论文部分内容阅读
摘要目的：探讨呼吸机诱导的肺损伤VILI的致病机制， 并鉴定相关标志物，为进一步研究和临床理论提供基础。方法：首先从NCBI（美国国立生物技术信息中心）公共数据平台GEO（Gene Expression Omnibus）下载基因芯片数据集GSE9314。然后使用在线分析工具GEO2R对数据进行标准化处理并获得正常肺组织和肺损伤组织之间的差异表达基因（DEGs）。接着用DAVID数据库对筛选出的差异基因进行功能性注释（GO），通路分析（KEGG）.最后通过STRING数据库和Cytoscape软件进行蛋白互作网络分析并识别网络中的关键基因。结果：初步筛选出583个（p<0.05）差异基因的变化超过一倍，Kegg分析表明，差异基因主要参与TNF信号传导途径，以及Toll样受体信号传导途径。而蛋白互作网络分析鉴定了十个核心基因，分别为Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b。结论：通过生物信息学分析小鼠肺损伤基因芯片数据的差异基因，鉴定的核心基因与相关通路参与VILI的发病过程，表明其可能是肺损伤发病机制的研究新靶点.
关键词：生物标志物，预后，呼吸机相关性肺损伤
呼吸机诱发的肺损伤（VILI）是与机械通气相关的最严重且发病率较高的并发症之一[1]。机械通气下急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者VILI的发生率估计为86%。涉及在插管期间接受机械通气的外科手术患者的研究发现，6.2% 至 24% 的患者发展为 ALI。因此，研究VILI的分子机制和致病相关基因对于正确管理呼吸系统疾病非常重要。
先前的研究表明，保护性通气肺中IL-6、IL-8和IL-1β的血浆水平降低，并且该水平与更好的临床结果相关[2]。华莱士 MJ 等。揭示CTGF、CYR61 和 EGR1 可能是早期肺损伤的新标志物[3]。然而，目前预后工具的效率相对有限，因此需要在 VILI 患者中使用更敏感和特异的分子生物标志物。在这里，我们筛选了VILI 中的十个关键基因（Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b）。这些结果可能为潜在的免疫学机制提供新的见解，并为 VILI 提供潜在的预后生物标志物。
1数据与方法
1.1数据
NCBI公共数据平台GEO是最大和最全面的公共基因表达数据资源。以“呼吸机性肺损伤”为搜索关键词，选择种属为小鼠，以“阵列表达谱”为检测类型，得到数据集GSE9314。该数据集来自弗吉尼亚医学院，包含4对VILI和匹配的对照肺组织样本。
1.2 研究方法
1.2.1差异基因筛选及数据处理
为筛选出正常肺组织和 VILI 肺组织的差异基因。本研究使用在线工具GEO2R来进行差异分析。然后将基因表达的差异表示为倍数变化 （fold change）。| log fold change |> 1，P <0.05作为过滤条件，基于 R语言程序结合pheatmap包用于差异基因可视化，以及绘制火山图和热图。
1.2.2 GO富集分析和KEGG通路分析
将DEGs数据导入DAVID数据库，然后我们进行GO分析（基因本体分析），并使用KEGG（京都基因和基因组百科全书）对DEGs进行功能富集。GO富集分析包括三部分，分别为生物过程、细胞组成和分子功能。通路富集根据 P值显示前10条通路。此外，我们使用 R（版本 3.6.1）为 GO 富集分析和KEGG信号通路分析绘制了条形图。
1.2.3 蛋白质相互作用网络建设和模块分析
我们使用检索基因相互作用的搜索工具STRING数据库，设置置信度得分> 0.7的交互被选为对研究具有高置信度.来分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）对并构建了PPI网络。使用Cytoscape软件对网络数据进行可视化分析，然后选择连通性得分>2的节点进行进一步分析。
2 结果
2.1 确定DEG并进行GO分析和KEGG通路分析
GEO数据平台中获得符合标准的基因芯片数据集1个GSE9314.经过标准化处理后对其进行DEG分析，筛选出583个基因.
为了进一步了解 DEG 的主要生物学过程（biological process），分子功能（molecular function）以及细胞组成（cellular component），我们进行了GO富集分析。GO分析的细胞组成部分显示 DEG 位于细胞膜上（图 2C）并且与炎症和免疫反应有关（图 2B）。DEG主要参与趨化因子活性、脂多糖结 合、生长因子活性-体结合和肽酶抑制剂活性（图 2A）。另一方面，KEGG分析显示调节干细胞多能性的通路，如TNF信号通路、Toll样受体信号通路、补体和凝血级联以及NOD样受体信号通路显着丰富（图2D））。
2.2 DEG的蛋白互作网络分析
为了寻找其他相关基因网络并探索关键信号通路，我们将DEG导入STRING数据库以获得PPI网络（图3）。结果显示，大部分蛋白间都存在着相互作用，且有多个蛋白位于网络中心.按照互作关系从多到少的原则， 我们将 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 确定为网络关键基因.
3 讨论
VILI 是与机械通气 （MV） 相关的最常见并发症。尽管机械通气是治疗呼吸功能不全的最有效疗法，但仍会增加患者的发病率和死亡率。许多有前途的重要生物介质已被确定为基础科学的显着成就 （4）。因此，探索与 VILI 相关的潜在预后生物标志物非常重要。在这项研究中，与来自微阵列数据集GSE9314的正常肺组织相比，在VILI的肺组织中鉴定了583个DEG和十个关键基因。这些DEGs主要富集在启动炎症反应和免疫反应的生物过程中，与TNF信号通路、Toll样受体信号通路等通路密切相关。表明这些基因可能在 VILI 的免疫机制中具有重要功能。 尽管这十个基因的表达升高影响了VILI患者的免疫机制，但其主要原因和潜在的调控机制尚不清楚。CXCL1、IL1b、CXCL2细胞与免疫相关通路的交叉表明，两条常见的通路是NOD样受体信号通路和IL-17信号通路。这两种途径也与免疫反应有关。有趣的是，我们发现 CXCL1、IL1b、CXCL2、IL6 的表达上调，这可能触发 VILI 中 IL-17 信号的激活。尽管如此，还需要进一步的实验和研究来验证枢纽基因并阐明这些基因对 VILI 的调控机制。
总之，我们的研究确定了在VILI肺组织中触发的DEG和关键基因。对基因表达和功能的综合分析证明了参与 VILI 进展的机制。我们的结果表明 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 是预测 VILI 预后的潜在生物标志物。需要进一步的研究来阐明中枢基因在 VILI 发展中执行的确切分子机制。
参考文献
[1]Lionetti V， Recchia FA， Ranieri VM. Overview of ventilator-induced lung injury mechanisms. Curr Opin Crit Care. 2005;13（1）：82–86. doi：10.1097/00075198-200502000-00013.[PubMed] [CrossRef][Google Scholar]
[2]Frank JA， Parsons PE， Matthay MA. Pathogenetic significance of biological markers of ventilator-associated lung injury in experimental and clinical studies. Chest. 2006;130（6）：1906‐1914. doi：10.1378/chest.130.6.1906
[3]Wallace MJ， Probyn ME， Zahra VA， et al. Early biomarkers and potential mediators of ventilation-induced lung injury in very preterm lambs. Respir Res. 2009;10（1）：19. Published 2009 Mar 10. doi：10.1186/1465-9921-10-19
[4]Dos Santos CC， Slutsky AS. The contribution of biophysical lung injury to the development of biotrauma. Annual Review of Physiology 2006; 68：585–618.
作者简介：龙姣 女 汉族 湖南长沙 （1990年5.） 硕士 住院醫师 中山大学附属第七医院（广东深圳）518107 研究方向：肺损伤 写作方向：肺损伤。
关键词：生物标志物，预后，呼吸机相关性肺损伤
呼吸机诱发的肺损伤（VILI）是与机械通气相关的最严重且发病率较高的并发症之一[1]。机械通气下急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者VILI的发生率估计为86%。涉及在插管期间接受机械通气的外科手术患者的研究发现，6.2% 至 24% 的患者发展为 ALI。因此，研究VILI的分子机制和致病相关基因对于正确管理呼吸系统疾病非常重要。
先前的研究表明，保护性通气肺中IL-6、IL-8和IL-1β的血浆水平降低，并且该水平与更好的临床结果相关[2]。华莱士 MJ 等。揭示CTGF、CYR61 和 EGR1 可能是早期肺损伤的新标志物[3]。然而，目前预后工具的效率相对有限，因此需要在 VILI 患者中使用更敏感和特异的分子生物标志物。在这里，我们筛选了VILI 中的十个关键基因（Il6， Ccl3， Tlr2， Cxcl1， Ccl2， Cxcl2， Cxcr2， Itgam， Cd68， 和Il1b）。这些结果可能为潜在的免疫学机制提供新的见解，并为 VILI 提供潜在的预后生物标志物。
1数据与方法
1.1数据
NCBI公共数据平台GEO是最大和最全面的公共基因表达数据资源。以“呼吸机性肺损伤”为搜索关键词，选择种属为小鼠，以“阵列表达谱”为检测类型，得到数据集GSE9314。该数据集来自弗吉尼亚医学院，包含4对VILI和匹配的对照肺组织样本。
1.2 研究方法
1.2.1差异基因筛选及数据处理
为筛选出正常肺组织和 VILI 肺组织的差异基因。本研究使用在线工具GEO2R来进行差异分析。然后将基因表达的差异表示为倍数变化 （fold change）。| log fold change |> 1，P <0.05作为过滤条件，基于 R语言程序结合pheatmap包用于差异基因可视化，以及绘制火山图和热图。
1.2.2 GO富集分析和KEGG通路分析
将DEGs数据导入DAVID数据库，然后我们进行GO分析（基因本体分析），并使用KEGG（京都基因和基因组百科全书）对DEGs进行功能富集。GO富集分析包括三部分，分别为生物过程、细胞组成和分子功能。通路富集根据 P值显示前10条通路。此外，我们使用 R（版本 3.6.1）为 GO 富集分析和KEGG信号通路分析绘制了条形图。
1.2.3 蛋白质相互作用网络建设和模块分析
我们使用检索基因相互作用的搜索工具STRING数据库，设置置信度得分> 0.7的交互被选为对研究具有高置信度.来分析蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）对并构建了PPI网络。使用Cytoscape软件对网络数据进行可视化分析，然后选择连通性得分>2的节点进行进一步分析。
2 结果
2.1 确定DEG并进行GO分析和KEGG通路分析
GEO数据平台中获得符合标准的基因芯片数据集1个GSE9314.经过标准化处理后对其进行DEG分析，筛选出583个基因.
为了进一步了解 DEG 的主要生物学过程（biological process），分子功能（molecular function）以及细胞组成（cellular component），我们进行了GO富集分析。GO分析的细胞组成部分显示 DEG 位于细胞膜上（图 2C）并且与炎症和免疫反应有关（图 2B）。DEG主要参与趨化因子活性、脂多糖结 合、生长因子活性-体结合和肽酶抑制剂活性（图 2A）。另一方面，KEGG分析显示调节干细胞多能性的通路，如TNF信号通路、Toll样受体信号通路、补体和凝血级联以及NOD样受体信号通路显着丰富（图2D））。
2.2 DEG的蛋白互作网络分析
为了寻找其他相关基因网络并探索关键信号通路，我们将DEG导入STRING数据库以获得PPI网络（图3）。结果显示，大部分蛋白间都存在着相互作用，且有多个蛋白位于网络中心.按照互作关系从多到少的原则， 我们将 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 确定为网络关键基因.
3 讨论
VILI 是与机械通气 （MV） 相关的最常见并发症。尽管机械通气是治疗呼吸功能不全的最有效疗法，但仍会增加患者的发病率和死亡率。许多有前途的重要生物介质已被确定为基础科学的显着成就 （4）。因此，探索与 VILI 相关的潜在预后生物标志物非常重要。在这项研究中，与来自微阵列数据集GSE9314的正常肺组织相比，在VILI的肺组织中鉴定了583个DEG和十个关键基因。这些DEGs主要富集在启动炎症反应和免疫反应的生物过程中，与TNF信号通路、Toll样受体信号通路等通路密切相关。表明这些基因可能在 VILI 的免疫机制中具有重要功能。 尽管这十个基因的表达升高影响了VILI患者的免疫机制，但其主要原因和潜在的调控机制尚不清楚。CXCL1、IL1b、CXCL2细胞与免疫相关通路的交叉表明，两条常见的通路是NOD样受体信号通路和IL-17信号通路。这两种途径也与免疫反应有关。有趣的是，我们发现 CXCL1、IL1b、CXCL2、IL6 的表达上调，这可能触发 VILI 中 IL-17 信号的激活。尽管如此，还需要进一步的实验和研究来验证枢纽基因并阐明这些基因对 VILI 的调控机制。
总之，我们的研究确定了在VILI肺组织中触发的DEG和关键基因。对基因表达和功能的综合分析证明了参与 VILI 进展的机制。我们的结果表明 Il6、Ccl3、Tlr2、Cxcl1、Ccl2、Cxcl2、Cxcr2、Itgam、Cd68 和 Il1b 是预测 VILI 预后的潜在生物标志物。需要进一步的研究来阐明中枢基因在 VILI 发展中执行的确切分子机制。
参考文献
[1]Lionetti V， Recchia FA， Ranieri VM. Overview of ventilator-induced lung injury mechanisms. Curr Opin Crit Care. 2005;13（1）：82–86. doi：10.1097/00075198-200502000-00013.[PubMed] [CrossRef][Google Scholar]
[2]Frank JA， Parsons PE， Matthay MA. Pathogenetic significance of biological markers of ventilator-associated lung injury in experimental and clinical studies. Chest. 2006;130（6）：1906‐1914. doi：10.1378/chest.130.6.1906
[3]Wallace MJ， Probyn ME， Zahra VA， et al. Early biomarkers and potential mediators of ventilation-induced lung injury in very preterm lambs. Respir Res. 2009;10（1）：19. Published 2009 Mar 10. doi：10.1186/1465-9921-10-19
[4]Dos Santos CC， Slutsky AS. The contribution of biophysical lung injury to the development of biotrauma. Annual Review of Physiology 2006; 68：585–618.
作者简介：龙姣 女 汉族 湖南长沙 （1990年5.） 硕士 住院醫师 中山大学附属第七医院（广东深圳）518107 研究方向：肺损伤 写作方向：肺损伤。