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【摘要】目的：分析咽拭子新型冠状病毒（SARS-CoV-2）核酸检测结果，评价咽拭子 SARS-CoV-2 核酸检测的临床应用价值。方法：回顾性分析2020 年 1 月 23 日至 3 月 15 日经 SARS-CoV-2 核酸检测确诊为 COVID-19 患者的病历资料，分析患者病历资料、SARS-CoV-2 核酸检测的取样次数、方法等信息。结果：实验室检查结果显示，白细胞计数正常（71.43 %），淋巴细胞计数下降（51.74 %）。14 例确诊的病例中，咽拭子采样 12 例（85.71 %），诱导排痰 2 例（14.29 %），通过咽拭子、痰标本 RTPCR 确诊 13 例（92.86 %），痰标本 NGS 确诊 1 例（7.14 %），发病至确诊的中位时间为 4.8d。首次采集标本 SARS-CoV-2 检测阳性者 8 例（57.14 %），首次可疑阳性1例；第二次采集阳性 3 例（21.43 %）；第三次采集阳性 1 例（7.14 %），4 次采集 1 例（7.14 %）阳性，5 次采集 2 例（14.29 %）阳性。结论：COVID-19 常见症状有发热、干咳，但其特异性较低，仍需进行 SARSCoV-2 核酸检测才能确诊。咽拭子是门诊首选的 SARS-CoV-2 核酸检测方式存在便捷的优点。
【关键词】咽拭子；新型冠状病毒；核酸检测；发热；干咳
【中图分类号】R51 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）06-0177-02
SARS-CoV-2核酸检测是当前确诊COVID-19的金标准，因此病毒的RNA为单链结构，存在稳定性较差的特点，导致采样检测的过程中极易出现假阴性的现象[1]。目前国内各医院发热门诊主要采用咽拭子检测核酸。该方法检测简单，取样流程较少，操作迅速，而此检测方法的检测灵敏度高低与否目前还未报道[2-3]。本研究通过对我市14例确诊患者的病历资料、新型冠状病毒核酸取样次数和方法进行了回顾性分析，评估了咽拭子SARS-CoV-2核酸检测对诊断COVID-19的临床意义。
1 對象与方法
1.1 研究对象
根据新型冠状病毒性肺炎诊疗方案（试行第七版）对我市14例COVID-19患者进行了确诊。入院第一天收集COVID-19确诊患者的一般资料信息，其中男10例，女4例，年龄23～77（50.12±10.14）岁，病程为1～3（2.01±0.13）d，根据国家卫健委发布《新型冠状病毒感染的肺炎的诊疗方案（试行第五版）》，CT影像结果被纳入湖北省临床诊断标准中，“疑似病例具有肺炎影像学特征者”即为临床诊断病例。
纳入标准：（1）确诊为COVID-19；（2）知情本次研究并自愿参与；（3）无精神障碍和意识障碍，可配合研究。
排除标准：（1） COVID-19疑似病例。（2）不愿参加本次研究的COVID-19确诊患者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均已知情并签署了知情同意书。
1.2 方法
咽拭子取样均为丙纶头一次性无菌塑料拭子。采样方法：（1）咽拭子：患者用生理盐水冲洗口腔，拭子用无菌生理盐水浸泡，患者头部稍微仰起，将嘴张开，发出“啊”音，将咽扁桃体暴露，拭子跨过舌根，稍用力在患者两侧的咽扁桃体反复擦拭不少于3次，然后在咽后壁反复擦拭3次以上；（2）鼻咽拭子：采样者一只手轻扶患者头部，一只手拿拭子，贴于鼻孔放入，沿下鼻道底向后缓慢进入。待拭子顶部至咽后壁时，轻柔地旋转一圈，如果出现反射性咳嗽，中止一段时间，之后再缓慢将拭子取出。取样后，迅速折断拭子头，浸入盛有2 ml等渗盐溶液（无核酶污染）的1.5 ml离心管（EP离心管）中，盖上盖子并单独包装在塑料袋中密封储存，于15 min～2 h内送检。上述操作由经培训并考核通过的主治医师操作。咽拭子病毒核酸检测由我市疾控中心检验科执行，采用RT-PCR技术对样本RNA进行检测。
1.3 观察指标
观察患者的病理检查结果、临床症状表现、新型冠状病毒核酸检测确诊方式及发病至确诊时间、发病至确诊核酸检测次数。（1）通过血常规检查所有患者的白细胞计数、淋巴细胞值，采用免疫比浊法对患者的C反应蛋白（CRP）进行检测：空腹8 h以上，清晨采集受检者静脉血3 mL，置于真空干燥管中，室温下静置0.5 h，3000 r/min，离心6 min，采用免疫比浊法对CRP进行检测。采用可见分光光度法对乳酸脱氢酶（LDH）进行检测：取试管加入0.5 mol/L乳酸钠溶液0.5 ml，酶液0.1 ml，空白管加蒸馏水，37℃水浴保温3 min。然后测试管中加入NADH1 mmol/l0.1 ml，37℃水浴保温15 min。加入2，4-二硝基苯肼，37℃水浴保温15 min，加入氢氧化钠溶液终止反应，静置显色而后处比色，通过标准曲线计算酶活。酶活单位规定：1min催化乳酸生成丙酮酸的酶量为个酶活力单位（U）。（2）心肌酶学检查：采用全自动生化分析仪，检测试剂为配套的生化检测试剂。（3）肝肾功能检查：采用比色法，严格按肝肾功能十一项检测试剂盒的使用说明书对肝肾功能指标进行检查。
1.4 统计学方法
将数据纳入SPSS 22.0软件中分析，计量资料比较采用t检验，并以（x±s）表示，计数资料采用χ2检验，并以率（%）表示，当P<0.05时差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理检查结果
71.43 %（10/14）的患者白细胞计数正常，而淋巴细胞下降（8例，57.14 %）、CRP升高[9例，（35.16±8.92）mg/L]、LDH上升[10例，（265.54±10.65）U/L]。收集所有患者的心肌酶学、肝肾功能检查结果：肌酸磷酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白（Mb）上升各1例，分别为（309.62±100.32）U/L、（36.95±3.18）U/L、（159.64±50.23）U/L；总胆红素（TBil）上升1例，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）分别升高2例和1例。收集所有患者的降钙素原（PCT）检查结果，其中6例<0.05 ng/mL，1例轻微上升（0.65 ng/mL）。 2.2 临床症状表现
COVID-19患者最常见的临床症状为发热78.57 %（11/14），咳嗽57.14 %（8/14），咳嗽以干咳为主，少数患者为咳痰，一部分患者存在流感样症状。见表1。
2.3 新型冠状病毒核酸检测确诊方式及发病至确诊时间
所有病例中，咽拭子采样12例（85.71 %），诱导排痰2例（14.29 %），通过咽拭子、痰标本RT-PCR确诊13例（92.86 %），痰标本NGS确诊1例（7.14 %）。发病至确诊的中位时间为4.8天。
2.4 发病至确诊核酸检测次数
首次采集标本SARS-CoV-2检测阳性者8例（57.14 %），首次可疑阳性1例；第二次采集阳性者3例（21.43 %）；第三次采集阳性1例（7.14 %），4次采集1例（7.14 %）阳性，5次采集2例（14.29 %）阳性。
3 讨论
当前，COVID-19疫情获得了政府的有效防控，目前治愈例数大于确诊例数，然而一些患者治愈后，复诊时发现SARS-CoV2-核酸检测再次阳性的情况。随着各个行业开始复工，加之海外输入的病例数增多，疫情的防控仍然需要谨慎对之[4-6]。我市14例COVID-19确诊的病例中主要临床症状表现为重症的3人，其中年龄最大者77岁，最小者23岁，60岁以上者5人；男性9人，女性5人；8例为武汉来我市旅游的人员，其余6例中有1例为湖北孝感在我市工作的人员，5例为本市本地人，均有湖北旅游居史或接触史，主要症状为发热、干咳。病理检查显示，白细胞计数正常者较多，淋巴细胞计数下降，CRP升高，LDH升高者较多。然而，仅根据临床症状和病理检查结果来辨别于其他病毒感染并不容易。核酸檢测是COVID-19诊断的有效方法，我市14例确诊的患者中，咽拭子首次确诊的病例数并不多。临床上对存在显著暴露既往史的患者保持高度的警觉性。故怎样提升COVID-19的诊断准确度是一个迫切需要解决的问题。造成核酸检测假阴性的原因有：（1）SARS-CoV-2为RNA单链结构，与双链结构比较其稳定性较差。（2）病毒受体主要存在于呼吸道，较少存在于咽部，多数患者仅出现干咳症状。在临床工作中，从手术方便的角度出发，结合患者的耐受性，门诊对疑似患者首选咽拭子核酸检测。本文所有确诊患者中，71.43 %的标本是用咽拭子采集的。这种采样方法要求咽拭子在采样点旋转360°并停留15～30 s，但由于部分患者在临床采样时耐受性差，导致咽拭子不能在采集点停留充足的时间；另外，部分患者在采样过程中出现干呕，使得拭子接触其他含唾液的口腔部位，唾液RNA酶含量较高，这导致病毒被酶降解。（3）疾病严重程度和病程对病毒的分布产生了一定的影响[7-11]。目前，虽然SARS-CoV-2抗体检测在我国应用较少，但随着检测技术水平的提升，血清学检测也将成为病毒感染诊断的重要手段。本研究对我市14例COVID-19确诊患者的临床症状表现及SARS-CoV-2核酸检测的取样方法和次数进行了回顾性分析，评估了咽拭子核酸检测对诊断COVID-19的临床意义，核酸检测阴性并不能排除病毒感染；并分析了引发检测假阴性的原因，总结了提高诊断正确率的方法。
综上，咽拭子是SARS-CoV-2核酸检测的简便方法。但是，不能排除假阴性结果。
参考文献
[1] 陈培松，何宇婷，黄裕立，等.不同方式灭活口咽拭子标本对2019新型冠状病毒实时荧光定量PCR检测结果的影响[J].中华检验医学杂志，2020，（43）：4.
[2] 杨智炜，李干文，戴小灵，等.新型冠状病毒肺炎咽拭子核酸检测转阴但粪便核酸检测仍阳性三例[J].中华消化杂志，2020，40（2）：77-79.
[3] 任彬彬，陈海君，张德和，等.新型冠状病毒肺炎恢复期咽拭子核酸检测阴性但粪便检测阳性三例分析[J].中华临床感染病杂志，2020，13（1）：33-35，38.
[4] 李波，张浩，李伯安，等.新型冠状病毒肺炎病例粪便及咽拭子核酸平行检测结果比对分析[J].中华实验和临床病毒学杂志，2020，（34）：8.
[5] 马思远，罗伊美，胡田雨，等.改良新型冠状病毒核酸检测鼻咽拭子采样方法的临床应用效果[J].中华烧伤杂志，2020，（36）：9.
[6] 马红霞，潘静静，李懿，等.实时荧光RT-PCR方法检测新型冠状病毒核酸结果分析[J].中华微生物学和免疫学杂志，2020，40（4）：245-249.
[7] 余夏，周莹，阳文辉，etal.108例住院患者2019新型冠状病毒核酸检测结果分析[J].中国临床新医学，2020，13（05）：448-452.
[8] 王小波，余寿杰，曾凡荣，等.淮南市新型冠状病毒核酸检测结果分析[J].安徽预防医学杂志，2020，26（2）：89-91，126.
[9] 姜蕾，张丽媛，刘大宁.两种灭活方法对2019新型冠状病毒咽拭子标本病毒核酸检测结果的影响[J].分子诊断与治疗杂志，2020，12（4）：410-413.
[10] 董玉颖，范前东，王月萍，等.江苏省扬州市新型冠状病毒肺炎患者核酸检测结果分析[J].实用临床医药杂志，2020，24（5）：6-9.
[1 1 ] 郭辉.2020年1-2月辽阳市新型冠状病毒监测结果分析[J].中国国境卫生检疫杂志，2020，43（2）：113-115.
【关键词】咽拭子；新型冠状病毒；核酸检测；发热；干咳
【中图分类号】R51 【文献标识码】A 【文章编号】2096-5249（2021）06-0177-02
SARS-CoV-2核酸检测是当前确诊COVID-19的金标准，因此病毒的RNA为单链结构，存在稳定性较差的特点，导致采样检测的过程中极易出现假阴性的现象[1]。目前国内各医院发热门诊主要采用咽拭子检测核酸。该方法检测简单，取样流程较少，操作迅速，而此检测方法的检测灵敏度高低与否目前还未报道[2-3]。本研究通过对我市14例确诊患者的病历资料、新型冠状病毒核酸取样次数和方法进行了回顾性分析，评估了咽拭子SARS-CoV-2核酸检测对诊断COVID-19的临床意义。
1 對象与方法
1.1 研究对象
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纳入标准：（1）确诊为COVID-19；（2）知情本次研究并自愿参与；（3）无精神障碍和意识障碍，可配合研究。
排除标准：（1） COVID-19疑似病例。（2）不愿参加本次研究的COVID-19确诊患者。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均已知情并签署了知情同意书。
1.2 方法
咽拭子取样均为丙纶头一次性无菌塑料拭子。采样方法：（1）咽拭子：患者用生理盐水冲洗口腔，拭子用无菌生理盐水浸泡，患者头部稍微仰起，将嘴张开，发出“啊”音，将咽扁桃体暴露，拭子跨过舌根，稍用力在患者两侧的咽扁桃体反复擦拭不少于3次，然后在咽后壁反复擦拭3次以上；（2）鼻咽拭子：采样者一只手轻扶患者头部，一只手拿拭子，贴于鼻孔放入，沿下鼻道底向后缓慢进入。待拭子顶部至咽后壁时，轻柔地旋转一圈，如果出现反射性咳嗽，中止一段时间，之后再缓慢将拭子取出。取样后，迅速折断拭子头，浸入盛有2 ml等渗盐溶液（无核酶污染）的1.5 ml离心管（EP离心管）中，盖上盖子并单独包装在塑料袋中密封储存，于15 min～2 h内送检。上述操作由经培训并考核通过的主治医师操作。咽拭子病毒核酸检测由我市疾控中心检验科执行，采用RT-PCR技术对样本RNA进行检测。
1.3 观察指标
观察患者的病理检查结果、临床症状表现、新型冠状病毒核酸检测确诊方式及发病至确诊时间、发病至确诊核酸检测次数。（1）通过血常规检查所有患者的白细胞计数、淋巴细胞值，采用免疫比浊法对患者的C反应蛋白（CRP）进行检测：空腹8 h以上，清晨采集受检者静脉血3 mL，置于真空干燥管中，室温下静置0.5 h，3000 r/min，离心6 min，采用免疫比浊法对CRP进行检测。采用可见分光光度法对乳酸脱氢酶（LDH）进行检测：取试管加入0.5 mol/L乳酸钠溶液0.5 ml，酶液0.1 ml，空白管加蒸馏水，37℃水浴保温3 min。然后测试管中加入NADH1 mmol/l0.1 ml，37℃水浴保温15 min。加入2，4-二硝基苯肼，37℃水浴保温15 min，加入氢氧化钠溶液终止反应，静置显色而后处比色，通过标准曲线计算酶活。酶活单位规定：1min催化乳酸生成丙酮酸的酶量为个酶活力单位（U）。（2）心肌酶学检查：采用全自动生化分析仪，检测试剂为配套的生化检测试剂。（3）肝肾功能检查：采用比色法，严格按肝肾功能十一项检测试剂盒的使用说明书对肝肾功能指标进行检查。
1.4 统计学方法
将数据纳入SPSS 22.0软件中分析，计量资料比较采用t检验，并以（x±s）表示，计数资料采用χ2检验，并以率（%）表示，当P<0.05时差异有统计学意义。
2 结果
2.1 病理检查结果
71.43 %（10/14）的患者白细胞计数正常，而淋巴细胞下降（8例，57.14 %）、CRP升高[9例，（35.16±8.92）mg/L]、LDH上升[10例，（265.54±10.65）U/L]。收集所有患者的心肌酶学、肝肾功能检查结果：肌酸磷酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌红蛋白（Mb）上升各1例，分别为（309.62±100.32）U/L、（36.95±3.18）U/L、（159.64±50.23）U/L；总胆红素（TBil）上升1例，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）、尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）分别升高2例和1例。收集所有患者的降钙素原（PCT）检查结果，其中6例<0.05 ng/mL，1例轻微上升（0.65 ng/mL）。 2.2 临床症状表现
COVID-19患者最常见的临床症状为发热78.57 %（11/14），咳嗽57.14 %（8/14），咳嗽以干咳为主，少数患者为咳痰，一部分患者存在流感样症状。见表1。
2.3 新型冠状病毒核酸检测确诊方式及发病至确诊时间
所有病例中，咽拭子采样12例（85.71 %），诱导排痰2例（14.29 %），通过咽拭子、痰标本RT-PCR确诊13例（92.86 %），痰标本NGS确诊1例（7.14 %）。发病至确诊的中位时间为4.8天。
2.4 发病至确诊核酸检测次数
首次采集标本SARS-CoV-2检测阳性者8例（57.14 %），首次可疑阳性1例；第二次采集阳性者3例（21.43 %）；第三次采集阳性1例（7.14 %），4次采集1例（7.14 %）阳性，5次采集2例（14.29 %）阳性。
3 讨论
当前，COVID-19疫情获得了政府的有效防控，目前治愈例数大于确诊例数，然而一些患者治愈后，复诊时发现SARS-CoV2-核酸检测再次阳性的情况。随着各个行业开始复工，加之海外输入的病例数增多，疫情的防控仍然需要谨慎对之[4-6]。我市14例COVID-19确诊的病例中主要临床症状表现为重症的3人，其中年龄最大者77岁，最小者23岁，60岁以上者5人；男性9人，女性5人；8例为武汉来我市旅游的人员，其余6例中有1例为湖北孝感在我市工作的人员，5例为本市本地人，均有湖北旅游居史或接触史，主要症状为发热、干咳。病理检查显示，白细胞计数正常者较多，淋巴细胞计数下降，CRP升高，LDH升高者较多。然而，仅根据临床症状和病理检查结果来辨别于其他病毒感染并不容易。核酸檢测是COVID-19诊断的有效方法，我市14例确诊的患者中，咽拭子首次确诊的病例数并不多。临床上对存在显著暴露既往史的患者保持高度的警觉性。故怎样提升COVID-19的诊断准确度是一个迫切需要解决的问题。造成核酸检测假阴性的原因有：（1）SARS-CoV-2为RNA单链结构，与双链结构比较其稳定性较差。（2）病毒受体主要存在于呼吸道，较少存在于咽部，多数患者仅出现干咳症状。在临床工作中，从手术方便的角度出发，结合患者的耐受性，门诊对疑似患者首选咽拭子核酸检测。本文所有确诊患者中，71.43 %的标本是用咽拭子采集的。这种采样方法要求咽拭子在采样点旋转360°并停留15～30 s，但由于部分患者在临床采样时耐受性差，导致咽拭子不能在采集点停留充足的时间；另外，部分患者在采样过程中出现干呕，使得拭子接触其他含唾液的口腔部位，唾液RNA酶含量较高，这导致病毒被酶降解。（3）疾病严重程度和病程对病毒的分布产生了一定的影响[7-11]。目前，虽然SARS-CoV-2抗体检测在我国应用较少，但随着检测技术水平的提升，血清学检测也将成为病毒感染诊断的重要手段。本研究对我市14例COVID-19确诊患者的临床症状表现及SARS-CoV-2核酸检测的取样方法和次数进行了回顾性分析，评估了咽拭子核酸检测对诊断COVID-19的临床意义，核酸检测阴性并不能排除病毒感染；并分析了引发检测假阴性的原因，总结了提高诊断正确率的方法。
综上，咽拭子是SARS-CoV-2核酸检测的简便方法。但是，不能排除假阴性结果。
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[10] 董玉颖，范前东，王月萍，等.江苏省扬州市新型冠状病毒肺炎患者核酸检测结果分析[J].实用临床医药杂志，2020，24（5）：6-9.
[1 1 ] 郭辉.2020年1-2月辽阳市新型冠状病毒监测结果分析[J].中国国境卫生检疫杂志，2020，43（2）：113-115.