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【摘要】共聚焦激光扫描显微镜（confcallaserscanningmicroscope,CLSM）具有高分辨率、高灵敏度、三维重建、动态扫描成像等特点，使图像更为精确清晰和数字化，且安全、无创，被广泛应用于细胞生物学、生理学、药理学、医学等各个领域，尤其近十年在皮肤疾病的诊断、疗效检测、皮肤美容、皮肤显微外科等方面的应用发展迅速，又被称为“皮肤CT”。本文综述了激光扫描共聚焦显微镜的结构、工作原理及其在皮肤科的应用。
【关键词】共聚焦激光扫描显微镜；皮肤CT；皮肤疾病；皮肤美容；皮肤显微外科
【中图分类号】R75【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0531-02
1 共聚焦激光扫描显微镜的结构及工作原理
共聚焦激光扫描显微镜（confcallaserscanningmicroscope,CLSM），在结构配置上，除了普通光学显微镜的基本结构外，还具有激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集、处理、转换、应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦等部分。CLSM以激光作为点光源，通过物镜聚焦于组织内，组织内焦点处反射或反向散射回来的光由同一物镜接收，再由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像，只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品一个新的层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像，随着Z轴不断移动，就可得到样品样品不同横切面连续的光切图像,扫描后可得到信噪比极高的光学断层图像，分辨率比普通显微镜提高1.4倍。
2 激光扫描共聚焦显微镜在皮肤科的应用
2.1 对正常皮肤的观察：共聚焦激光扫描显微镜所成图像为水平切面图，由于不同组织对激光的反射和反向散射系数不同，因而所显示的黑白深浅也不同，类似X光片的灰度图像，其中黑色素和角蛋白的反射系数较高，成像为较亮的区域，反射系数较小的组织成分，如胞核和胶原较暗。CLSM的空间分辨率［1］为横向0.5-1.0um,轴向为3-5um,可清晰显示细胞结构。我们知道，表皮的主要细胞为树突状细胞（DC）和角质形成细胞（KC），近年关于DC的形态学研究，［2］主要集中在朗格汉斯细胞（LC）,通过应用LSCM对表皮LC进行荧光成像发现：正常表皮LC呈圆盘状结构，其扁平的表面与皮肤表面相平行；每一个LC具有五到九个不同长度的突起，其中有突起是细胞体直径的两倍，进一步应用三维图像重建功能发现树状突起之间并无直接的接触和连接存在，解决了普通显微镜成像研究中的疑点。Bauer等［3］用CLSM发现，LC和其他表皮细胞的比率是恒定不变的，它们之间的比值为1.86%，即一个LC对周围53个表皮细胞起着免疫监督作用。值得注意的是，不同取材部位，尤其是曝光部位与非曝光部位，镜下结构会有所不同。
2.2 在皮肤疾病中的应用
2.2.1 基底细胞癌（BCC）：基底细胞癌是白色人种中最多见的一种皮肤肿瘤，一项研究显示，美国每年新增基底细胞癌病例100万，且多发在高危部位，如鼻、眼、耳、嘴周围，所以早期诊断早期、早期精确地显微手术切除非常必要。Gerger等,将20位已确诊的基底细胞癌病人的新鲜组织标本及正常皮肤的样本120张，分别给予4位从未接受过CLSM的住院医生和皮肤病理学医生，同时给予他们BCC的诊断标准：肿瘤细胞核；肿瘤细胞巢；肿瘤的细胞分裂；肿瘤周围细胞呈栅栏状排列；肿瘤细胞间质会所呈现特征性的腔隙。其中肿瘤细胞核、肿瘤细胞巢作为诊断标准的敏感性和特异性更强，后三项稍弱，总的结果达到了非常高的准确性。
2.2.2 黑素细胞肿瘤：CLSM非常适合于黑素细胞性病损，因为大量的黑素具有强烈的对比。研究117例黑素细胞肿瘤，其中90例良性痣和27例恶性黑素瘤，黑素细胞的形态、结构和角质形成细胞的界限、树突样结构的分支类型及黑素细胞明亮程度的均一性被列入诊断标准，其中前三项是首先考虑的诊断要点，总的敏感性为88.15%，特异性为97.6%.对组织病理不易区分的恶性黑素瘤与Spitz痣患者进行CLSM检查可以发现恶性黑素瘤特征性图像以提高诊断率。
2.2.3 日光性角化病（AK）:是一种能够发展为鳞癌的角质形成细胞异常，利用CLSM可以观察到AK的典型特征,观察了临床诊断为AK的患者7例，成像中检测到角化过度、角质形成细胞不典型增生、真皮浅层炎症细胞浸润、血管增多增粗、光化性弹力纤维变性，其中角质形成细胞的不典型增生的敏感性（97.1%）和特异性（83.3%）较高，可作为主要的诊断指标。CLSM可作为AK早期筛查、诊断和治疗的随访观察。
2.2.4 接触性皮炎：为了评价CLSM诊断过敏性接触性皮炎的敏感性和特异性，16位参与者使用变应原和对照物进行斑贴试验并于72小时内通过CLSM成像，所成图像通过双盲法评价，参数包括角质层裂解、角化不全、颗粒层和棘层水肿及细胞脱颗粒,特异性在95.8%-100%，敏感性在51.9%-96.3%之间，其中棘层细胞水肿和细胞脱颗粒作用的敏感性和特异性最高。
2.2.5 银屑病：银屑病是一种常见的炎症性皮肤病，用CLSM观察到的银屑病的典型特征和传统的组织病理是一致的。李欢等应用CLSM研究116例银屑病患者皮肤组织学特征，观察指标阳性发现率依次为：真皮乳头毛细血管迂曲扩张达到顶部99.138%；表皮突下延94.828%；融合性角化不全91.379%；表皮棘层肥厚，真皮浅层血管周围单一核细胞浸润76.724%，中性粒细胞在表皮中的浸润（munro微脓肿或kogoj海绵状脓肿）69.828%；颗粒层减少或消失60.345%。另外，CLSM图像中可见到部分真皮乳头中血管增生，每个乳头可见2-3个或3-4个不等的增生的毛细血管官腔，呈蜂窝状或花瓣状。临床上所见到的点状出血现象，和用CLSM观察到的毛细血管的迂曲扩张是一致的，做实时动态观察，有的呈马蹄形，有的呈S形，此项指标直观，敏感性高，可作为CLSM诊断银屑病的可靠指标。
2.2.6 色素性皮肤病：李颖等做过一项关于CLSM在色素异常性疾病观察和诊断中的研究结果显示：正常皮肤中在基底层角质形成细胞可检测到“黑素帽”结构，而黑素细胞不易发现。黄褐斑临床症状的临床评分与CLSM评分具有良好的一致性；黄褐斑激光治疗随访过程中改善程度的临床评分和CLSM的评分亦高度相关。治疗后半小时基底层角质形成细胞的黑素帽结构崩解，随后黑素颗粒随表皮代谢由下而上逐渐排出；黄褐斑治疗结束，基底层树枝状黑素细胞大量出现。白癜风与无色素痣的鉴别诊断主要标准为：黑素分布的主要范围（A,Area）,黑素亮度（B,Brightness）是否＞3,皮损区与周围分界是否清晰（C,Clearance）以及黑素密度（D,Density）是否≤30%可作为白癜风与无色素痣的鉴别诊断的主要标准,其敏感性和特异性分别可达80%～92.5%和58.06%～81.7%,其中黑素密度（D,Density）是否≤30%的特异性和敏感性平衡较好;指标两两结合可显著提高鉴别诊断的特异性。用CLSM观察白癜风自体表皮移植联合光疗的疗效，结果发现：黑素细胞的树突分裂增多，黑素含量增多，黑素环亮度增强，逐渐形成正常的黑素环，甚至比正常皮肤的色素环亮度更高，这与临床观察到皮肤颜色逐渐出现直至色素沉着一致。通过CLSM对皮肤照光后一直的观察，确认了复色效果的微观变化。
2.2.7 系统性硬皮病：用CLSM观察15例系统性硬皮病患者的皮肤改变，结果与正常对照组比较，表皮退化、真皮乳头血管胶原沉积、纤维化变性，都具有特征性的诊断价值，提示了CLSM在系统性硬皮病早期诊断方面的应用前景。
2.2.8 Mohs显微皮肤外科:CLSM作为非创伤性检查可以在术前大致确定某些需要Mohs显微外科治疗的损害的边界，以确定手术范围，特别是对恶性黑素瘤、基底细胞癌及一些很难诊断的疾病，如无黑色素的黑素瘤等；且对术中切下的标本边缘进行病理分析，以确定是否切除彻底，大大缩短了手术时间，传统的冰冻切片、苏木素-伊红染色每块标本需要22到43分钟的时间，这期间患者只能在局部麻醉剂的作用下，暴露伤口等待。而CLSM大大缩短了手术时间，每块标本只需要约5分钟，这其中包括切取0.5mm厚的标本和5%乙酸洗涤，约需1分钟，1分钟固定附加套环和物镜，接下来成像系统对每个皮损成像5-10幅，约需3分钟。关于CLSM诊断皮肤肿瘤的准确性的研究也显示了非常可喜的结果，未来，CLSM可能引导所有皮肤肿瘤的显微外科手术。
2.2.9 在皮肤美容方面的应用：CLSM可以观察正常皮肤结构并进行测量，可以对皮肤颜色做定量的评估也通过CLSM观察到紫外线照射后会出现表皮及色素的改变，所以CLSM为皮肤美容中的美白产品、防晒产品、光子嫩肤等提供重要的指导作用。
3 结束语
CLSM-即皮肤CT,作为一种新型的皮肤影像学方法，实时、动态、无创成像特点使其在对皮肤临床皮损进行诊断、鉴别诊断、疗效评价、判断预后等具有非常重要的价值，且该项技术易于掌握。但是现阶段该项技术还存在不足之处：如扫描深度为350um,难以达到真皮网状层和皮下组织；CLSM诊断疾病时主观性较强，缺乏统一的诊断疾病的标准，但是，相信随着该项技术的逐步完善，皮肤CT将成为皮肤科一种很好的辅助诊断方法。
参考文献
[1] A Gerger, M Horn, S Koller,et al. Confocal Examination of Untreated Fresh Specimens From Basal Cell Carcinoma:implications for microscopically guide surgery[J]. Arch Dermatol.2005,141:1269-1274
[2] YuRc et al.Br J Dermatol,1994 Dec;131（6）:843
[3] Jurgen Bauer et al.A Strikingly Constant Ratio Exists Between Langerhans Cells and Other Epidermal Cells in Human Skin[J].Journal of Investigative Dermatology,2001,116:313-318
【关键词】共聚焦激光扫描显微镜；皮肤CT；皮肤疾病；皮肤美容；皮肤显微外科
【中图分类号】R75【文献标识码】A【文章编号】1008-6455（2011）04-0531-02
1 共聚焦激光扫描显微镜的结构及工作原理
共聚焦激光扫描显微镜（confcallaserscanningmicroscope,CLSM），在结构配置上，除了普通光学显微镜的基本结构外，还具有激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统（包括数据采集、处理、转换、应用软件）、图像输出设备、光学装置和共聚焦等部分。CLSM以激光作为点光源，通过物镜聚焦于组织内，组织内焦点处反射或反向散射回来的光由同一物镜接收，再由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像，只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品一个新的层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像，随着Z轴不断移动，就可得到样品样品不同横切面连续的光切图像,扫描后可得到信噪比极高的光学断层图像，分辨率比普通显微镜提高1.4倍。
2 激光扫描共聚焦显微镜在皮肤科的应用
2.1 对正常皮肤的观察：共聚焦激光扫描显微镜所成图像为水平切面图，由于不同组织对激光的反射和反向散射系数不同，因而所显示的黑白深浅也不同，类似X光片的灰度图像，其中黑色素和角蛋白的反射系数较高，成像为较亮的区域，反射系数较小的组织成分，如胞核和胶原较暗。CLSM的空间分辨率［1］为横向0.5-1.0um,轴向为3-5um,可清晰显示细胞结构。我们知道，表皮的主要细胞为树突状细胞（DC）和角质形成细胞（KC），近年关于DC的形态学研究，［2］主要集中在朗格汉斯细胞（LC）,通过应用LSCM对表皮LC进行荧光成像发现：正常表皮LC呈圆盘状结构，其扁平的表面与皮肤表面相平行；每一个LC具有五到九个不同长度的突起，其中有突起是细胞体直径的两倍，进一步应用三维图像重建功能发现树状突起之间并无直接的接触和连接存在，解决了普通显微镜成像研究中的疑点。Bauer等［3］用CLSM发现，LC和其他表皮细胞的比率是恒定不变的，它们之间的比值为1.86%，即一个LC对周围53个表皮细胞起着免疫监督作用。值得注意的是，不同取材部位，尤其是曝光部位与非曝光部位，镜下结构会有所不同。
2.2 在皮肤疾病中的应用
2.2.1 基底细胞癌（BCC）：基底细胞癌是白色人种中最多见的一种皮肤肿瘤，一项研究显示，美国每年新增基底细胞癌病例100万，且多发在高危部位，如鼻、眼、耳、嘴周围，所以早期诊断早期、早期精确地显微手术切除非常必要。Gerger等,将20位已确诊的基底细胞癌病人的新鲜组织标本及正常皮肤的样本120张，分别给予4位从未接受过CLSM的住院医生和皮肤病理学医生，同时给予他们BCC的诊断标准：肿瘤细胞核；肿瘤细胞巢；肿瘤的细胞分裂；肿瘤周围细胞呈栅栏状排列；肿瘤细胞间质会所呈现特征性的腔隙。其中肿瘤细胞核、肿瘤细胞巢作为诊断标准的敏感性和特异性更强，后三项稍弱，总的结果达到了非常高的准确性。
2.2.2 黑素细胞肿瘤：CLSM非常适合于黑素细胞性病损，因为大量的黑素具有强烈的对比。研究117例黑素细胞肿瘤，其中90例良性痣和27例恶性黑素瘤，黑素细胞的形态、结构和角质形成细胞的界限、树突样结构的分支类型及黑素细胞明亮程度的均一性被列入诊断标准，其中前三项是首先考虑的诊断要点，总的敏感性为88.15%，特异性为97.6%.对组织病理不易区分的恶性黑素瘤与Spitz痣患者进行CLSM检查可以发现恶性黑素瘤特征性图像以提高诊断率。
2.2.3 日光性角化病（AK）:是一种能够发展为鳞癌的角质形成细胞异常，利用CLSM可以观察到AK的典型特征,观察了临床诊断为AK的患者7例，成像中检测到角化过度、角质形成细胞不典型增生、真皮浅层炎症细胞浸润、血管增多增粗、光化性弹力纤维变性，其中角质形成细胞的不典型增生的敏感性（97.1%）和特异性（83.3%）较高，可作为主要的诊断指标。CLSM可作为AK早期筛查、诊断和治疗的随访观察。
2.2.4 接触性皮炎：为了评价CLSM诊断过敏性接触性皮炎的敏感性和特异性，16位参与者使用变应原和对照物进行斑贴试验并于72小时内通过CLSM成像，所成图像通过双盲法评价，参数包括角质层裂解、角化不全、颗粒层和棘层水肿及细胞脱颗粒,特异性在95.8%-100%，敏感性在51.9%-96.3%之间，其中棘层细胞水肿和细胞脱颗粒作用的敏感性和特异性最高。
2.2.5 银屑病：银屑病是一种常见的炎症性皮肤病，用CLSM观察到的银屑病的典型特征和传统的组织病理是一致的。李欢等应用CLSM研究116例银屑病患者皮肤组织学特征，观察指标阳性发现率依次为：真皮乳头毛细血管迂曲扩张达到顶部99.138%；表皮突下延94.828%；融合性角化不全91.379%；表皮棘层肥厚，真皮浅层血管周围单一核细胞浸润76.724%，中性粒细胞在表皮中的浸润（munro微脓肿或kogoj海绵状脓肿）69.828%；颗粒层减少或消失60.345%。另外，CLSM图像中可见到部分真皮乳头中血管增生，每个乳头可见2-3个或3-4个不等的增生的毛细血管官腔，呈蜂窝状或花瓣状。临床上所见到的点状出血现象，和用CLSM观察到的毛细血管的迂曲扩张是一致的，做实时动态观察，有的呈马蹄形，有的呈S形，此项指标直观，敏感性高，可作为CLSM诊断银屑病的可靠指标。
2.2.6 色素性皮肤病：李颖等做过一项关于CLSM在色素异常性疾病观察和诊断中的研究结果显示：正常皮肤中在基底层角质形成细胞可检测到“黑素帽”结构，而黑素细胞不易发现。黄褐斑临床症状的临床评分与CLSM评分具有良好的一致性；黄褐斑激光治疗随访过程中改善程度的临床评分和CLSM的评分亦高度相关。治疗后半小时基底层角质形成细胞的黑素帽结构崩解，随后黑素颗粒随表皮代谢由下而上逐渐排出；黄褐斑治疗结束，基底层树枝状黑素细胞大量出现。白癜风与无色素痣的鉴别诊断主要标准为：黑素分布的主要范围（A,Area）,黑素亮度（B,Brightness）是否＞3,皮损区与周围分界是否清晰（C,Clearance）以及黑素密度（D,Density）是否≤30%可作为白癜风与无色素痣的鉴别诊断的主要标准,其敏感性和特异性分别可达80%～92.5%和58.06%～81.7%,其中黑素密度（D,Density）是否≤30%的特异性和敏感性平衡较好;指标两两结合可显著提高鉴别诊断的特异性。用CLSM观察白癜风自体表皮移植联合光疗的疗效，结果发现：黑素细胞的树突分裂增多，黑素含量增多，黑素环亮度增强，逐渐形成正常的黑素环，甚至比正常皮肤的色素环亮度更高，这与临床观察到皮肤颜色逐渐出现直至色素沉着一致。通过CLSM对皮肤照光后一直的观察，确认了复色效果的微观变化。
2.2.7 系统性硬皮病：用CLSM观察15例系统性硬皮病患者的皮肤改变，结果与正常对照组比较，表皮退化、真皮乳头血管胶原沉积、纤维化变性，都具有特征性的诊断价值，提示了CLSM在系统性硬皮病早期诊断方面的应用前景。
2.2.8 Mohs显微皮肤外科:CLSM作为非创伤性检查可以在术前大致确定某些需要Mohs显微外科治疗的损害的边界，以确定手术范围，特别是对恶性黑素瘤、基底细胞癌及一些很难诊断的疾病，如无黑色素的黑素瘤等；且对术中切下的标本边缘进行病理分析，以确定是否切除彻底，大大缩短了手术时间，传统的冰冻切片、苏木素-伊红染色每块标本需要22到43分钟的时间，这期间患者只能在局部麻醉剂的作用下，暴露伤口等待。而CLSM大大缩短了手术时间，每块标本只需要约5分钟，这其中包括切取0.5mm厚的标本和5%乙酸洗涤，约需1分钟，1分钟固定附加套环和物镜，接下来成像系统对每个皮损成像5-10幅，约需3分钟。关于CLSM诊断皮肤肿瘤的准确性的研究也显示了非常可喜的结果，未来，CLSM可能引导所有皮肤肿瘤的显微外科手术。
2.2.9 在皮肤美容方面的应用：CLSM可以观察正常皮肤结构并进行测量，可以对皮肤颜色做定量的评估也通过CLSM观察到紫外线照射后会出现表皮及色素的改变，所以CLSM为皮肤美容中的美白产品、防晒产品、光子嫩肤等提供重要的指导作用。
3 结束语
CLSM-即皮肤CT,作为一种新型的皮肤影像学方法，实时、动态、无创成像特点使其在对皮肤临床皮损进行诊断、鉴别诊断、疗效评价、判断预后等具有非常重要的价值，且该项技术易于掌握。但是现阶段该项技术还存在不足之处：如扫描深度为350um,难以达到真皮网状层和皮下组织；CLSM诊断疾病时主观性较强，缺乏统一的诊断疾病的标准，但是，相信随着该项技术的逐步完善，皮肤CT将成为皮肤科一种很好的辅助诊断方法。
参考文献
[1] A Gerger, M Horn, S Koller,et al. Confocal Examination of Untreated Fresh Specimens From Basal Cell Carcinoma:implications for microscopically guide surgery[J]. Arch Dermatol.2005,141:1269-1274
[2] YuRc et al.Br J Dermatol,1994 Dec;131（6）:843
[3] Jurgen Bauer et al.A Strikingly Constant Ratio Exists Between Langerhans Cells and Other Epidermal Cells in Human Skin[J].Journal of Investigative Dermatology,2001,116:313-318