得恢复基因的突变分析变得复杂化。到目前为止，已克隆的植物Rf基因有玉米的Rf2基因[30]、矮牵牛的Rf基因[30]、萝卜的Rfo和Rfk基因[31]以及水稻的Rf1基因[31]等。 Brown等[32-33]几乎同时克隆出Rfo基因。在目前已克隆的恢复基因中，除玉米Rf2编码乙醛脱氢酶外，矮牵牛Rfo、萝卜Rfo及水稻的Rfla和Rflb都编码的是由PPR基序串联组成的PPR蛋白。
Klein等[34]发现，高粱的育性恢复基因Rf1也编码PPR蛋白，被命名为PPR家族成员PPR13。PPR13是一个外显子的线粒体靶向蛋白。这个外显子包含一个14 PPR重复序列。该蛋白是E型PPR亚家族成员。
Zhang等[35]通过差异展示技术和反向Northern杂交分析等实验研究，证明磷酸核糖邻氨苯甲酸转移酶（PAT）参与色氨酸合成途径。它在花药中下调表达引起生长素减少，从而导致棉花雄性不育。
4.2 PPR基因家族的研究进展
PPR是由Small等[36]首先发现和命名的，由35个简并氨基酸为重复单位，串联排列组成一个家族。PPR基因家族在不同生物体内分布不同。PPR基因大量存在于植物中，而存在于动物中数目非常少。PPR基因家族是在植物中发现的最大的基因家族之一。拟南芥基因组中含有200个PPR和相关的TPR基因，其编码的蛋白质大部分是以细胞器为靶目标，它们的大多数被预测与线粒体和叶绿体功能相关。PPR基因的遗传学研究毫无疑问地证明了大多数蛋白参与细胞器中RNA的新陈代谢。除了参与RNA的剪接、翻译和翻译后加工、提高RNA稳定性，还参与RNA的编辑功能。
PPR基因家族在同一生物体内不同染色体上分布不同，如PPR基因在拟南芥中均匀地分布在5条染色体上，没有成簇的存在[37-38]。但是，在第1条染色体的长臂约1 M范围内，却出现19个PPR基因和几个可能的PPR拟基因[38]。这些成簇分布的PPR基因大多有相似的功能。最近发现，从矮牵牛（Pentunia）、萝卜（Radish）、水稻（Oryza sativa）中克隆的CMS恢復基因与和拟南芥这一区域的PPR基因有很高的同源性。
PPR蛋白家族在植物细胞器基因表达中扮演很多重要的角色。这一点是没有任何怀疑的。可是，重要的突出问题仍然存在。首先，PPR蛋白怎样通过这种特异性识别大量的RNA靶对象？PPR蛋白家族是最大的RNA结合家族，但还没有发现它的作用结构。用于PPR蛋白复合体与RNA配体结合的单一结构的发现将是一个大的进步。其次，大量陆生植物中PPR蛋白在细胞器基因表达方面，真的存在无与伦比的调控方式吗？或者它们仅仅是一个令人好奇的、历史偶发事件？合成生物学技术将要揭示这些方法中更精确的方法。
5 问题与展望
目前，棉花细胞质雄性不育育性恢复基因的研究还处于探索阶段，Rf基因的表达导致相应的线粒体CMS因子的表达降低，但是这个作用过程还不清楚。因此，今后可以从以下3个方面进行深入研究。第一，对育性恢复基因进行进一步的精细定位，为克隆育性恢复相关基因位点提供有利的条件。第二，要阐明Rf蛋白的作用模型，还需对它的功能进行更多详细的生化研究。拟南芥中缺少CMS，所以就排除这个模式生物的遗传研究。但是，大约鉴别20个Rf同源基因，就会为检测其他功能提供机会。拟南芥和芸薹属植物近属的序列数据将对了解Rf基因簇的进化起重要作用。来自其他植物的序列数据可能很快就会丰富起来，从而检测一个假设，就是单子叶和双子叶植物的Rf基因拥有共同的祖先。这一点明显不同于所有其他PPR基因。清楚了不同的Rf基因是有关联（都像是成簇出现）的这一点，就会促进一个新物种的比对和克隆，从而在育种进程中更好地利用CMS系。第三，对PPR基因的功能继续进行深入研究。为解析单个PPR蛋白的功能，在传统的研究中需寻找更多的突变体，而突变体的筛选和获得很不容易，因为许多突变体是致死的或表型上没有明显的差异。但是，随着不同生物基因组测序工作的完成和生物信息学的发展，将为PPR基因遗传和功能的深入研究提供一个便利的技术平台。
参考文献
[1] 程计华，李云昌.几种农作物细胞质雄性不育恢复基因的定位和分子标记研究进展[J].植物学通报，2006，23（6）：613-624.
[2] 王学德，潘家驹.棉花亲本遗传距离与杂种优势间的相关性研究[J].作物学报，1990，16（1）：32-38.
[3] 王学德.陆地棉品种间杂种一代的产量结构特点[J].中国棉花，1988，15（5）：8-9.
[4] 马小定，邢朝柱.棉花雄性不育研究和应用进展[J].棉花学报，2006，18（5）：309-314.
[5] MEYER V G.Male sterility from Gossypium harknessii[J].Heredity，1975，66：23-27.
[6] WEAVER J B，WEAVER JR JB.Inheritance of pollen fertility restoration in cytoplasmic malesterile upland cotton[J].Crop Sci，1977，17：497-499.
[7] MEYER V G.A study of reciprocal hybrids between upland cotton and experimental lines with cytoplasms from seven other species [J].Crop Sci，1993，3：439-442.
[8] 俞志华，王学德.棉花细胞质雄性不育的研究及改良[J].棉花学报，1999，11（5）：268-274.
[9] 肖松华，刘剑光，吴巧娟，等.棉花细胞质雄性不育与育性恢复的研究与利用[J].江西农业学报，2008，20（9）：8-15.
[10] 王学德，李悦有.细胞质雄性不育棉花的转基因恢复系的选育[J].中国农业科学，2002，35（2）：137-141. [11] SHEETZ R H，WEAVER JR BJ.Inheritance of a fertility enhancer factor from Pima cotton when transferred into upland cotton with Gossypium harknessii barandegee cytoplasm[J].Crop Sci，1980，20：272-275.
[12] 王学德，张天真，潘家驹.棉花细胞质雄性不育系育性恢复的遗传基础I：恢复基因及其遗传效应[J].中国农业科学，1996，9（5）：32-40.
[13] ZHANG J，STEWART J M.CMSD8 restoration in cotton is conditioned by one dominant gene [J].Crop Sci，2001，41：283-288.
[14] 李朋波，曹美莲，刘慧民，等.棉花晋A细胞质雄性不育恢复基因定位[J].西北植物学报，2007，27（10）：1937-1942.
[15] 曹秀霞.哈克尼西棉细胞质雄性不育恢复基因SSR标记定位及利用[D].北京：中国农业科学院，2012.
[16] 冯纯大，张金发，刘金兰，等.棉花雄性不育性研究进展[J].棉花学报，1998，10（4）：169-177.
[17] 裴文锋.哈克尼西棉细胞质雄性不育系和保持系花发育不同时期microRNA研究[D].北京：中国农业科学院，2013.
[18] WANG F，STEWART J M，ZHANG J.Molecular markers linked to the Rf2 fertility restorer gene in cotton[J].Genome，2007，50（9）：818-824.
[19] HE S，YU Z H，VALLEJOS C E，et al.Pollen fertility restoration by nuclear gene Fr in CMS common bean：an Fr linkage map and the mode of Fraction[J].Theor Appl Genet，1995，90：1056-1062.
[20] ZHUANG J Y，FAN Y Y，WU J L，et al.Localization of the restorer genes for WACMS in rice[J].Acta Genetica Sinica，2001，28（2）：129-134.
[21] LI X Q，JEAN M，LANDRY B S，et al.Restorergenes for different forms of brassica cytoplasmic male sterility map to a single nuclear locus that modifies transcripts of several mitochondrial genes[J].Proc Natl Acad Sci USA，1998，95（17）：10032-10037.
[22] 馬勇.哈克尼西棉细胞质雄性不育系、保持系及恢复系花粉发育差异基因表达分析[D].北京：中国农业科学院，2009.
[23] 崔明晖.棉花细胞质雄性不育相关基因分离及标记转化[D].北京：中国农业科学院，2010.
[24] 徐明良，杨金水.玉米T型胞质感病性及雄性不育的分子基础[J].遗传，1995，17（S1）：24-29.
[25] CUI X Q，WISE R P，SCHNABLE P S.The rf2 nuclear restorer gene of malesterile Tcytoplasm maize[J].Science，1996，272：1334-1336.
[26] KOIZUKA N，IMAI R，FUJIMOTO H，et al.Genetic characterization of a pentatricopeptide repeat protein gene，orf687 that restores fertility in the cytoplasmic malesterile Kosena radish[J].Plant J，2003，34：407-415.
[27] ZABALETA E，MOURAS A，HERNOULD M，et al.Transgenic malesterile plant induced by an unedited atp9 gene is restored to fertility by inhibiting its expression with antisense RNA[J].Proc Natl Acad Sci USA，1996，93：11259-11263.
[28] JANSKA H，MACKENZIE S.Unusual mitochondrial genome organization in cytoplasmic male sterile common bean and the nature of cytoplasmic reversion to fertility[J].Genetics，1993，135：869-879.
[29] CHASE C D.Expression of CMSunique and flanking mitochondrial DNA sequences in Phaseolus vulgaris L[J].Curr Genet，1994，25：245-251. [30] 杨光圣，傅廷栋，马朝芝，等.油菜波里马细胞质雄性不育恢复基因的筛选与遗传[J].中国农业科学，1996（29）：17-22.
[31] KOMORI T，OHTA S，MURAI N，et al.Mapbased cloning of a fertility restorer gene，Rf1，in rice（Oryza sativa L.）[J].Plant J，2004，37：315-325.
[32] BROWN G G，FORMANOVA N，JIN H，et al.The radish Rfo restorer gene of Ogura cytoplasmic male sterility encodes a protein with multiple pentatricopeptide repeats[J].Plant J，2003，35：262-272.
[33] DESLOIRE S，GHERBI H，LALOUI W，et al.Identification of the fertility restoratioin locus，Rfo，in radish，as a member of the pentatricopeptide repeat protein family[J].EMBO Rep，2003，4：588-594.
[34] KLEIN R R，KLEIN P E，MULLET J E，et al.Fertility restorer locus Rf1 of soghum（Soghum bicolor L.）encodes a pentatricopeptide repeat protein not present in the colinear region of rice chromosome12[J].Theor Appl Genet，2005，111：994-1012.
[35] ZHANG J F，TURLEY R B，STEWART J M.Comparative analysis of gene expression between CMSD8 restored plants and normal nonrestoring fertile plants in cotton by differential display[J].Plant Cell Rep，2008，27：553-561.
[36] SMALL I D，PEETERS N.The PPR motifa TPRrelated motif prevalent in plant organellar proteins[J].Trends Biochem Sci，2000，25：46-47.
[37] AUBOURG S，BOUDET N，KREIS M，et al.In Arabidopsis thaliana，1%of the genome codes for a novel protein family unique to plants[J].Plant Mol Biol，2000，42：603-613.
[38] LURIN C，ANDRS C，AUBOURG S，et al.Genomewide analysis of Arabidopsis pentatricopeptide repeat proteins reveals their essential role in organelle biogenesis[J].Plant Cell，16：2089-2103.
責任编辑 刘月娟 责任校对 李岩